生物藥物安全性評價

1、生物藥物安全性評價第一節(jié) 生物類藥物概述一、生物類藥物的概念和種類p 生物類藥物（biopharmaceutics或biopharmaceuticals）是利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運用生物學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的原理與方法制得的天然生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物。p 生物藥物主要包括生化藥物（biochemical drugs）生物技術(shù)藥物（bio-technology drugs)、和生物制品（biological products)等。1、生化藥物：一般是系指從動物、植物及微生物提取的，亦可用生物-化學(xué)半合成，或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)，如氨基酸、多肽、

2、蛋白質(zhì)、酶、輔酶、多糖、核苷酸、脂和生物胺等，以及其衍生物、降解物及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等。2、生物技術(shù)藥物：是指生物來源的和使用生物工程技術(shù)制造的藥物，包括多肽、蛋白質(zhì)及其衍生物或由其組成的產(chǎn)品，如細胞因子、生長因子、單克隆抗體、重組DNA 蛋白疫苗及人組織提取的內(nèi)源性蛋白等。3、生物制品：是根據(jù)免疫學(xué)原理，用微生物（細菌、病毒、立克次氏體以及微生物的毒素等）、動物的血液、組織制成的，用以預(yù)防、治療以及診斷人或動物傳染病的一類藥品。包括： 治療用生物制品：抗體、DNA重組技術(shù)制品等。 預(yù)防用生物制品：疫苗。（一）治療用生物制品 1.未在國內(nèi)外上市銷售的生物制品。2.單克隆抗體。3.基因治療、體

3、細胞治療及其制品。4.變態(tài)反應(yīng)原制品。5.由人的、動物的組織或者體液提取的，或者通過發(fā)酵制備的具有生物活性的多組份制品。6.由已上市銷售生物制品組成新的復(fù)方制品。7.已在國外上市銷售但尚未在國內(nèi)上市銷售的生物制品。8.含未經(jīng)批準(zhǔn)菌種制備的微生態(tài)制品。9.與已上市銷售制品結(jié)構(gòu)不完全相同且國內(nèi)外均未上市銷售的制品（包括氨基酸位點突變、缺失，因表達系統(tǒng)不同而產(chǎn)生、消除或者改變翻譯后修飾，對產(chǎn)物進行化學(xué)修飾等）。10.與已上市銷售制品制備方法不同的制品（例如采用不同表達體系、宿主細胞等）。11.首次采用DNA重組技術(shù)制備的制品（例如以重組技術(shù)替代合成技術(shù)、生物組織提取或者發(fā)酵技術(shù)等）。12.國內(nèi)外尚未

4、上市銷售的由非注射途徑改為注射途徑給藥，或者由局部用藥改為全身給藥的制品。13.改變已上市銷售制品的劑型但不改變給藥途徑的生物制品。14.改變給藥途徑的生物制品（不包括上述12項）。15.已有國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的生物制品。（二）預(yù)防用生物制品 1、未在國內(nèi)外上市銷售的疫苗。2、DNA疫苗。3、已上市銷售疫苗變更新的佐劑，偶合疫苗變更新的載體。4、由非純化或全細胞（細菌、病毒等）疫苗改為純化或組份疫苗。5、采用未經(jīng)國內(nèi)批準(zhǔn)的菌毒種生產(chǎn)的疫苗（流感疫苗、鉤端螺旋體疫苗等除外）。6、已在國外上市銷售但未在國內(nèi)上市銷售的疫苗。7、采用國內(nèi)已上市銷售的疫苗制備的結(jié)合疫苗或者聯(lián)合疫苗。8、與已上市銷售疫苗保護性

