在大鼠普通體外循環(huán)基礎上建立心麻液停跳模型

1、1心麻液心臟停跳在大鼠體外循環(huán)模型上所致的心肌損傷研究朱斌 Mihai V . Podgoreanu， G. Burkhard Mackensen ，葉鐵虎 黃宇光 作者單位： 100730中國醫(yī)學科學院 中國協(xié)和醫(yī)科大學 北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科（朱斌 葉鐵虎 黃宇光）；27710 美國杜克大學醫(yī)學中心麻醉科 （ Mihai V. Podgoreanu ，G. Burkhard Mackensen ）.摘要目的 在大鼠普通體外循環(huán) （CPB）模型基礎上，建立起灌注心停跳液心臟停跳（CA）模 型，比較 CA模型與普通 CPB 模型實驗大鼠心肌缺血再灌注損傷的區(qū)別；并觀察 CA 模型大 鼠術后的存活和

2、恢復情況。方法借助血管穿刺置管技術，在大鼠普通 CPB 模型基礎上，通過 右側頸總動脈置入雙腔氣囊導管，充氣套囊、阻斷升主動脈、灌注心臟停跳液使心臟停搏。比較 CPB 模型大鼠（n=6）和 CA 模型大鼠（n=15）心肌缺血再灌注損傷的區(qū)別；并分別在術 后一天、一周和兩周三個時點觀察CA 模型大鼠恢復情況（n=5 ）。結果 CA 大鼠在心臟缺血再灌注 60 分鐘后， HFABP 和 cTnI 明顯高于術前基礎值和普通 CPB 組水平，在復灌后 3 小時 達到頂峰，術后一天降低，在術后一周和兩周的觀察時點回降至術前水平。左室射血分數(shù)在 兩組動物之間差別不大；E/A比值在 CPB 后降低， 而在

3、CA 后進一步下降。 CA 組大鼠均存活， 但術后體重明顯降低，在術后一周時最為顯著，兩周時大鼠體重已經(jīng)恢復，并且超過術前水 平。 結論 本實驗在普通的 CPB 模型基礎上成功的建立了 CA 模型。同普通 CPB 模型大鼠相 比， CA 模型大鼠在體外循環(huán)心臟缺血再灌注后，出現(xiàn)了明顯的心肌損傷。CA 大鼠具有較高的存活率和與臨床類似的恢復過程。關鍵詞 心臟手術；體外循環(huán)；心臟停跳；缺血再灌注，心肌The myocardial injury following cardioplegic arrest on general cardiopulmonarybypass rat modelZHU Bi

4、n*, Mihai V. Podgoreanu, G. Burkhard Mackensen, YE Tie-hu*. HUANGYuguang*. * Department of Anesthesiology, Peking Union Hospital, CAMS & PUMC, Beijing 100730, China.Abstract Objective To establish cardioplegic arrest（CA）on the basis of general cardiopulmonary bypass（CPB） rat model; to compare th

5、e myocardial ischemia-reperfusion injury related to CA and CPB and toobserve the survival and the recovery of CA rats. Methods A double-lumen balloon catheter was cannulatedthrough the right common carotid artery into the ascending aortic artery. The cardioplegic arrest was achievedby intraaortic cl

6、amping through balloon inflation and by cardioplegia infusion. To compare the myocardialischemia-reperfusion injury related to CA and CPB and respectively observe the survival and the recovery ofCA rats at one day, one week and two weeks after cardioplegic arrest. Results At sixty minutes after card

7、iacarrest, HFABP and cTnI were significantly released compared with baseline and the rats on CPB group,reached peak value at three hours after reperfusion, reduced one day operatively and returned to theirbaseline levels at one and two week time points. Left ventricular ejection fraction didn t show

8、 obviouschange between CA andCPB group; yet E/A ratio was reduced after CPB and further reduced after CA. All the rats survived thecardioplegic arrest with significant body weight loss one day and one week postoperatively but fully recoveredtwo weeks after surgery. Conclusions The cardioplegic arres

9、t was successfully established on the generalCPB rat model. CA rats showed significant myocardial injury but presented a satisfactory survival rate andrecovery after the global myocardial ischemia-reperfusion injury.Key words Cardiac surgery; cardiopulmonary bypass; cardioplegic arrest; ischemia-rep

