酒石酸銻鉀對(duì)人胃癌細(xì)胞體外增殖和凋亡的阻礙

1、酒石酸睇鉀對(duì)人胃癌細(xì)胞體外增殖和凋亡的阻礙徐少勇，郭光云，王家寧，黃永章【關(guān)鍵詞】胃腫瘤AbstractAIM:Toexplorethetherapeuticeffectsofantimonialsonsolidtumorbyobservingtheeffectsofpotassiumantimonyltartrate(PAT)ontheproliferationandapoptosisofhumangastriccancerSGC7901cellsinvitro.METHODS:MTTmethodwasusedtomeasurethelevelsoftheproliferationofSGC

2、7901cellsintervenedwithPATofdifferentconcentrations.ThecellapoptosiswasdetectedbyHoechst33258andflowcytometry.RESULTS:PATinhibitedSGC7901cellgrowthsignificantlyinadoseandtimedependentmanner.PATdisplayedprominentinhibitoryeffectswith20and40Umol/Lat72hours,andthegrowthinhibitionratesofthecancercellsre

3、ached%and%,respectively.SGC7901cellschromatincondensationandnuclearfragmentationwereseenunderfluorescencemicroscopeinthecellsstainedwithHoechst33258.Theapoptosisratewasthehighestwith40Umol/LPATat48hours,reaching%.Comparedwiththatofthecontrolgroup,thecellpercentageofG0/G1phasedecreasedandthatofG2/Mph

4、aseincreased%vs%).CONCLUSION:PATsignificantlyinhibitstheproliferationandinducestheapoptosisofSGC7901cells.【Keywords】antimonypotassiumtartrate;stomachneoplasms;celldivision;apoptosis【摘要】目的：通過觀看酒石酸睇鉀（PAT）在體外對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖和凋亡的阻礙，探討重金屬睇劑對(duì)實(shí)體瘤的醫(yī)治作用，為PAT用于臨床醫(yī)治胃癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ).方式：采納MTT法檢測不同濃度PAT對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞的

5、生長增殖的阻礙;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258染色后熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡.結(jié)果：5,10,20,40Umol/LPAT能明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖，抑制作用呈時(shí)刻和劑量依托性.20,40Umol/LPAT作用72h細(xì)胞的生長抑制率別離是和；Hoechst33258染色顯示PAT作用后，細(xì)胞核顯現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞儀檢測到凋亡峰，凋亡率以40Umol/L作用48h最大，達(dá)%同時(shí)G2/M期細(xì)胞明顯增多，以對(duì)照組的先增至%結(jié)論：PAT能抑制SGC7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.【關(guān)鍵詞】酒石酸睇鉀；胃腫瘤；細(xì)胞割裂；脫噬作用0引言胃癌晚期預(yù)后差，長期存活率低1,2,5a生存率僅15

6、%25%3.大多數(shù)胃癌患者診斷時(shí)己到進(jìn)展期，需同意化療，但常規(guī)化療藥物的成效不睬想.因此，尋覓新的藥物有重要臨床意義.最近的研究發(fā)覺微摩爾濃度的錦劑酒石酸睇鉀（potassiumantimonyltartrate,PAT）、三氧化二/能顯著抑制白血病細(xì)胞、惡性B淋巴細(xì)胞生長，而對(duì)正常的淋巴細(xì)胞無阻礙，被以為是一個(gè)潛在的、有價(jià)值的醫(yī)治血液系統(tǒng)惡性腫瘤的藥物4-7.但睇劑對(duì)其他實(shí)體瘤細(xì)胞的作用尚不清楚.咱們選用不同濃度的酒石酸睇鉀作用于人胃癌SGC7901細(xì)胞，觀看其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的阻礙.1材料和方式材料PAT購自SigmaAdrich公司，用三蒸水配制成1義10-2mol/L貯存液.利歷時(shí)