5、抗原譜不同的重組疫苗。9、更換其他已批準(zhǔn)表達體系或者已批準(zhǔn)細胞基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗；采用新工藝制備并且實驗室研究資料證明產(chǎn)品安全性和有效性明顯提高的疫苗。10、改變滅活劑（方法）或者脫毒劑（方法）的疫苗。11、改變給藥途徑的疫苗。12、改變國內(nèi)已上市銷售疫苗的劑型，但不改變給藥途徑的疫苗。13、改變免疫劑量或者免疫程序的疫苗。14、擴大使用人群（增加年齡組）的疫苗。15、已有國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的疫苗。二、生物醫(yī)藥的潛在危險1、生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化的潛在危險 病原體及其代謝產(chǎn)物通過接觸，可能感染人或其他生物（生物安全性）； 產(chǎn)品對人或其他生物的致毒性、致敏性或其他尚不預(yù)知的生物學(xué)反應(yīng)（潛在致病性）； 小規(guī)模試驗的

6、情況下原本是安全的供體、載體、受體等實驗材料，在大規(guī)模生產(chǎn)時完全有可能對人和其他生物及其生存環(huán)境的產(chǎn)生危害（生物安全性） ； 在短期研究和開發(fā)利用期間內(nèi)是安全的基因工程藥物，很可能在長期使用后產(chǎn)生無法預(yù)料的危害（潛在致病性） 。2、重組DNA 試驗過程中的隱患實驗室重組DNA試驗過程中的潛在危害: 病原體，特別是重組病原體對操作者所造成的污染。 病原體或帶有重組DNA的載體及受體，逃逸出實驗室，對自然環(huán)境造成污染?；蛑亟M生物堂而皇之地進入了大自然。如轉(zhuǎn)基因植物因花粉風(fēng)揚或蟲媒所進行的有性生殖過程擴散，所導(dǎo)致的“基因漂散”。生物實驗室產(chǎn)生的廢棄DNA片段的排放例如：廢棄重組質(zhì)粒DNA熱處理效率

7、如何？ p 上海市科委與環(huán)保局2006的聯(lián)合調(diào)查顯示, 實驗室的生物性廢水通常只經(jīng)過100煮沸3-5min后排放下水道，或無任何預(yù)處理措施而直接排放。p 2008一項研究已證實, 目前常用的針對生物實驗室廢水的100熱處理過程難以徹底消解、破壞水中廢棄的重組質(zhì)粒DNA。p 熱處理質(zhì)粒DNA 的降解半衰期約為2.7 - 4min，30min后仍存在一級結(jié)構(gòu)完整的質(zhì)粒，且仍有3%-5%的活性；即使熱處理60min 其仍具有一定的生物活性。3. 疫苗（vaccine）應(yīng)用的安全性問題 疫苗制品成分本身作為毒性物質(zhì)對機體的直接損傷。|疫苗的大分子性、酸堿度、滲透壓、所含的防腐劑，均可能引起不同程度的炎

8、癥反應(yīng)，產(chǎn)生一些對機體有損害的反應(yīng)。 誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)引起的與免疫相關(guān)的毒性。 疫苗及其污染物和殘余雜質(zhì)引起的毒性。 若疫苗載體在體內(nèi)變異，將威脅患者的生命。 其它未知的毒性 4. 基因治療的前景及其安全性問題基因治療（gene therapy）是指將外源正常基因?qū)氚屑毎?，用以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的目前的基因療法是先從患者身上取出一些細胞，然后利用對人體無害的逆轉(zhuǎn)錄病毒當(dāng)載體，把正常的基因嫁接到病毒上，再用這些病毒去感染取出的人體細胞，把正常基因插進細胞的染色體中，使人體細胞就可以“獲得”正常的基因表達。 隨機整合：可能誘發(fā)插入突變，激活癌基因。病毒重組：缺陷型逆轉(zhuǎn)