10、erfusion,myocardium盡管外科手術、麻醉、體外循環(huán)以及圍術期心肌保護方法已經(jīng)取得了很大的進步，但是 心臟手術術后心2肌梗死（ myocardial infarction, MI ）的發(fā)病率仍處于較高水平： 7-19%1-2； 而 這又直接影響到病人術后的短期和長期生存率3-4。心臟手術后 MI 可能是多因素的綜合結果，如：直接外科手術操作引起的創(chuàng)傷、心臟停跳復跳的心肌缺血再灌注損傷以及體外循環(huán) （ cardiopulmonarybypass, CPB ）的全身影響等5。目前模擬心臟手術的實驗模型多局限在大動 物，而與大動物相比，大鼠相對廉價、易存活，而且大鼠實驗不需要復雜的“團

11、隊”參與， 因此模擬心臟手術的大鼠 CPB 模型則具有經(jīng)濟、可重復性強等優(yōu)勢。本實驗室和其他一些研究者已經(jīng)成功在大鼠上建立起了普通 CPB 模型6-9。和臨床心臟手 術實際相比，這些模型最突出的一個問題是不能利用停跳液使大鼠心臟停跳。Gmz in ger 等曾嘗試直接阻斷主動脈并灌注停跳液，大鼠心臟成功被停跳10。但是由于研究者是在正中開胸和雙側頸總動脈置管結扎前提下進行的實驗，實驗大鼠理論上講術后沒有存活的可能。本研究擬以血管穿刺置管技術，在大鼠普通 CPB 模型基礎上，通過右側頸總動脈置入雙 腔氣囊導管建立起灌注心停跳液心臟停跳模型（Cardioplegic Arrest，CA），以比較

12、CA 與 CPB心肌缺血再灌注損傷的區(qū)別；并觀察 CA 模型大鼠的存活情況。材料與方法本動物實驗經(jīng)過杜克大學動物委員會批準，并符合美國國立衛(wèi)生研究院關于使用實驗室 動物的相關規(guī)定（ No. 86-23, revised 1996 ）。雄性 Sprague-Dawley 大鼠（鼠齡 14-16 周，體重 400-450 克，購于 Harlan, Indianapolis, IN, USA ），禁食 12-16 小時， 自由飲水。 于術日晨以 5% 異氟烷吸入誘導麻醉后， 行經(jīng)口氣管內(nèi)插管， 接呼吸機型行機械通氣，吸入 50%空 -氧混合氣，調(diào)整潮氣量和呼吸頻率，以確保呼氣末二氧化碳（PECO2）

13、在 32-42mmHg 之間。在以下的外科準備期間， 持續(xù)吸入 2%異氟烷維持麻醉。 將針型 YSI 552 體溫計 （YSI Temperature, Dayton, OH, USA）置于大鼠頭部皮下進行持續(xù)體溫監(jiān)測。其余手術操作遵循無菌操作原則，手術區(qū)域 以 1%利多卡因浸潤。在顯微鏡下共進行五支血管的穿刺置管。以聚乙烯導管（PE-10）置入腹壁尾側淺動脈行持續(xù)動脈壓監(jiān)測；以 24 號靜脈留置套管針套管進行腹壁尾側淺靜脈穿刺置 管，建立起輸液給藥靜脈途徑并予以肝素 400 IU/kg ；以 20 號靜脈留置套管針進行大鼠腹側尾 動脈穿刺置管，作為 CPB動脈回流管道； 通過右側頸外靜脈置入

14、 4.5F 多孔套管 （改制于 4.5 French Desilets-Hoffman 兒科引導管， CookInc., Bloomington, IN, USA） ，其尖端至右心房水平， 作為 CPB 靜脈流出通道。多孔導管位置通過超聲定位（ Sonos 7500, Phillips Medical Systems, Andover, MA, USA ）。通過右側頸總動脈插入球囊直徑3.5mm 的雙腔球囊擴張導管（SprinterOTW, Medtronic Inc, Minneapolis, MN, USA） 至大鼠升主動脈。 利用超聲定位， 確保導管尖端距 離主動脈瓣 0.25-0.35