7、用RPMH640培育基配成工作濃度；Hoechst33258,PI（碘化丙咤），RNase購自Sigma公司；四甲基偶氮畦鹽（MTT）購自北京華麗公司；RPMI1640培育基、小牛血清購自Gibco公司；利用OlympusBX51熒光顯微鏡£960酶標(biāo)儀CoulterEpicsXL流式細(xì)胞儀.SGC7901人胃癌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物所.用RPin640培育液（含100mL/L小牛血清，100ku/L青霉素和鏈霉素）37,50mL/L的C02孵箱中常規(guī)培育.方式法檢測細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用g/L胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3X107/L,接種于96孔培育板，每孔

8、加200uL的細(xì)胞懸液,細(xì)胞培育24h貼壁后，加入PAT.設(shè)陰性對(duì)照組和不同濃度PAT實(shí)驗(yàn)組（5,10,20,40Hmol/L）.每組均設(shè)立4個(gè)復(fù)孔.培育24,48,72h每孔加入5g/LMTT（PBS配制）20uL再培育4h,吸棄上清，加入DMS0200UL,震蕩10min.于酶標(biāo)儀490nm處測量吸光度A值.上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值.計(jì)算細(xì)胞增殖的抑制率二（1-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值X10096.33258染色觀看細(xì)胞核轉(zhuǎn)變?nèi)≈笖?shù)生長期的細(xì)胞，以2X109/L密度接種于含消毒蓋玻片的6孔板中，培育24h細(xì)胞貼壁后加入上述濃度的PAT.24,48h后吸盡培育液，加入固定液（甲醇V：冰醋酸

9、V=3：l）mL,固定10min,去固定液，用PBS洗2遍.加入5mg/LHoechst33258mL,染色5min.紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡觀看并照相.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡細(xì)胞處置同前.搜集藥物作用24,48h后的細(xì)胞，PBS漂洗,700mL/L乙醇4固定留宿，離心去乙醇，PBS漂洗，加入1g/LRNase200UL于37c消化30min,加入50mg/LPI200uL于4染色1h,流式細(xì)胞儀檢測，采納Muticycle軟件分析細(xì)胞周期.統(tǒng)計(jì)學(xué)處置：所有數(shù)據(jù)均采納x土s表示，采納軟件處置系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.各組間細(xì)胞生長抑制率比較采納方差分析；兩兩比較用SNKq查驗(yàn).2結(jié)果細(xì)胞增殖PAT

10、能明顯抑制體外培育的SGC7901細(xì)胞生長，其抑制率隨時(shí)刻延長和濃度升高而升高，存在時(shí)刻效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系.5,10,20,40Umol/LPAT處置SGC7901細(xì)胞72h的抑制率別離為%,%,%和%（Fig1）.細(xì)胞形態(tài)Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀看，見對(duì)照組細(xì)胞所發(fā)熒光較弱，較均勻；而經(jīng)PAT作用24,48h后的SGC7901細(xì)胞顯現(xiàn)核固縮，呈致密強(qiáng)熒光，DNA濃縮并向核膜靠攏，少數(shù)細(xì)胞核碎裂成塊狀(Fig2).細(xì)胞周期及凋亡流式細(xì)胞儀檢測顯示PAT作用后的SGC7901細(xì)胞呈特點(diǎn)性的亞二倍體峰，細(xì)胞凋亡率呈必然的劑量效應(yīng)關(guān)系.40Umol/LPAT作用48h后，細(xì)胞

11、的凋亡率最大，為%.PAT作用48h后，各個(gè)濃度作用組G2/M的細(xì)胞均明顯多于空白對(duì)照組，而G0/G1期和S期細(xì)胞那么減少，不同有顯著性意義(P<,Tab1).表1PAT作用48h后SGC7901細(xì)胞凋亡率和周期(略)3討論錦劑(PAT、三氧化二睇)能顯著抑制白血病細(xì)胞、惡性B淋巴細(xì)胞生長，而對(duì)正常的淋巴細(xì)胞無阻礙.其機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡4-7.咱們發(fā)覺5umol/LPAT作用24h后就能夠抑制體外培育的胃癌SGC7901細(xì)胞的生長,且其抑制細(xì)胞增殖在必然范圍內(nèi)，隨PAT的濃度增加，作歷時(shí)刻的延長，細(xì)胞增殖抑制率相應(yīng)增加.為進(jìn)一步研究PAT用于胃癌的化療提供了可能.細(xì)胞凋亡異樣在腫瘤發(fā)生進(jìn)