9、錄病毒通過重組獲得復(fù)制能力。案例（略）5. 生物醫(yī)藥對國際安全的威脅p 利用重組DNA技術(shù)可以使許多疫苗和抗菌素失去作用（新型、高效傳染性病毒，用毒素基因與流感病毒基因拼接的新生物毒素已能夠大量生產(chǎn) ）。p 基因治療技術(shù)有可能被濫用，比如用于去掉不想要的基因，加入想要的基因，即用于人種的改造等。三、生物類藥物不同于化學(xué)藥物之處（一）生物類藥物的藥學(xué)和藥動學(xué)特點v 多為蛋白質(zhì)、多肽和核酸，使用劑量小，藥理活性高，毒性相對較低。v 穩(wěn)定性差，對熱、酸、堿、重金屬以及pH較敏感，極易失活。v 分子量大，還時常以多聚體形式存在，很難透過胃腸道粘膜的上皮細胞層，故口服吸收很少，不能口服給藥，一般只有注射

10、給藥，不方便長期給藥的病人；v 體內(nèi)生物半衰期較短，從血中消除較快，因此在體內(nèi)的作用時間較短，沒有充分發(fā)揮其作用。（二）生物藥物的特殊性 1、結(jié)構(gòu)確證不完全性 生物技術(shù)藥物的活性主要取決于其氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，但由于其一般分子量較大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)有的分析方法和手段并不能完全地確認(rèn)其化學(xué)結(jié)構(gòu)。合成多肽結(jié)構(gòu)確認(rèn)的內(nèi)容：p 氨基酸序列研究：說明氨基酸連接順序是否正確，常常用Edman降解（即測定N端氨基酸）、質(zhì)譜、核磁共振譜等方法。p 空間結(jié)構(gòu)研究 生物藥物原則要求空間結(jié)構(gòu)研究，特別是長肽。如文獻或研究顯示，某多肽需要維持一定空間才有活性，則必須開展相應(yīng)的空間結(jié)構(gòu)研究。2、種屬特異性包括不同人

11、種之間的差異、人與動物之間的差異。不同種屬的動物的同類受體在結(jié)構(gòu)或功能上可能存在差異。因此生物藥物在不同種屬動物，存在生物活性的差異，甚至不同的反應(yīng)。3、多功能性在同一生物體內(nèi)，生物技術(shù)藥物的受體可能廣泛分布，或者針對的是特定的細胞信號通路，從而可以產(chǎn)生廣泛的藥理活性和毒性作用。因此，應(yīng)用中應(yīng)考慮與其藥理學(xué)效應(yīng)相關(guān)的潛在危害。 例如某些生長因子EGF、VEGF和NGF，除了促進表皮、血管、神經(jīng)組織的生長外，也是胚胎正常發(fā)育必不可少的。阻斷這些通路（如FGFR拮抗劑）即使未發(fā)現(xiàn)發(fā)育毒性，在理論上存在風(fēng)險。4、免疫原性和免疫毒性 免疫原性：指藥物刺激機體形成特異性抗體或致敏淋巴細胞的性質(zhì)。免疫原性

12、是藥物本身具有的性質(zhì),有免疫原性不一定導(dǎo)致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價。 免疫毒性：指受試品引起免疫抑制（感染，腫瘤）或增強（過敏反應(yīng)）或自身免疫反應(yīng)。可能與藥理活性相關(guān)(如抗排斥藥物) 或不相關(guān)(如部分抗腫瘤藥物)。（1） 免疫原性的強弱是生物技術(shù)藥物開發(fā)的決定因素之一。治療用生物制品：評價其免疫原性，在于考察藥物的免疫原性對藥效和安全性評價可能的影響。 例如，抗藥物抗體可能會中和藥物的活性、影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布，改變藥效/藥動學(xué)，使在非臨床研究中觀察到的效應(yīng)可能并非藥物真正的藥理和/或毒性反應(yīng)。預(yù)防用生物制品：評價其免疫原性，在于考察藥物的免疫原性強弱及

