反相高效液相色譜法測定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量

1、反相高效液相色譜法測定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量 作者：潘見汪翔楊毅金日生【摘要】 目的建立同時測定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的反相高效液相色譜檢測方法。方法采用Restek Pinnacle C18(250 mm4.6 mm，5 m)色譜柱，配制流動相為甲醇四氫呋喃0.3%H3PO4水溶液=421356，在流速為1.0 ml/min，檢測波長為350 nm，柱溫為室溫，進樣量為10 l的情況下建立測定方法。結(jié)果木犀草素線性范圍為3.9999.75 g/ml（r=0.999 6），平均加樣回收率為105.9%，RSD=1.5%；芹菜素線性范圍為4.095102.375 g/ml（r=

2、0.999 6），平均加樣回收率為103.7%，RSD=2.5%。結(jié)論用該方法測定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量，具有分析時間較短，分離度高的特點。 【關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜法；木犀草素；芹菜素；亳菊提取物Abstract：ObjectiveTo develop a reversed-phase high performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination of luteolin and apigenin in Chrysanthemum morifolium extract.Meth

3、odsThe separation was carried out on a Restek Pinnacle C18 column（250 mm4.6 mm，5 m）with MeOHTHF0.3%H3PO4=421356 as mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/min.The absorbance was monitored at 350 nm.The volume of injection was 10 l.ResultsThe linearity was good within the ranges of 3.99 g/ml99.75 g/ml（

4、r=0.999 6）for luteolin and 4.095 g/ml102.375 g/ml（r=0.999 6）for apigenin.The average recoveries were 105.9% and 103.7% and the relative standard deviations（RSDs）were 1.5% and 2.5% respectively.ConclusionThe method used for the determination of luteolin and apigenin in the Chrysanthemum morifolium ex

5、tract has the characteristics of short retention and high resolution.Key words：RP-HPLC；Luteolin；Apigenin； Chrysanthemum morifolium extract 中藥菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序1，是一種常用中藥，具有疏風(fēng)、清熱、明目、解毒功效，臨床上用于治療高血壓病和冠心病等2。論文論文參考網(wǎng)亳菊主產(chǎn)于安徽亳州、渦陽一帶3。菊花的有效部位主要有黃酮類、萜類、碳環(huán)芳香族酚酸類化合物（蔣惠娣中藥杭白菊心血管系統(tǒng)作用及活

6、性成分研究2004浙江大學(xué)博士學(xué)位論文）4。亳菊提取物成分復(fù)雜，為控制其產(chǎn)品質(zhì)量，依據(jù)菊花藥效物質(zhì)及藥理作用，建議以綠原酸、木犀草素、芹菜素和總黃酮4個指標(biāo)，構(gòu)建質(zhì)量評價體系。其中木犀草素具有消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降低兔實驗性動脈粥樣硬化程度和降膽固醇等作用4，5；芹菜素具有抗腫瘤、抗炎、降血壓和舒張血管、抗動脈硬化和血栓癥、抗焦慮、抗菌、抗病毒等作用6。兩者藥理作用與亳菊的藥理作用相近，且兩者在亳菊提取物中含量較高。因此，建立同時測定木犀草素及芹菜素的HPLC測定方法，對亳菊提取物的質(zhì)量標(biāo)準研究及亳菊藥材的質(zhì)量控制具有重要的意義。1 儀器與試藥 Waters高效液相系統(tǒng)（包括W

7、aters 515泵，Waters 2487雙波長紫外檢測器，Empower色譜工作站）；SC5202超聲清洗器（上海蒲超超聲波儀器設(shè)備有限公司）；AG135型電子天平（Mettler Toledo）。 甲醇（色譜純）；四氫呋喃（色譜純）；超純水；磷酸（分析純）；木犀草素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111520-200504）；芹菜素對照品（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；亳菊Dendranthema.morifolium(Ramat.)Tzvel.cv.Boju由安徽濟人藥業(yè)提供；亳菊提取物樣品（農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心研究制備）。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件色譜柱為Re

8、stek Pinnacle C18柱(250 mm4.6 mm，5 m)；流動相為甲醇四氫呋喃0.3%H3PO4=421356；流速1.0 ml/min；檢測波長350 nm；柱溫為室溫；進樣量10 l。2.2 對照品儲備液的制備精密稱取木犀草素、芹菜素對照品適量，用甲醇溶解配制成含木犀草素為399 g/ml及芹菜素為409.5 g/ml的對照品混合溶液。2.3 供試品溶液的制備取亳菊提取物樣品約75 mg，精密稱定置小燒杯中，用10 ml甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中并定容搖勻，取部分溶液離心（10 000 r/min，5 min），取上清液即得供試品溶液。2.4 標(biāo)準曲線的繪制從對

9、照品儲備液中精密量取0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml，分別置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得到系列混合對照品溶液，各進樣10 l，按照上述的色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度（g/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，得木犀草素回歸方程為Y=34 778X-41 681（r=0.999 6），線性范圍為3.9999.75 g/ml；芹菜素回歸方程為Y=50 871X-38 471（r=0.999 6），線性范圍為4.095102.375 g/ml。2.5 精密度實驗取木犀草素、芹菜素混合對照品溶液（其中木犀草素為99.75 g/ml，芹菜素為102.375 g/ml）重復(fù)

