擴增產(chǎn)物的分析方法

1、PCR擴增產(chǎn)物的分析方法 微孔板夾心雜交法 顏色互補分析法 PCR-ELISA法 PCR-OLA法 PCR-打點雜交法 微孔板夾心雜交法：該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特 異雜交使產(chǎn)物的間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物的另一特異性較一次 雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV 的檢測，其敏感度可達5個HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的Southern雜交法相當(dāng)。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡 便、快速、避免了同位素標(biāo)

2、記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常 規(guī)應(yīng)用的ELISA，適于臨床實驗室常規(guī)應(yīng)用。另一種微孔板雜交法不 是采用夾心法，而是直接將特異探針固定微孔板上，然后用生物素 標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交。微孔板雜交與膜印跡雜交相比，有如下優(yōu)點： 前者易操作；固相微孔板漂洗時間短，節(jié)省了檢測時間，因為 膜雜交過程中，反應(yīng)劑要浸透膜中，漂洗時，使反應(yīng)劑全部浸出需 要時間較長；本底低，微孔板雜交不需Dehatdt液和預(yù)雜交以及封 閉過程。另外，微孔板固定的DNA不需再加熱或UV照射。微孔板雜交的基本過程包括L：DNA的固定，探針的雜交和酶聯(lián)顯色。DNA的固定在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可固定在微孔板上。不同來源

3、 的微孔板固定DNA時所需鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）來固定加熱變性的核酸，然后，用固 定濃度的標(biāo)記探針雜交。顯色后，判斷合適的固定鹽濃度。固定方 法的選擇必須使DNA最大量的固定，且不影響雜交。用合適濃度的 NaCl或(NH4)2SO4可達到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。鹽濃度合 適時，DNA應(yīng)為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使 DNA“平躺”固定在孔內(nèi)而影響雜交。Mg2+雖有促進DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA應(yīng)大于300bp， 否則影響雜交結(jié)果。每孔可固定高達200ng(62

4、4bp)的DNA。合適的鹽 濃和固定量一經(jīng)確定，可按下法固定DNA。待固定DNA100加熱5min變性并立即冷卻。與合適的固定液混合后，加入微孔板的孔內(nèi)。固定液：10mmol/L磷 酸鈉-10mmol/LEDTA，pH7.0，合適濃度的NaCl（與DNA變性混合后， 終濃度為最適固定濃度）。用膠布封好，浸于37水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用于雜交，或封閉于塑料袋內(nèi)保存。雜交可采用標(biāo)準(zhǔn)的雜交系統(tǒng)雜交。夾心雜交時，是將變性的PCR產(chǎn)物與檢 測探針一并加。雜交與漂洗時間均較一般膜雜交短。顯色根據(jù)不同酶標(biāo)檢測分子的不同選擇不同的底物、終止劑和測定波 長。顏色互補分析法(A

5、)顏色互補分析法是利用三原色原理，當(dāng)不同DNA片段（A和B）同時擴增時，用引 物5端修飾技術(shù)將不同引物用不同顏色熒光素標(biāo)記（A片段引物標(biāo)記綠色的熒 光素，B標(biāo)記紅色的羅丹明）。如果僅有一條片段被擴增，擴增產(chǎn)物激發(fā)后，只有 一種顏色（紅色或綠色）。如果兩條不同大小的片段均被擴增，可通過電泳分離，紫 外激發(fā)后可觀察到不同顏色的兩條帶。如果兩條被擴增片段大小相同，電泳后可見一 條紅綠互補色-黃色帶。如果不用電泳法分離擴增片段，通過一定手段除未摻入引 物，亦可觀察到擴增產(chǎn)物的顏色。此時，擴增產(chǎn)物無論大小，只要均被擴增，就可見 一條紅綠互補的黃色條帶。該法簡便、易于自動化，可用于檢測基因，缺失、染色體轉(zhuǎn)

6、位和病原微生物。這種情 況下，只需判斷產(chǎn)物的有無。另外，在檢測多種基因?qū)嵶?、多種病原菌和HLA分型 時，可用復(fù)合PCR。此時，不同引物可用不同熒光素標(biāo)記（如綠色的ROX；藍色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。因為5端修飾后仍 可進行常規(guī)PCR擴增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個引物的5端使其攜帶 便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團，而通過另一引物5端的修飾使產(chǎn)物便于檢測。鏈霉親和素的包被：不同廠家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差異并不顯著。親和層析純化的鏈霉親和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmo

7、l/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1g/ml。向微孔板的每孔內(nèi)加入100l，封好，室溫過夜。 用PBS液漂洗。 擴增產(chǎn)物與包被板的結(jié)合：PCR產(chǎn)物1l用501PBS-Tween液稀釋后加入包被孔內(nèi)。室溫下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未摻入的熒光引物。ELISA：向結(jié)合有PCR產(chǎn)物的孔內(nèi)加入50lPBS-Tween液稀釋的HRP-抗FITC抗體，室溫下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。 將1mgTMB溶于1ml二甲基亞砜中，用50

8、mmol/L醋酸鈉-檸檬酸液（Ph4.9）稀釋10倍， 向每孔內(nèi)加入30%（v/v）H2O23l，再加入80lTMB液，使反應(yīng)在室溫下進行25min ，再加入80l2mol/L硫酸終止反應(yīng)。于ELISA計數(shù)儀上450nm測定OD值。另外，引物的修飾除用圖2-3所示的生物素和FITC外，還可用DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合位 點和生物素修飾，將DNA結(jié)合蛋白質(zhì)（GCN5或TyrR）包被在微孔板內(nèi)，與PCR產(chǎn)物結(jié)合 后，可加入酶標(biāo)親和素進行ELISA檢測。PCR-ELISA法可用于PCR產(chǎn)物定量分析。需注 意的是，定量分析時，PCR要在對數(shù)期內(nèi)終止，并需設(shè)立已知標(biāo)準(zhǔn)對照。 PCR-OLA法(A)研究表明、

9、不同個體中同源DNA片段序列間的差異大部分是限定于單個核苷酸的位 置。已弄清的人遺傳病的40個基因結(jié)構(gòu)變異中，絕大部分屬堿基替換，同樣，作為遺 傳連鎖分析標(biāo)記的大部分序列變異主要是位于基因組的非編碼區(qū)的點突變。所以，一 般基因檢測技術(shù)的一個重要要求是能很容易地檢出單一核苷酸變異。寡核苷酸連接試 驗（OLA）就是為此目的而設(shè)計的。它可以單獨或結(jié)合PCR快速確定緊密相關(guān)的DNA序 列。OLA是通過設(shè)計兩種能與靶序列DNA精確并列雜交的寡核苷酸完成的。寡核酸雜交 后，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰堿基共價連接，而錯配的相鄰堿基可通過調(diào)節(jié) 連接酶和NaCl濃度防止其連接，連接產(chǎn)物可通過凝膠電泳觀察其

10、大小，或通過5端 修飾技術(shù)使一個寡核苷酸5端帶有一個配基。連接后，通過固相化的親和配基使其 固定，漂洗后，檢測另一寡核苷酸3端攜帶的適當(dāng)標(biāo)記分子。這一過程如重復(fù)進行 多個循環(huán)，則連接產(chǎn)物會呈線性增加，故稱這循環(huán)進行的OLA為連接檢測反應(yīng)（LDR）。 此反應(yīng)中若再加入兩種與上述寡核苷酸互補的寡核苷酸互補的寡核苷酸進行循環(huán)的連 接反應(yīng)，則稱之為連接酶鏈反應(yīng)。兩寡核苷酸在無靶序列的情況下，在非常接近的位 置發(fā)生雜交的可能性極小，因此，OLA技術(shù)的假陽性極少。另外，連接酶所形成的鍵 是連接產(chǎn)物。該法適于簡單、標(biāo)準(zhǔn)化的基因組樣品處理法，或直接用表面活性劑和蛋 白酶初步處理有核細胞作為檢測樣品。需指出的是

11、，這里是以放射性標(biāo)記檢測分子為 例的。如圖2-6中的地高辛標(biāo)記分子可避免放射性同位素的缺點，且敏感性相當(dāng)，更 易于自動化。寡核苷酸的設(shè)計與標(biāo)記：用于OLA的寡核苷酸一般為20mer，使被檢變異核苷酸位于 即將連接的兩個寡核苷酸接頭的5端。即位于圖2-6中第2步左側(cè)寡核苷酸的3端。 左側(cè)寡核苷酸是5標(biāo)記生物素。右側(cè)寡核苷酸5端需磷酸化才能與左側(cè)寡核苷酸的 3-OH相連接。用PNK酶處理很易使其5或3標(biāo)記可以選擇其它標(biāo)記物（如熒光素 等）。OLA反應(yīng)：向一軟質(zhì)圓底微滴定板內(nèi)依次加入：3lPCR擴增DNA產(chǎn)物；1l剪切的鮭精DNA(10g /l);1l0.5mol/LNaCl混勻室溫作用10min。