12、展中具有重要作用，人們致力于開發(fā)新的藥物以選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡8.咱們發(fā)覺PAT可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.PAT作用后的SGC7901細(xì)胞呈典型細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變：染色質(zhì)邊聚，胞核固縮，碎裂.流式細(xì)胞儀檢測可見凋亡細(xì)胞形成的亞G1峰，其凋亡率與藥物濃度成正比，提示呈劑量依托性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.PAT作用后，細(xì)胞周期也發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變，其中G2/M期細(xì)胞增加，G0/G1期細(xì)胞減少.最近幾年來的研究說明，G2/M期阻滯的發(fā)生與細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密，G2/M期阻滯可能使受損DXA在染色體分離前取得修復(fù)，修復(fù)成功的腫瘤細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)入增殖周期，不能修復(fù)者那么進(jìn)入凋亡途徑9途推測PAT可能作用于細(xì)胞G0/G1,使G2/M期細(xì)胞

13、阻止,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.綜上所述,PAT可抑制SGC7901細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.有望老藥新用，將其應(yīng)用于胃癌醫(yī)治.【參考文獻(xiàn)】1BuonadonnaA,LombardiD,DePaoliA,etal.Adenocarcinomaofthestomach:UnivariateandmultivariateanalysesoffactorsassociatedwithsurvivalJ.Tumori,2003;2(5Suppl):31-34.2徐俊榮，崔大祥，張瀝，等.胃癌不同表達(dá)基因的克隆測序及臨床應(yīng)用J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002；23(2)：148-151.XuJR,CuiDX,Zhan

14、gL,etal.Cloning,sequencingandclinicalapplicationofdifferentiallyexpressedgenesingastriccancerj.JFourthMilMedUniv,2002;23(2):148-151.3李陜區(qū)，張康泰，閆小君.鼠源抗胃癌抗體輕鏈可變區(qū)基因克隆及其結(jié)構(gòu)分析J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000;21(5)：S95-S97.LiSQ,ZhangKT,YanXJ.Cloningandconstructiveanalysisofmouseantigastriccancerantibodylightchainvariableregi

15、ongenefragmentsj.JFourthMilMedUniv,2000;21(5)：S95-S97.4 MullerS,MillerWHJr,DejeanA.TrivalentantimonialsinducedegradationofthePMLRARaoncoproteinandreorganizationofthepromyelocyticleukemianuclearbodiesinacutepromyelocyticleukemiaNB4cellJ.Blood,1998;92(11):4308-4316.5 LecureurV,LagadicGossmannD,Fardel0

16、.PotassiumantimonyltartrateinducesreactiveoxygenspeciesrelatedapoptosisinhumanmyeloidleakemicHL60cellsJ.IntJOncol,2002;20(5):1071-1076.6 LecureurV,LeThiecA,LeMeurA,etal.PotassiumantimonyltartrateinducescaspaseandreactiveoxygenspeciesdependentapoptosisinlymphoidtumoralcellsJ.BrJHaematol,2002;119(3):608-615.7 于文強(qiáng)，孫秉中，柴玉波，等.不同睇劑對(duì)早幼粒細(xì)胞白血病凋亡誘導(dǎo)作用的觀看J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003；24(4)：338-341.YuWQ,SunBZ,ChaiYB,etal.ApoptosisofacutepromyelocyticleukemiacellXB4inducedbydifferentkindsofantimonialsj.JFourthMilMedUniv,2003;24(4