克隆載體與表達(dá)載體

1、克隆載體基本性質(zhì)基本特征（或載體的構(gòu)建）原理機(jī)制常用的載體克隆載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制；不相容性；可轉(zhuǎn)移性（基因工程中采用非接合性質(zhì)粒）（1）具有合適的復(fù)制起始位點(diǎn)（ORI）（2）具有合適的選擇性標(biāo)記基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長(zhǎng)。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。（抗菌素選擇原理）pSC101ColE1pBR322pUC18pUC19TA載體噬菌體載體噬菌體其DNA兩端的5末端各帶有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，即cos位點(diǎn)。有可

2、替代區(qū)，即非必需區(qū)。用外源DNA片段替代這個(gè)區(qū)域，不會(huì)影響噬菌體顆粒的形成。(1)基因組大??；去除非必需區(qū)，建立外源DNA片段的克隆或替換位點(diǎn)（2）在DNA的非必需區(qū)插入選擇標(biāo)記：lacZ 基因；基因 c 失活（cI基因：溶源過(guò)程控制基因）；Spi 篩選（野生型 噬菌體在帶有 P2 原噬菌體的溶源性 E.coli 中 的生長(zhǎng)會(huì)受到限制的表型，稱作 Spi+ ，即對(duì) P2 噬菌體的干擾敏感）1) 通過(guò)裂解過(guò)程增殖載體2)載體與外源DNA的酶切3) 外源DNA與載體的連接4)重組噬菌體的體外包裝5) 包裝噬菌體顆粒的感染6)篩選（噬菌體載體的克隆原理）插入式載體置換型載體（取代型載體）M13噬菌體

3、載體M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA。噬菌體顆粒的大小受其DNA端點(diǎn)制約的，不存在包裝限制。只感染雄性大腸桿菌基因間隔區(qū)（intergenic region, IG區(qū)） 基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)，內(nèi)含有復(fù)制起始位點(diǎn)，是實(shí)施改造、構(gòu)建人工載體的重點(diǎn)區(qū)域。 IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè) Bsu I 切點(diǎn)。（2）加入酶切位點(diǎn)，在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn)。M13mp1 在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ（a-肽序列)。使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外，M13重組分子篩選簡(jiǎn)便，被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑

4、的混濁度亦越大 但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補(bǔ)（）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞約200個(gè)拷貝。3、單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在（+）鏈上，從而阻斷了其互補(bǔ)鏈，即（）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會(huì)不斷的合成（+）鏈DNA 4、游離出來(lái)的（+）鏈DNA先與基因V的編碼產(chǎn)物形成特異的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時(shí)基因V的蛋白質(zhì)從（+）DNA鏈上脫落下來(lái)，余下的M13（+）鏈DNA則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過(guò)程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。 （M1

5、3噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機(jī)制）M13mpn n代表系列數(shù)字 對(duì)M13mp1的改進(jìn)加上常用的酶切位點(diǎn)。 M13mp2：LacZ 5端的第13個(gè)核苷酸G突變成A，產(chǎn)生了一個(gè)EcoR I切點(diǎn)噬菌體-質(zhì)粒雜合載體黏粒載體考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的的特殊類型載體。能像l -DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞；能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制具有較高容量的克隆能力：45kb；具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力粘粒（cosmid）是帶有 cos 序列的質(zhì)粒。 cos 序列是 l 噬菌體 DNA 中將 DNA 包裝到噬菌體顆粒中所需的 DNA 序列。黏粒的組成包

6、括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colE1），抗性標(biāo)記（ampr）， cos 位點(diǎn)，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖?？寺〉淖畲?DNA 片段可達(dá) 45kb 。有的粘粒載體含有兩個(gè) cos 位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長(zhǎng)46kb。其上的cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)粒可象噬菌體一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。噬菌粒載體能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

7、 裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb通過(guò)克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易 噬菌粒載體綜合了質(zhì)粒載體和M13噬菌體載體優(yōu)點(diǎn)，含有ColEl復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性選擇標(biāo)記和絲狀體噬菌體DNA間隔區(qū)(含有噬菌體DNA復(fù)制起始、終止以及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必需的全部順式作用元件)它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體1. 具有較小分子量基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作；2. 編碼一個(gè)

8、ampr基因作為選擇記號(hào)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；3. 拷貝數(shù)含量高4. 存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此多種不同類型的外源DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；5.多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌lacZ基因的5-端編碼區(qū)，可按照IPTG顯色反應(yīng)試驗(yàn)篩選6. lacZ基因是置于lac啟動(dòng)子的控制之下，插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；7含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，可復(fù)制形成大量的雙鏈DNA分子8. 帶有一個(gè)M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；9.；在pUC118和pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相