12、加入1l0.5mol/LHCl，混勻。加入1l生物素標(biāo)記探針?biāo)芤海?40fmol）和1l32P探針（1.4fmol），2lT4連 接(約0.1WeiSS單位，用5連接緩沖液稀釋)。5X連接緩沖液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500g/lBSA。 不同寡核苷酸與底物反應(yīng)的連接所需酶液度不同，OLA試驗時，一定要小心滴定最適 酶濃度，提高連接溫度（50）可擴加OLA的特異性?；靹?，在100%濕度下于37作用1h。加入1l1mol/LNaOH，混勻，室溫下作用10min

13、。加入1l1mol/LHCl中和。加入2l10%SDS，3l15%（w/v）鏈霉親和素包被的瓊脂糖懸液，混勻后室溫作用 10min。將一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100g/ml蛙精DNA煮過的Whatman4號濾膜置于點樣器 上，然后，將微孔板內(nèi)混合液加入點樣孔內(nèi)，真空抽濾點膜。再用數(shù)毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分別依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鮮包好進行放射自顯影。打點雜交當(dāng)擴增產(chǎn)物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過 程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再 用放射性或非放射性標(biāo)記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變 DNA的突變類型，用于人類

14、遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同 位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性 均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作 用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或 法醫(yī)檢驗。因而用非放射性物質(zhì)（生物素、和地高辛等）標(biāo)記的寡 核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的 方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高、使用方便、安全、檢測速度 快。因此，本節(jié)僅敘述非放射性標(biāo)記探針的點雜交與檢測情況。膜的制備：點雜交膜的制備有兩種方法，一是將擴增產(chǎn)物直接固定于膜上，每 一個探針制備1張膜。然后，用不同的等位基因特異或某一微生物特 異探針在

15、嚴格條件下雜交來檢測擴增產(chǎn)物的突變類型或鑒定病原 菌；另一種方法是將不同的探針固定到尼龍膜上，然后，用標(biāo)記的 PCR產(chǎn)物作探針去雜交。這樣，根據(jù)雜交點的位置即可判斷產(chǎn)物序列 變異的種類。顯然，前一方法較后一方法繁瑣，費時，費力；而后 一方法僅需一次雜交即可判斷結(jié)果。產(chǎn)物的固定：取1張帶正電荷的尼龍膜，按點樣器的 大小裁剪膜，并做好標(biāo)記。將膜浸入水中濕透至少 1min。變性PCR產(chǎn)物：此步可在圓底微孔板或微量離 心管內(nèi)操作。每點的變性方法為；520l(50100ng)PCR 產(chǎn)物與100l變性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混勻，室溫作用5min即可。小心將預(yù)濕的膜裝在

16、點 樣器上，注意膜與點樣器接觸表面不能有任何氣泡。 因氣泡會使點樣點呈環(huán)形或月牙形或樣品間彌散融 合。膜固定后，每孔內(nèi)加100l變性混合液，打開真空泵。抽干變性液后，每孔內(nèi)再加100lTE緩沖 液，真空抽濾“洗滌”樣品。取下膜，置于厚3mm濾 紙上漬干。重復(fù)制備用于其它基因探針的膜時，一定要認真清洗點樣器，以免樣品間的交叉污染。漬干 的膜于80真空干烤1h或于254nmUV光源下以60120mJ/cm2 的強度下照射使DNA固定在膜上。此時，的膜可直接用 于雜交，也可以用濾紙包好存于塑料袋或干燥缸內(nèi)。探針的固定：因寡核苷酸的探針太短，在膜上固定較 困難，即使固定上，也會影響雜交。這就是需要將寡

17、 核苷酸探針用末端轉(zhuǎn)移酶加polydT尾后，UV線照射固 定。因為UV可激活胸腺嘧啶，使其與尼龍膜上的氨基共價結(jié)合，使探針間接地牢固地固定在尼龍膜上。這 種加尾固定的探針不影響雜交。但這種雜交對固定探針的要求是，在同一條件下與PCR產(chǎn)物的雜交必須是特 異的。通過選擇探針的合適長度，G+C含量或通過改變 探針的固定可達到特異性的要求。這種固定的探針可 用于檢測人類基因的突變，也可用來檢測病原微生 物。(1)加尾反應(yīng)是用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）催化，它可將dT依次加在寡核苷酸的3端，在四種脫氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通過改變dT濃度和TdT量 可調(diào)節(jié)加尾長度，在下述反應(yīng)條件下，加尾長

18、度可達 400個dT。向一微量離心管中依次加入：寡核苷酸探 針，100200pmol;10TdT緩沖液(1mol/L二甲胂酸鉀; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10l;dTTP80110nmol；TdT，6080U；補水至100l。 混勻后，稍加離心，置37水浴6090min。加入 100l10mmol/LEDTA終止反應(yīng)。加尾長度可通過10%聚 丙烯酰胺凝膠電泳監(jiān)測。(2)點膜：加尾探針6pmol，用0.3mol/LNaOH室溫處理5min，然后，用2.5mol/LNH4Oac中和。加入等體 積6SSC(1SSC:0.15

