透射電鏡樣品制備方法

1、透射電鏡樣品制備方法由于電子束穿透能力限制， 必須把標(biāo)本切成厚度小于 0.1um 以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。在透射電鏡的樣品制備方法中， 超薄切片技術(shù)是最根本、 最常用 的制備技術(shù)。 超薄切片的制作過程根本上和石蠟切片相似， 需要經(jīng)過 取材、固定、脫水、滲透、包埋聚合、切片及染色等步驟。 一 取材的根本要求組織從生物活體取下后，如果不立即進(jìn)行適當(dāng)處理，會由于 細(xì)胞內(nèi)部的各種酶作用，出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象。此外還可能由于污 染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)遭受破壞，因此，為 了細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持天然狀態(tài)，必須做到快、小、準(zhǔn)、冷。1動作迅速，組織從

2、活體取下后應(yīng)在最短的時(shí)間內(nèi)爭取1分鐘內(nèi)投入 2.5%戊二醛固定液。2所取組織的體積要小，一般不超過 1mm*1mm*1mm 。也可將組織修成 1mm*1mm*2mm 大小長條形。因?yàn)楣潭▌┑臐B 透能力較弱，組織塊如果太大， 塊的內(nèi)部將不能得到良好的 固定。3機(jī)械損傷要小，解剖器械應(yīng)鋒利，操作宜輕，防止?fàn)坷?、挫傷與擠壓。4操作最好在低溫OC4C下進(jìn)行，以降低酶的活性，防止細(xì)胞自溶。5取材部位要準(zhǔn)確。取材方法將取出的組織放在潔凈的蠟版上，滴一滴預(yù)冷的固定液，用 新的、鋒利的刀片將組織切下并修小，然后用牙簽或者鑷子將組 織塊移至盛有冷的固定液的1.5ml離心管中。如果組織塊帶有較多 的血液和組織液，

3、應(yīng)先用PBS洗幾遍，然后切成小塊固定。1. 動物及人體組織的取材在冰浴上進(jìn)行動物組織的取材，應(yīng)麻醉1%戊巴比銨5ml/kg體重腹腔 注射或斷頭急性處死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一 小塊組織，放在干凈的紙板上，滴一滴冷卻的固定液，用新的、 無油污的鋒利雙面刀片將材料切成大約 1mm寬，23mm長的 小塊并從中選出受損傷較小的小條，再將其切成1mm3的小塊， 最后用牙簽將這些小塊逐一放入盛有預(yù)冷的、新鮮固定液的1.5ml管內(nèi)，放入冰箱冷藏室低溫固定04C 2-4小時(shí)或以 上。*固定結(jié)束后，將固定液用 PBS稀釋三倍，樣品于該溶液 中在4 C冰箱保存。送樣前請用 PBS浸泡清洗3次，貼好標(biāo)簽

4、送至電鏡室。2. 體外培養(yǎng)細(xì)胞的取材在冰浴上進(jìn)行培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞取材時(shí)，先倒出局部培養(yǎng)液，然后 用刮刀輕輕刮下瓶壁上的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中， 離心機(jī)4C低速離心2000轉(zhuǎn)/分10分鐘，使細(xì)胞聚成團(tuán)塊， 棄去上清，沿壁小心參加新鮮的固定液，保持細(xì)胞成團(tuán)狀態(tài)， 于4C冰箱中固定2小時(shí)以上。*固定結(jié)束后，將固定液用 PBS稀釋三倍，樣品于該溶液 中在4 C冰箱保存。送樣前請用 PBS浸泡清洗3次，貼好標(biāo)簽 送至電鏡室。對于血液及其他細(xì)胞懸浮液，不宜直接固定，可在取材后將其放入離心管，以2000-4000轉(zhuǎn)/分的速度離心10-15分鐘， 待樣品在離心管底部集結(jié)成團(tuán)塊狀后，用吸管吸出上清液

5、，再 緩緩滴入固定液稍加固定，然后用刮鏟將樣品取出并切割成小 塊，再行固定。3. 植物組織取材植物組織的取材比擬容易，它的細(xì)胞離體后變化不像動物 細(xì)胞那么迅速，但植物細(xì)胞的細(xì)胞壁阻礙著固定液的迅速滲 透，因此，植物材料的取材宜切成薄片狀或牙簽狀，經(jīng)適當(dāng)?shù)?固定后再切成小方塊。*固定結(jié)束后，將固定液用 PBS稀釋三倍，樣品于該溶液 中在4 C冰箱保存。送樣前請用 PBS浸泡清洗3次，貼好標(biāo)簽 送至電鏡室。4. 細(xì)菌及藻類等樣品取材對于不易成團(tuán)的樣品，需先清洗，參加固定液后吹散，于4C冰箱中固定2小時(shí)，固定結(jié)束后，PBS清洗3次，繼續(xù)按 照文獻(xiàn)?瓊脂鑄模法制備透射電鏡樣品?白煥紅內(nèi)描述方 法進(jìn)行瓊

6、脂預(yù)固定。再將瓊脂預(yù)包埋后的樣品于 4 C冰箱中固 定過夜。*固定結(jié)束后，將固定液用PBS稀釋三倍，樣品于該溶液 中在4 C冰箱保存。送樣前請用 PBS浸泡清洗3次，貼好標(biāo)簽 送至電鏡室。緩沖液配方磷酸鹽緩沖液三個(gè)步驟1.磷酸鹽緩沖液0.2M甲液：0.2M的磷酸氫二鈉溶液乙液：0.2M的磷酸二氫鈉溶液Na2HPO42H2O35.61gNaH2PO4H2O27.60g(Na2HPO47H2O)53.65g(NaH2PO42H2O)31.21g(Na2HPO4l2H2O)71.64g加蒸餾水溶解成1000ml加蒸餾水溶解成1000ml2.按下表混合甲、乙兩液既得所需 pH的0.2M緩沖液0.2M磷酸鹽緩沖液的配制pH6.46.66.87.07.27.47.67.88.0甲液ml26.53