15、cm，見圖 1。所有置管用絲線原位固定防止滑脫或進氣。在外科準備完 成后，測量動脈血氣和心功能基礎值，并抽取血液標本，低溫離心后-80C冰箱保存，用以測量心肌損傷指標（ cTnI 和 HFABP ）。CPB 管道包括一個特制的容積為8ml 的靜脈貯血器，蠕動泵（Masterflex, Cole-Parmer儀器公司 , Vernon Hills, IL,US） ，流量探測器（ 2N806 流量探頭和 T208 流量計 ; Transonics Systems, Inc,Ithaca, NY ,US）,特制膜氧合器（Jostra AG, Hirrlingen, Germany）,預充量 4ml,

16、氣體 交換面積 558cm2。上述各部分以 1.6mm 內(nèi)徑無菌硅膠管連接。整個 CPB 管道預充 9ml6%羥乙基淀粉膠體溶液，CPB 流量維持在于大鼠正常心輸出量水平：160-180ml/kg/min11。CPB 動脈灌注溫度通過變溫水浴系統(tǒng)進行調(diào)解。外科準備和CPB 管道連接情況見圖 2。實驗分為兩部分：第一部分，在普通CPB 模型基礎上建立停跳液心臟停跳模型（CA），并比較 CPB 模型大鼠（n=6）和 CA 模型大鼠（n=15）心肌缺血再灌注損傷的區(qū)別；第二部分，分 別在術后一天、一周和兩周三個時點觀察CA 模型大鼠恢復情況（n=5 ）。所有實驗大鼠在開始體外循環(huán)前，靜脈途徑予以肝素

17、400 IU/kg、芬太尼 25 卩 g/kg 泮庫溴銨 0.2 mg/kg，并將吸入異氟烷濃度降低至 1%。將呼吸頻率減半，CPB 模型組大鼠在整個 CPB 過程中維持該呼吸頻率的3機械通氣，CPB 氣體流量根據(jù)血氣結果調(diào)整，CPB 持續(xù) 75 分鐘。CA 模型大鼠在 CPB 開始后降溫，15 分鐘后，大鼠體溫接近 33C，充氣升主動脈內(nèi)雙腔球囊擴張導管套囊，阻斷升主動脈， 通過導管中心管腔灌注氧合含血冷心臟停跳液2ml。停跳液成份包括：三份氧合血液、一份艾司洛爾（10mg/ml）和兩份冷晶體停跳液 （5%葡萄糖、0.225%氯化鈉、95mEq/L 氯化鉀、238mL/L 三羥甲基氨基甲烷、

18、 枸櫞酸鹽磷酸鹽右旋糖液 60mL/L ）。通過心電圖和實時經(jīng)胸超聲證實心臟 停止搏動。當成功建立 CA 后，完全停止機械通氣。本實驗心臟停跳時間為45 分鐘，在停跳至25分鐘時， 追加1.5m I氧合含血冷心臟停跳液， 其間如果超聲監(jiān)測發(fā)現(xiàn)心臟有跳動跡象隨時追 加停跳液0.5ml。CA 組大鼠術中如果出現(xiàn)不能停跳或停跳后提前復跳，則視為該例失敗。大鼠 在 CA35 分鐘時開始復溫，心臟停跳 45 分鐘后，套囊放氣，重新恢復心臟血供。CA 期間持續(xù)靜脈輸注去甲腎上腺素維持平均動脈血壓不低于40mmHg , CA 后持續(xù)輸注腎上腺素以利于心臟復跳，如果動物出現(xiàn)明顯代謝性酸中毒（BE-6 ）,給予

19、碳酸氫鈉糾正。 CA 組大鼠在復跳后繼續(xù) CPB15 分鐘。所有實驗動物在 CPB 后都順利脫機，恢復正常機械通氣。CPB 管道中剩余血液常溫下以 3000 轉(zhuǎn)/每分鐘離心 2-3 分鐘以濃縮預充所致的血液稀釋，將濃縮所得紅細胞緩慢回輸給實驗大鼠。逐步退出所有血管置管，并結扎相應血管及縫合傷口。約90 分鐘后大鼠麻醉后蘇醒、恢復自主呼吸并拔除氣管插管。密切觀察兩組動物麻醉復蘇活動情況，兩組實驗大鼠 全部存活，于手術第二日將動物送回動物房飼養(yǎng)，CA 模型組大鼠分別觀察一天、一周和兩周三個時點（n=5 ）。所有實驗動物持續(xù)監(jiān)測體溫、動脈血壓、CPB 流量。分別在 CPB 前、CPB15 分鐘、CA