13、其免疫保護作用的關(guān)系。（2）免疫原性檢測對生物藥物至關(guān)重要。在非臨床研究中評價免疫原性，主要目的在于考察生物藥物的免疫原性強弱和免疫原性對安全性評價可能的影響。第二節(jié) 生物類藥物臨床前安全性評價要求(1) 急性毒性實驗（單劑量）：原則上所有新的有效成分均應(yīng)實施該實驗。原則上應(yīng)選擇兩種以上的動物，重點為掌握中毒癥狀及隨時間推移的變化及劑量反應(yīng)關(guān)系，不一定要求測定LD50。(2) 慢性毒性實驗（重復(fù)給藥）Ø 給藥周期至少要達到臨床擬給藥時間。Ø 給藥頻率應(yīng)等于或大于臨床給藥頻率，若臨床給藥頻率按半衰期決定，也應(yīng)根據(jù)半衰期進行；Ø 由于溶解度、注射次數(shù)、最大臨床擬用劑量

14、的限制，通常不確定最大耐受劑量 ，最高劑量至少應(yīng)為最高臨床擬用劑量的10倍。(3) 生殖毒性實驗：臨床上孕婦、妊娠及授乳期可能使用的藥品原則上應(yīng)實施該實驗。(4) 致突變實驗：w應(yīng)優(yōu)先考慮使用哺乳類細胞進行致突變實驗w已證明與人型在自然狀態(tài)下相同的單一多肽或蛋白質(zhì)及疫苗不一定要求該實驗。由于生殖細胞和體細胞都可發(fā)生染色體畸變。因此，染色體畸變試驗可分別在這兩種細胞中進行，一般以骨髓或外周血細胞代表體細胞，睪丸精原細胞代表生殖細胞。(5)致癌性實驗：w一般標(biāo)準(zhǔn)的致癌性實驗（2年的嚙齒動物）對生物技術(shù)藥物不合適；鼓勵使用轉(zhuǎn)基因動物模型。w對具有免疫抑制或促進細胞增殖的生物藥物，應(yīng)關(guān)注其致癌性評價：

15、如注意反復(fù)給藥毒性中組織病理學(xué)檢查、體外細胞增殖實驗等。w如有疑問，可考慮進行標(biāo)準(zhǔn)的致癌實驗（受試物在動物身上應(yīng)有活性和無免疫原性）(6) 免疫原性實驗重復(fù)給藥，必須檢查抗體是否產(chǎn)生以及形成抗體后對藥理效應(yīng)影響方面的分析。應(yīng)選擇不易產(chǎn)生抗體的實驗動物進行實驗。1）抗體的檢測及其判斷² 檢測是否有抗體產(chǎn)生，抗體的出現(xiàn)時間、出現(xiàn)抗體的動物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動態(tài)變化等。² 判斷產(chǎn)生的抗體是中和抗體還是非中和抗體，是否和毒性相關(guān)等。中和抗體（neutralizing antibody）：是指能中和抗原生物學(xué)活性的抗體。如rhbFGF連續(xù)給藥15d后,在大鼠的rhbFGF 3個

16、劑量組中均可檢測出抗rhbFGF抗體,這種抗體具有抑制rhbFGF促進NIH3T3細胞增殖的作用。非中和抗體：在臨床上可能也具有意義,因為這些抗體可能會增強或減少藥物清除,從而改變藥物的半衰期、組織分布或某些靶器官暴露于藥物的時間,最終可能影響其體內(nèi)的活性和毒性。2）抗體產(chǎn)生的后果 中和抗體可能會中和（降低）藥物的活性； 中和抗體和非中和抗體均可能影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布； 中和抗體抑制內(nèi)源性蛋白，改變藥效/藥動學(xué)，使在研究中觀察到的效應(yīng)可能并非藥物真正的藥理和/或毒性反應(yīng)。 注射部位出現(xiàn)局部反應(yīng)、或輕度及致命性全身反應(yīng)。(7)安全藥理學(xué)實驗常常與單次和多次給藥毒性實驗結(jié)合進行；不