9、反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNApUC118和pUC119人工染色體染色體具有復(fù)制功能，利用染色體的復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體稱為人工染色體載體其裝載外源DNA的容量比質(zhì)粒、噬菌體和噬菌體-質(zhì)粒雜合載體等有很大的拓展，甚至可以跟染色體的大小相媲美。 人工染色體載體拷貝數(shù)少，制備困難，通常采取“穿梭載體”的策略來(lái)解決含有質(zhì)粒載體所必備的第一受體(大腸桿菌)質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)，這樣的載體在大腸桿菌內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制， 含有第二受體(如酵母)端粒(TEL)、DNA復(fù)制起始位點(diǎn)(ARS)和著絲粒(CEN)以及合適的選擇標(biāo)記。載體在

10、體外與目的DNA重組后轉(zhuǎn)化到第二受體細(xì)胞，按照染色體復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。 篩選第一受體的克隆子一般采用抗生素抗性選擇標(biāo)記；篩選第二受體的克隆子常用與受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。酵母人工染色體載體YAC細(xì)菌人工染色體載體 BACP1噬菌體人工染色體載體PAC質(zhì)粒載體總結(jié)質(zhì)粒載體類型長(zhǎng)度選擇標(biāo)記克隆位點(diǎn)pSC101天然質(zhì)粒，屬嚴(yán)緊型、低拷貝型9.09 kb四環(huán)素抗性Tetr7個(gè)克隆位點(diǎn)： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColE1天然質(zhì)粒，屬松弛型多拷貝型6.3 kb大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因

11、（immE1）EcoR I位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）pBR322元件來(lái)源 復(fù)制起點(diǎn) orip MB1系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因 pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。4363bp氨芐青霉素和四環(huán)素抗性24個(gè)克隆位點(diǎn)。其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。 pUC系列（i）來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；（ii）氨芐青霉素

12、抗性基因（ampr），但它不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶的單識(shí)別位點(diǎn)；（iii）大腸桿菌-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因；（iv）位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能2.7kbAmpicillin 抗性和 lacZ的 肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ基因的5端。TA載體耐熱聚合酶可在PCR產(chǎn)物的3端加上一個(gè)非配對(duì)的脫氧腺嘌呤核苷(A)。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出線性TA質(zhì)粒載體，其5端各帶有一個(gè)不配對(duì)的脫氧胸腺嘧啶(T)，用該載體可進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接克隆。TA載體構(gòu)

13、建：在一般質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建。方法1：先采用限制性內(nèi)切核酸酶酶切使質(zhì)粒載體線性化，再通過(guò)K1enow片段將酶切的線性載體末端補(bǔ)平方法2：利用產(chǎn)生平末端的限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生平末端，最后將線性化鈍末端質(zhì)粒載體加T反應(yīng)形成。目前有很多公司推出了TA質(zhì)粒載體。噬菌體載體噬菌體載體分類插入式載體一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來(lái)說(shuō)，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。 cI基因插入失活：如 gt10、NM1149等載體，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致

14、噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 Lac Z基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（藍(lán)白篩選）置換型載體（取代型載體）具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這 兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源DNA 片段所取代。野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段這些載體是用Lac 5 替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac 5 作為選擇標(biāo)記使用時(shí)用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.c

15、oli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。置換型噬菌體是使用最廣泛的載體。人工染色體類別元件優(yōu)點(diǎn)酵母人工染色體載體YAC是最常用來(lái)克隆很大DNA片段（2Mb）的系統(tǒng)。為構(gòu)建YAC需要結(jié)合四個(gè)短序列：即二個(gè)端粒、一個(gè)著絲粒和一個(gè)ARS元件，并將一適當(dāng)大小的外源DNA連接成一線性DNA分子，而端粒序列位于正確的末端。 YAC的構(gòu)建有比在細(xì)菌中克隆的一些優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槟承┱婧思?xì)胞的序列，特別是重復(fù)序列是難以甚至不可能在細(xì)菌中繁殖的，酵母細(xì)胞卻具有這樣的能力細(xì)菌人工染色體載體 BAC是基于大腸桿菌的 F 質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體每個(gè)環(huán)狀 DNA 分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)來(lái)源于大腸桿菌

16、 F 因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一個(gè)易于 DNA 復(fù)制的由 ATP 驅(qū)動(dòng)的解旋酶（ （RepE） 以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ）以大腸桿菌為寄主，轉(zhuǎn)化率高，構(gòu)建BAC文庫(kù)比YAC文庫(kù)更容易；BAC載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在，從大腸桿菌中提取質(zhì)粒較方便，而從酵母中分離DNA較困難； BAC的復(fù)制子來(lái)源于F因子，可穩(wěn)定遺傳，嵌合及重組現(xiàn)象少；可以通過(guò)菌落原位雜交來(lái)篩選目的基因，方便快捷；BAC載體在克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有T7和Sp6聚合酶啟動(dòng)子，可以用于轉(zhuǎn)錄獲得RNA