20、5分鐘（CPB20 分鐘）、CA20 分鐘（CPB35 分鐘）、CA45 分鐘（CPB60 分鐘）、復灌 5 分鐘（CPB65 分鐘）以及復灌后 60 分鐘測定動脈血氣（GEM Premier 3000 血氣分析儀，Instrumentation Laboratory, Lexington,MA, US）。記錄兩組實驗動物去甲腎上腺素、腎上腺素和碳酸氫鈉用量。心肌肌鈣蛋白 I （cardiac troponin I , cTnl）是心肌肌鈣蛋白復合物的亞單位之一，具有較高的心肌特異性及敏感度，已越來越多地用于診斷心肌梗死。心型脂肪酸結合蛋白（heart-typefatty acid bindi

21、ng prote in, HFABP） 是位于心肌細胞內(nèi)的可溶性蛋白，心肌損傷后可迅速漏出到血液而被檢測出，因而可以用于早期監(jiān)測心肌損傷。本研究分別利用大鼠HFABP ELISA 試劑盒 （Life Diagnostics Inc. West Chester, PA, USA） 和大鼠高敏感 cTnl ELISA 試劑盒 （Life Diagnostics Inc. WestChester, PA, USA）測定 CPB 前和復灌 60 分鐘后的 cTnl 和 HFABP 水平。本研究中，二維彩色多普勒超聲心動圖儀（So nos 7500, Phillips Medical Systems,

22、An dover,MA, US ）除用于靜脈流出管道和升主動脈內(nèi)雙腔球囊擴張導管定位外，還分別在 CPB 前和復灌 60 分鐘后測定左室射血分數(shù)和舒張早期血流峰值/舒張晚期血流峰值比值（E/A 比值）以評估大鼠心功能狀況。所使用超聲探頭為S12 新生兒 5-12 MHz 心臟相位排列探頭。在獲取圖像即刻，暫停機械通氣。對于 CA 模型組大鼠，分別在術后一天、一周和兩周三個時點（n=5）測量大鼠體重，了解手術創(chuàng)傷后恢復情況。在異氟烷麻醉誘導下完成氣管插管行機械通氣。超聲測量大鼠心臟 左室短軸縮短率（fraction shortening , FS）。利用血管穿刺置管技術完成尾動脈和右側股動脈 置

23、管以測定動脈血壓和獲取測量心肌損傷指標的血液標本。在完成相關指標測量后，處死實 驗大鼠。資料以均數(shù)土標準差（X_S）表示，應用 Spss 10.0 軟件進行處理和統(tǒng)計分析，不同時點間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗（Least-significant Differenee，最小顯著差值法）；CPB 組與 CA 組之間比較用成組 t 檢驗。P40mmHg 的較 低水平，明顯低于基礎值和普通CPB 組，但是復溫復灌后，血壓保持在CPB 前水平，與 CPB組接近。 CA 組大鼠 CBP 流量在心臟停跳階段明顯高于基礎值和普通 CPB 組。 pH 在兩組動物 之間變化相似，在復灌或CP

24、B 后期都較術前值有所降低。PaC02 和 SaO2 在手術前后都保持在正常范圍。 血鉀濃度在 CA 組復灌后有一過性顯著升高， 但是仍保持在臨床正常范圍內(nèi)。 乳 酸濃度在 CA組動物心臟缺血開始后升高而同時堿剩余降低。 血紅蛋白濃度在兩組大鼠變化類 似，在 CPB 后都存在一定程度的稀釋。 CPB 組大鼠不需要使用血管活性藥物和碳酸氫鈉；而 CA 組大鼠必須使用去甲腎上腺素（平均用量50-100 卩 g）、腎上腺素（平均用量 80-150 卩 g）和 5%碳酸氫鈉（平均用量 0.6-1.2ml）才可以維持合適的血壓和血氣。2 CPB 組和 CA 組大鼠心肌損傷程度和心功能比較CA 大鼠在心臟