17、用嚙齒動物；增加腎臟免疫復(fù)合物檢查。(8)毒代動力學(xué)研究：同化學(xué)藥物(9)局部刺激實驗：局部用藥品及血液制品均應(yīng)實施。（10）其他：如過敏性檢測第三節(jié) 生物藥物安全性評價重點關(guān)注問題（一） 生物藥物非臨床安全性評價考慮因素1、微生物學(xué)安全性1）外來感染源：細菌、支原體、真菌、病毒、克雅氏病原體等。2）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品體內(nèi)重建為強復(fù)制型病毒載體的潛能。3）細胞攜帶同源性或異源性病毒，如逆轉(zhuǎn)綠病毒、EB病毒、巨細胞病毒在環(huán)境中擴散的可能性，如病毒載體傳播。2、致癌性1）產(chǎn)品中殘留的致癌性DNA。2）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的載體插入突變。3）細胞治療中供體的惡性或癌前細胞。4）細胞培養(yǎng)過程中導(dǎo)致永生化、惡性轉(zhuǎn)化和生長

18、因子非依賴性5）細胞治療產(chǎn)品中的雜質(zhì)細胞。3、免疫學(xué)安全性1）抗藥性抗體。2）宿主細胞的蛋白質(zhì)（結(jié)構(gòu)差別）或雜質(zhì)。3）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的病毒載體。4）細胞治療中的雜質(zhì)細胞。5）組織（器官類）產(chǎn)品的外源表位。6）DNA疫苗的免疫耐受性。4、藥理學(xué)安全性1）擴大的藥理作用或意外的受體結(jié)合。2）分布于非靶組織3）細胞治療中細胞表型、功能和定位的改變。5、生物分布1）治療中所用基因及細胞的分布及體內(nèi)的滯留時間。2）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至生殖細胞。3）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的載體插入突變。4）載體播散及病毒傳播。5）產(chǎn)品（如生長因子）活性或藥理作用、免疫調(diào)節(jié)活性。6、一般安全性問題1）蛋白質(zhì)、病毒載體的物理特征。2）共價結(jié)合性

19、配體分子，如毒素。3）產(chǎn)品配方及賦形劑。4）局部耐受性。（二）相關(guān)動物的選擇p 一是指受試物可在此類動物體內(nèi)，表現(xiàn)出藥理學(xué)活性。p 二是考慮受試物誘發(fā)動物產(chǎn)生抗體的情況 rhbFGF在大鼠產(chǎn)生明顯的抗體，而在獼猴則不產(chǎn)生抗體。（bFGF在人與獼猴的氨基酸殘基同源性高達90%，而在人與大鼠之間的同源性僅為80%，所以抗體的產(chǎn)生似與該受試物在人與動物之間種屬差異程度有關(guān)。）1、選擇相關(guān)種屬的動物進行毒性試驗p 生物藥物的靶點主要是受體或抗原表位。所謂相關(guān)種屬，是指受試物在此類動物體內(nèi)，由于受體/抗原決定簇(對單抗而言) 的表達，能產(chǎn)生藥理活性。p 選擇相關(guān)種屬的動物進行毒性試驗，即選擇其藥理作用與

20、人體反應(yīng)一致、而抗體產(chǎn)生較少的動物。2、通過體外試驗來篩選生物技術(shù)藥物的相關(guān)動物p 傳統(tǒng)的競爭結(jié)合試驗或BIAcore結(jié)合試驗，可用來考察受試物與人體靶組織和不同試驗動物靶組織的結(jié)合情況。p 通過測定受體數(shù)量、受體親和力或藥理作用，幫助選擇合適的動物種屬進行體內(nèi)藥理和毒理試驗。3、根據(jù)蛋白質(zhì)的同源性篩選相關(guān)動物p 人源性重組多肽與動物同類蛋白氨基酸序列的一致性常作為篩選相關(guān)動物的依據(jù)。因動物蛋白質(zhì)和人體蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性越高，人體蛋白質(zhì)越容易與動物受體發(fā)生交叉反應(yīng)。p 蛋白質(zhì)同源性是篩選相關(guān)動物的起點，但并不是作為確定相關(guān)動物的絕對依據(jù)。 如IL-2和IL-6在動物和人體內(nèi)的同源性很差，但重組人IL-2和IL-6卻在很多種試驗動物中顯示出藥理