花生抗青枯病分子機(jī)理初步解析

1、花生抗青枯病分子機(jī)理初步解析花生是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物,由青枯雷爾氏菌引起的青枯病是花生最重要的土傳性細(xì)菌病害,是影響花生產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因子之一,目前還沒(méi)有行之有效的化學(xué)防治手段。解決青枯病最有效的手段是培育抗病品種,但是傳統(tǒng)雜交育種方法選育出的抗病品種存在周期長(zhǎng)、抗性與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)負(fù)相關(guān)等問(wèn)題,利用分子育種技術(shù)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗青枯病花生品種是有效解決花生受青枯病侵染的有效途徑。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)花生抗青枯病的分子機(jī)理研究甚少,對(duì)控制青枯病的抗性基因數(shù)目、作用機(jī)制、花生-青枯菌互作的機(jī)理還不清楚。隨著全基因組測(cè)序和功能基因組學(xué)的迅速發(fā)展,通過(guò)正反向遺傳學(xué)的方法克隆花生抗青枯病基因,剖析花生-青枯菌的

2、互作機(jī)制成為必然,由于花生的基因組龐大,通過(guò)正向遺傳學(xué)圖位克隆花生抗青枯病基因和解析花生抗青枯病的機(jī)理較為困難。因此,本研究旨在通過(guò)反向遺傳學(xué)手段找到與青枯病相關(guān)的抗病基因,再通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證其功能,分析其抗病調(diào)控網(wǎng)絡(luò),這將有助于揭示花生抗青枯病分子機(jī)理,促進(jìn)花生抗青枯病遺傳改良。主要研究結(jié)果如下:1.采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)抗感青枯病花生品種在青枯菌侵染后的葉片的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較。根據(jù)對(duì)青枯菌侵染的不同反應(yīng),篩選出了高抗的粵油92栽培種和高感的新會(huì)小粒栽培種。分別對(duì)兩個(gè)品種4周大的幼苗用剪葉法進(jìn)行青枯菌侵染,然后從受侵染的植株葉片中提取蛋白質(zhì),進(jìn)行雙向凝膠電泳、考馬斯亮藍(lán)染色、質(zhì)譜分析、蛋白數(shù)

3、據(jù)庫(kù)比對(duì)。和各自的對(duì)照組相比,抗、感品種中共發(fā)現(xiàn)14種差異表達(dá)蛋白。這些蛋白中,有5個(gè)是誘導(dǎo)產(chǎn)生的,4個(gè)表達(dá)上調(diào),2個(gè)表達(dá)下調(diào),3個(gè)差異表達(dá)相反。這些蛋白主要參與光合作用、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及防御反應(yīng)。總之,本研究為探明花生青枯病抗性的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。2 .通過(guò)基因芯片技術(shù)在花生上比較篩選可能與青枯病抗性相關(guān)的基因。為了鑒定抗性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本的變化,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)花生全組織、花生生物和非生物脅迫的454測(cè)序結(jié)果整合Genebank±的EST序列合成了包含有101,344條unigenes的高密度的cDNAE片（RocheNimbleGen基因表達(dá)芯片），比較抗感青枯病品種接種青枯

4、菌后mRN瘟片雜交結(jié)果分析了兩個(gè)品種的表達(dá)譜差異，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)FDRC0.05,選才?log2>1或者log2<-1為差異基因，青枯菌侵染后，抗病品種粵油92有2,638個(gè)基因表達(dá)上調(diào),1,410個(gè)基因表達(dá)下調(diào),在感病品種新會(huì)小粒中,有1,551個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2,054個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，通過(guò)5個(gè)差異基因的qRT-PCR僉證了芯片的可靠性。GOS釋和pathway分析顯示抗感品種中差異基因功能注釋的結(jié)果差異較大，參與的代謝途徑感病品種中參與的差異基因較多。一些與抗病相關(guān)的重要基因如NBS-LR瞇抗病基因、轉(zhuǎn)錄因子和激酶類(lèi)基因在抗病品種上調(diào)的較多，而在感病品種中下調(diào)的較多,這些基因的差異