17、探針或直接用于插入片段的末端測(cè)序。表達(dá)載體分類結(jié)構(gòu)組成及表達(dá)元件特點(diǎn)或優(yōu)點(diǎn)備注質(zhì)粒表達(dá)載體原核表達(dá)載體1啟動(dòng)子、2轉(zhuǎn)錄終止子（防止克隆的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定性）3核糖體結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)方式有：組成型表達(dá)，誘導(dǎo)型表達(dá)。 融合型表達(dá)， 分泌型表達(dá)。啟動(dòng)子類型：根據(jù)作用方式及功能分類組成型啟動(dòng)子組織特異啟動(dòng)子又稱器官特異性啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子酵母表達(dá)載體來(lái)自pBR322基本骨架 含有該質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。含有URA3、HIS3、LEU2、TRPl、LYS2與特定的宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體互補(bǔ)篩選或利用zeocin、basticidin（殺稻瘟菌素）

18、的抗性基因篩選。啟動(dòng)子有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等。 GAP是組成型啟動(dòng)子。其余是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。酵母表達(dá)載體多為穿梭載體：既可以在大腸桿菌中繁殖，獲得足夠的載體DNA進(jìn)行體外操作，又可以在酵母中復(fù)制、表達(dá)和選擇。融合蛋白表達(dá)載體：于外源基因插入位點(diǎn)的C端或N端插入了1個(gè)6×His標(biāo)簽，或在5端插入了-因子作為分泌信號(hào)由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等翻譯后修飾反應(yīng)機(jī)制的差異，真核基因的原核表達(dá)難以獲得有活性的蛋白。酵母成為真核表達(dá)的首選系統(tǒng)。Ti質(zhì)粒表達(dá)載體一元載體 一元載體就是含目的基因的中間表達(dá)載體與改造后的受體(Ti質(zhì)粒)通過(guò)同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，

19、也稱為共整合載體。由于該載體的T-DNA區(qū)與Vir區(qū)緊密連鎖，也稱為順式載體(cis-vector)Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的可引發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤的質(zhì)粒。根據(jù)冠癭瘤合成的冠癭堿種類，Ti質(zhì)?？煞譃檎卖~堿、農(nóng)桿堿、農(nóng)桿菌素和琥珀堿4種不同類型Ti質(zhì)?？煞譃門-DNA、Vir、Con和Ori 4個(gè)功能區(qū)。T-DNA區(qū) 是Ti質(zhì)粒中能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)的區(qū)域。Vir區(qū) 位于T-DNA區(qū)的上游，其表達(dá)產(chǎn)物可激活T-DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這一個(gè)區(qū)域也稱為致病區(qū)。Con區(qū) 該區(qū)含有與農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因(tra)，這些基因受宿主細(xì)胞合成的冠癭堿激活，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移。Ori區(qū) 調(diào)控Ti質(zhì)

20、粒的自我復(fù)制，為復(fù)制起始區(qū)構(gòu)建的基本原理： 引入分子質(zhì)量較小的中間載體，將欲轉(zhuǎn)化的目的基因及抗性標(biāo)記基因構(gòu)建到中間載體上。 將Ti質(zhì)粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，僅保留其兩邊界及與T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的25個(gè)堿基序列，構(gòu)建成所謂卸甲載體。在卸甲載體的T-DNA區(qū)被刪除致瘤基因位點(diǎn)插入中間載體同源的質(zhì)粒序列，將中間載體轉(zhuǎn)入含有卸甲載體的根癌農(nóng)桿菌中，構(gòu)建在中間載體上目的基因可通過(guò)同源重組整合到卸甲載體Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，并與卸甲載體Ti質(zhì)粒一起復(fù)制。二元載體 雙元表達(dá)載體系統(tǒng)主要包括兩個(gè)部分：一部分為卸甲Ti質(zhì)粒，這類Ti質(zhì)粒由于缺失了TDNA 區(qū)域，完全喪失了致瘤作用，主要是提供Vir

21、基因功能，激活處于反式位置上的TDNA的轉(zhuǎn)移。另一部份是微型Ti質(zhì)粒，它在TDNA左右邊界序列之間提供植株選擇標(biāo)記如NPTII基因以及Lac Z基因等。 雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建的原理是Ti質(zhì)粒上的Vir基因可以反式激活TDNA 的轉(zhuǎn)移。 與共整合載體所不同的是，它不依賴兩個(gè)質(zhì)粒之間的同源序列，不需要共整合過(guò)程就能在農(nóng)桿菌內(nèi)獨(dú)立復(fù)制雙元表達(dá)載體構(gòu)件方便，轉(zhuǎn)化效率高于一元載體。病毒表達(dá)載體桿狀病毒表達(dá)載體桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的基本元件： (1)啟動(dòng)子：多個(gè)啟動(dòng)子同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因。(2)poly A加尾信號(hào)： (3)同源重組序列。 (4)穿梭載體必需元件。除帶有病毒自身的復(fù)制起始位點(diǎn)外，還帶有pUC質(zhì)粒