19、mol/LNaCl，0.015mol/L檸檬酸三 鈉pH7.0)。將6SSC預(yù)濕的尼龍膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在點樣器上。點樣方法同上。(3)固定：小心取下膜，置于TE緩沖液飽和的46 濾紙上，DNA面朝上。將濾紙和膜一起置于254nmUV 燈下照射固定，poly(dT)400尾的探針在40mJ/cm2r的 劑下固定效果最好。輻射劑與給定光源對給定面積的 能量釋放率（輻照度）和輻照時間有關(guān)。一般對一個 固定光源而言，輻照劑量為：輻照劑量（J/cm2）=輻照度（w/m2）輻照時間(s)其中，J為輻照能量單位；w為輻照通量單位。輻照度 與照射角度有關(guān)，與入射角度的余弦（c

20、os）呈正 相關(guān)。固定后，在100ml6SSC-0.5%SDS液中于4255 漂洗30min左右。漂洗后可立即用于雜交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾干后室溫保存。探針的固定量與加尾長度均影響雜交結(jié)果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探針與等PCR產(chǎn)物（2.33fmol） 雜交，固定6pmol苷酸雜交時，有29.2%的PCR產(chǎn)物與 1.1%的寡核而固定的探針600fmol雜交時，僅有2.2%的產(chǎn) 物與0.8%。用不同加尾長度的等量產(chǎn)物6pmol固定寡核苷酸與（時，僅0.33%233fmol）雜交結(jié)果表明， poly(dT)300探針與產(chǎn)物雜交；而有1.3%的探針poly (dT)400時

21、，則與產(chǎn)物雜交。因此，固定的探針加最好 在400個以dT尾上，固定量也至少6pmol。雜交寡核苷酸探針的雜交：每一寡核苷酸探針均有自己的雜交溫度和漂 洗條件，主要取決于探針的Tm值。Tm值則受探針長度，G+C含量和雜 交液的鹽渡影響。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)來計算Tm 值。在1mol/L鹽濃時，雜交溫度可比預(yù)測的寡核苷酸Tm值低520。 提高雜交溫度和降低鹽濃度可提高雜交的嚴格性。漂洗液一般不含 鹽，漂洗溫度比雜交溫度低5。一旦確定了探針的雜交與漂洗條 件，可按下述方法進行雜交。在（2SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol

22、/LEDTA，Ph7.4）液中預(yù)濕點樣膜。置 膜于塑料封口袋中，并加入適量雜交液（SSPE，5Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋內(nèi)不要有氣泡。置于水浴加熱搖 動，在雜交溫度下預(yù)雜交5min。取出塑料袋，剪開一角。加入非 放射性標(biāo)記物（如生物素-補骨脂素）標(biāo)記的探針。每毫升雜交中加 入1pmol探針。封口后搖育2060min。雜交時間不能太長，否則會 引起探針與膜的不可逆結(jié)合。從袋中取出膜，室溫下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗12次。漂洗溫度下預(yù)熱的漂洗 液在合適溫度下洗10min。漂洗后的膜可用于顯色檢測。反向點雜交：反向點雜交即擴增產(chǎn)

23、物作為相中的探針與固定到膜上 的寡核苷酸雜交。如前述，這種雜交最基本的要求就是在同一條件 下，所有固定探針均與擴增產(chǎn)物特異雜較。為此，主要是認真選擇 與設(shè)計寡核苷酸探針，使各探針在同一條件下Tm值相近。在同一雜 交特異。一旦確定了合適的雜交和漂洗條件，即可按上述基本程度雜交。只是雜交探針（產(chǎn)物）在加入前應(yīng)加熱變性或用等體積的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA變性。雜交時間（24h）要長些。PCR 產(chǎn)物的標(biāo)記可以用標(biāo)記引物擴增或在擴增時摻入標(biāo)記物。雜交的檢測不同非放射性標(biāo)記物的檢測原則上基本相同。若為酶標(biāo)探針則可直接進行顯色檢測。下面以生物素標(biāo)記物為例加以說明。酶標(biāo)親和素的結(jié)合 漂洗后的膜在緩沖液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中與一定濃度的HRP-標(biāo)記鏈霉親和素在室溫作用10min，并輕輕振 蕩。用緩沖液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室溫下漂 洗5min，并輕輕振蕩，將膜上非特異吸附的HRP-鏈霉親和素洗掉。 顯色不同酶標(biāo)親和素的顯色條件與底物均不同，下面以HR