5、表達(dá)可能與青枯菌侵染花生后的防御應(yīng)答有關(guān),可能參與了花生的青枯病的抗性。3 .富含亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶（LRR-RLKX有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、參與抗逆反應(yīng)和防衛(wèi)反應(yīng)等生理功能。本研究通過(guò)基因芯片分析,獲得了一個(gè)受青枯菌誘導(dǎo)差異表達(dá)上調(diào)的LRR-RL軟抗病基因AhRLK1通過(guò)RACEJ術(shù)獲得了該基因的全長(zhǎng)cDNAff列，該基因全長(zhǎng)3,292bp,編碼992個(gè)氨基酸，對(duì)其結(jié)構(gòu)分析表明具有一段信號(hào)肽、一個(gè)胞外激酶區(qū)和9個(gè)LRR保守結(jié)構(gòu)域，農(nóng)桿菌滲入法注射煙草葉片對(duì)其亞細(xì)胞定位顯示35S:AhLK1-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞膜上,通過(guò)熒光定量對(duì)其表達(dá)模式分析結(jié)果表明，AhRLK1在青枯菌侵染后在感青

6、枯病花生品種新會(huì)小粒持續(xù)上調(diào)表達(dá),而在抗病品種粵油92中變化不大,SA、ABA、ET、JA、PAC敢素處理后能上調(diào)表達(dá)，在干旱和低溫處理中下調(diào)表達(dá)。該基因瞬間超表達(dá)本氏煙草葉片能引起HR反應(yīng)，構(gòu)建超量表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草CB-1,超表達(dá)AhRLKI明顯能夠增強(qiáng)對(duì)青枯菌的抗性。與對(duì)照相比,AhRLKI超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草在接種青枯菌后一系列防御反應(yīng)相關(guān)基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtHPR3,NtHPR4,NtCHN50,NtPR1b,NtPR2,NtEFE26和NtAcs6都能夠明顯上調(diào)表達(dá)。推測(cè)AhRLKI可能參與花生對(duì)青枯菌的防御反應(yīng)，可能參與青枯菌侵染早期

7、對(duì)病原菌的識(shí)別，還參與了植物的非生物脅迫防御反應(yīng)。AhRLKI基因的獲得對(duì)于研究花生抗青枯病相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能以及青枯病抗病遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。4 .NBS-LR吐抗病基因是目前已知的植物抗病基因最大家族，在植物的抗病防御反應(yīng)中起著重要作用。本研究通過(guò)基因芯片分析,獲得了一個(gè)受青枯菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的NBS-LRR®抗病基因AhRRS5通過(guò)RAC鼓術(shù)獲得了該基因的全長(zhǎng)cDNAff列，該基因全長(zhǎng)3,157bp,編碼943個(gè)氨基酸，對(duì)其結(jié)構(gòu)分析表明具有典型的NBS-LR瞇保守2構(gòu)域，基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮實(shí)驗(yàn)表明，35S:AhRRS5-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中，熒光定量結(jié)果表明，AhRRS雕青枯菌侵染72h內(nèi)抗感花生品種中都能上調(diào)表達(dá),在感病材料中表達(dá)上調(diào)的幅度較大,受SA、ABA、ET、JA、PAC敢素的上調(diào)表達(dá)，在干旱和低溫處理中也能上調(diào)表達(dá)。該基因瞬間超表達(dá)本氏煙草葉片能引起HR反應(yīng)，構(gòu)建超量表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草CB-1,超表達(dá)AhRRS明顯能夠增強(qiáng)對(duì)青枯菌的抗性。與對(duì)照相比,AhRRS5®量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草在接種青枯菌后一系列防御反應(yīng)相關(guān)基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtPR1b,Ntla/c,Nt