22、的復(fù)制子及以ampr，可以在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。(5)篩選標(biāo)記。重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能：接近天然蛋白。能進(jìn)行翻譯后的加工修飾：研究糖基化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能影響方面的理想模型。表達(dá)水平高：最高可使目的蛋白的量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50。能容納大分子的插入片段：上限未知。能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因：在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。能表達(dá)基因組DNA：昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有剪切的功能。對(duì)重組蛋白進(jìn)行定位的功能：如將核蛋白轉(zhuǎn)送到細(xì)胞核上，膜蛋白則定位在膜上，分泌蛋白則可分泌到細(xì)胞外等。桿狀病毒科病毒，桿狀病毒顆粒，雙鏈閉合環(huán)狀DNA病毒，專一性感染無(wú)脊椎動(dòng)物將外源基因先克隆到轉(zhuǎn)移載體上，再與病毒基因組共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞

23、，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的同源重組獲得帶有外源基因的重組病毒的策略。 腺病毒載體腺病毒DNA末端結(jié)構(gòu)突出特點(diǎn) 1）帶有100bp反向的末端重復(fù)序列(ITR)，而且在每一條單鏈的5-末端還共價(jià)地連接著末端結(jié)合蛋白，對(duì)病毒的復(fù)制有重要作用。2）當(dāng)它從病毒顆粒中分離出來(lái)之時(shí)，便會(huì)自發(fā)地環(huán)化起來(lái)，爾后許多環(huán)形分子又聚合成多聚體腺病毒載體是目前最為廣泛應(yīng)用的基因載體，也是唯一基因藥物的載體雙鏈DNA的分子大小約為36kb.可應(yīng)用于1.基因治療2.表達(dá)真核基因3.研制疫苗首先構(gòu)建一個(gè)含多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)志的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有病毒基因組某段早期序列；然后將一個(gè)含有啟動(dòng)子一外源基因-poly A的表達(dá)盒插入到上述質(zhì)粒中

24、腺病毒E1、E3或E4至右側(cè)的ITR區(qū)之間，構(gòu)建成載有外源基因的穿梭質(zhì)粒。反轉(zhuǎn)錄病毒載體泡沫病毒類從5端開始依次是：5長(zhǎng)末端重復(fù)序列(5-LTR)，帶有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列；psi序列，又稱序列，是病毒包裝所必須的信號(hào)序列；gag，編碼病毒衣殼蛋白；pol，編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶(Int)；env，編碼病毒顆粒外層包裝蛋白；3長(zhǎng)末端重復(fù)序列(3-LTR)，帶有poly A加尾信號(hào)序列。一類含單鏈RNA的動(dòng)物病毒。它的基因組含有2條相同的正鏈RNA分子，包裝成二倍體病毒顆粒。（1）在大多數(shù)情況下，反轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因(onc)都能夠在正常的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。 2）反轉(zhuǎn)錄病毒的寄主范圍相當(dāng)廣，包括無(wú)脊椎動(dòng)物

25、和脊椎動(dòng)物。3）反轉(zhuǎn)錄病毒具有強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因可得到有效表達(dá)。4）反轉(zhuǎn)錄病毒不但感染效率高，而且不招致寄主細(xì)胞的死亡載體的構(gòu)建:分離原病毒DNA刪去部分序列組入選擇性標(biāo)記基因、目的基因和調(diào)控元件克隆到含有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)的克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體 輔助細(xì)胞系(包裝細(xì)胞系) 擴(kuò)增慢病毒類致癌病毒類SV40病毒型轉(zhuǎn)化載體根據(jù)SV40 DNA進(jìn)入敏感動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)方向，分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)包括與病毒感染相關(guān)的t抗原基因(small T-antigen)和T抗原基因(large T-antigen)等；含有BamHI等限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)；晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)包括與病毒殼蛋白合成相關(guān)的基因，含有EcoRi等限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子。有許多種動(dòng)物病毒，在其感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達(dá)到相當(dāng)高的水平。有些動(dòng)物病毒具有控制自己復(fù)制的順式元件和反式作用因子。有些動(dòng)物病毒，在它們的復(fù)制過(guò)程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識(shí)別細(xì)胞接受器。用病毒外殼蛋白質(zhì)包裝重組質(zhì)粒DNA形成的假病毒顆粒