10、進樣5次，10 l/次，測量峰面積，其中木犀草素峰面積的相對標(biāo)準偏差（RSD）為1.93%，芹菜素峰面積的相對標(biāo)準偏差（RSD）為2.07%。論文參考網(wǎng)2.6 重復(fù)性實驗按供試品溶液制備方法制備5份供試品溶液，分別進樣10 l，依照上述選擇的色譜條件測定，結(jié)果木犀草素含量的RSD為1.83%，芹菜素含量的RSD為2.08%。2.7 穩(wěn)定性實驗按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，6，16 h分別進樣10 l，依照上述選擇的色譜條件測定，結(jié)果木犀草素峰面積的RSD為2.26%，芹菜素峰面積的RSD為3.03%。2.8 加樣回收率實驗2.9 樣品測定按供試品溶液制備方法制備5份供試

11、品溶液，依照上述選擇的色譜條件，進樣10 l，木犀草素和芹菜素的保留時間分別在11.3，15.6 min左右。色譜圖見圖1。結(jié)果見表3。表3 亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量測定（略）3 討論3.1 檢測指標(biāo)的確定中華人民共和國藥典菊花項下以綠原酸為質(zhì)量控制指標(biāo)，但僅用綠原酸難以反映菊花廣泛的藥理作用。亳菊中黃酮類化合物含量高,對心血管具有多種作用，所以黃酮類化合物含量宜列入質(zhì)量控制指標(biāo)。由于黃酮類成分比較復(fù)雜，一般以測總黃酮為考察指標(biāo)（邢志霞懷菊花質(zhì)量標(biāo)準研究河南中醫(yī)學(xué)院論文集2006）。有效成分木犀草素及芹菜素是在亳菊中含量較高且藥理作用與菊花相似的黃酮類單體成分，其含量的高低對于亳菊藥

12、材以及亳菊提取物的藥效有著重要影響，所以在亳菊藥材及其提取物質(zhì)量檢查時如同時控制綠原酸、總黃酮、木犀草素及芹菜素的含量則更佳。3.2 流動相的選擇文獻資料基本是用甲醇磷酸水溶液作為流動相來測定木犀草素，但是在本研究過程中經(jīng)過多次實驗，發(fā)現(xiàn)分離效果對于流動相組成比例和溫度變化很敏感，且分析時間長。多次實驗結(jié)果表明，在等梯度的情況下，只用甲醇磷酸水溶液做流動相同時測定木犀草素及芹菜素，難以使兩者達到較好檢測水平。 流動相加入四氫呋喃后，發(fā)現(xiàn)黃酮苷元分離的選擇性提高了。根據(jù)實驗中色譜峰出峰規(guī)律，最終將甲醇四氫呋喃0.3%H3PO4=421356作為定量檢測用的流動相。該色譜條件分析時間較短，木犀草素

13、及芹菜素均有較佳的分離效果。柱溫對分離效果有影響，在柱溫為20，25，30條件下嘗試測定，發(fā)現(xiàn)分離效果均較好。20，25，30在中國藥典規(guī)定的室溫（1030）范圍內(nèi)，所以方法中定柱溫為室溫。圖2為篩選流動相時候的分離效果圖?？梢钥吹搅鲃酉酁榧状?.2%H3PO4=5050時，木犀草素及芹菜素分離效果均不好且時間長；流動相為甲醇四氫呋喃0.3%H3PO4=44756時，芹菜素分離效果較好，而木犀草素峰周圍有雜峰干擾； 流動相為甲醇四氫呋喃0.3%H3PO4=44956時，依舊芹菜素分離效果較好，此時與木犀草素相鄰的干擾峰隨著四氫呋喃量的增加，出峰漸快于木犀草素，繼續(xù)加大四氫呋喃的量，在流動相為甲

14、醇四氫呋喃0.3%H3PO4=421356時,兩者均有較好的分離效果且分析時間減少了。3.3 色譜柱的選擇實驗嘗試運用本工程研究中心的三根十八烷基硅烷 鍵合硅膠色譜柱：Agilent Hypersil ODS(250 mm4.6 mm,5 m)，Restek Pinnacle DB C18 (250 mm4.6 mm,5 m)和Restek Pinnacle C18(250 mm4.6 mm,5 m)，效果均較好，能達到基線分離，說明此流動相具有一定的通用性。通過比較，認為用Restek Pinnacle C18(250 mm4.6 mm,5m)效果更好。 用本方法可同步測定亳菊提取物中的木犀草素和芹菜素。方法具有分析時間較短，分離度高的特點。木犀草素和芹菜素的保留時間分別在11.3，15.6 min左右；木犀草素線性范圍為3.9999.75 g/ml（r=0.999 6），平均加樣回收率為105.9%，RSD=1.5%；芹菜素線性范圍為4.095102.375 g/ml（r=0.999 6），平均加樣回收率為103.7%，RSD=2.5%?！緟⒖嘉墨I】 1國家藥典委員會.中國藥典，部S北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005 2白雁，鮑紅娟，王東不同產(chǎn)地藥用菊花紅外光譜法