25、缺血再灌注 60 分鐘后， HFABP 和 cTnI 明顯高于術前基礎值和普通 CPB 組水平。左室射血分數(shù)在兩組動物之間差別不大； E/A 比值在 CPB 后降低，而在 CA 后進一 步下降，見表 2。3 CA 組大鼠在術后存活和恢復情況在 CA 組， 所有成功進行心臟停跳的實驗大鼠均存活。 術后體重明顯降低， 在術后一周時 最為顯著，兩周時大鼠體重已經(jīng)恢復，并且超過術前水平，見表3。 CA 組大鼠在心臟缺血再灌注 60 分鐘后， cTnI 和 HFABP 顯著升高， 3 小時達到頂峰，術后一天降低，但是 cTnI 仍顯 著高于術前值， 在術后一周和兩周的觀察時點， cTnI 和 HFABP

26、 降低至術前水平， 見圖 3。 CA 組大鼠心臟左室短軸縮短率在心肌缺血再灌注 60 分鐘后，顯著升高，在術后 3 小時和一天仍 高于術前，在術后一周和兩周的觀察時點，F(xiàn)S 降低至術前水平，見圖 4。討論本研究在普通的 CPB 模型基礎上成功的建立了 CA 模型。同普通 CPB 模型大鼠相比， CA 模型大鼠在體外循環(huán)心臟缺血再灌注后，出現(xiàn)了明顯的心肌損傷；盡管左室EF 與單純 CPB相比變化不大， 但舒張功能顯著降低。 由于所有 CA 模型大鼠在心臟停跳期間和復灌后先后或 同時輸注了去甲腎上腺素和腎上腺素，測量所得的心臟功能指標可能難以真實反映受試大鼠 當時的實際心功能狀況。 所有 CA 大

27、鼠均成功存活至實驗所需的觀察時點。 心臟缺血再灌注損 傷所釋放的心肌酶在術后一天后逐漸恢復回落， 1 周后恢復正常， 而實驗大鼠體重在術后明顯 降低，一周時最為顯著，兩周時大鼠體重已經(jīng)恢復，并且超過術前水平。同普通 CPB 相比，本模型的關鍵在于如何利用超聲定位確保升主動脈內(nèi)雙腔球囊擴張導 管尖端的準確位置。本實驗表明，當導管尖端距離主動脈瓣0.25-0.35 厘米時，灌注停跳液可以獲得較好的心臟停搏效果。位置過深、距離過短時，在球囊充氣后，導管尖端可能“滑” 向左心室，此時灌注 2ml 停跳液非但不能使心臟停搏，反而可能因過度擴張左心室導致心肌 損傷。位置過淺、距離過長時，充氣球囊部分可能位

28、于頭臂干內(nèi)因而難以完全封堵升主動脈， 即使灌注過量的停跳液也難以獲得良好的心臟停搏效果。因?qū)Ч芪恢貌患讯鴮е碌男呐K停搏 不能是本 CA 模型失敗的主要原因，即便受試動物不因此死亡，但是失去了繼續(xù)實驗的意義。 在本實驗室，因為這類問題而放棄的體重在 400-450 克之間的 SD 大鼠接近10%。由于本大鼠 CA 模型在最大限度上模擬了心臟手術和體外循環(huán)所造成的心肌缺血再灌注 損傷，而且實驗動物具有較高的存活率和與臨床類似的恢復過程，這為研究心臟手術術后的 心肌梗死病理生理機制和心肌保護策略提供了優(yōu)異且經(jīng)濟的動物模型。參考文獻1.Mangano DT. Effects of acadesine

29、on myocardial infarction, stroke, and death following surgery. Ameta-analysis of the 5 international randomized trials. The Multicenter Study of PerioperativeIschemia (McSPI) Research Group. JAMA. 1997;277:325-332.52.Mangano DT. Aspirin and mortality from coronary bypass surgery. N Engl J Med.2002;3

30、47:1309-1317.3.Mangano DT, Miao Y, Tudor IC, Dietzel C. Post-reperfusion myocardial infarction: longterm survivalimprovement using adenosine regulation with acadesine. J Am Coll Cardiol. 2006;48:206-214.4.Mahaffey KW, Roe MT, Kilaru R, Alexander JH, Van de Werf F, Califf RM, Simoons ML, Topol EJ,Har

31、rington RA. Creatine kinase-MB elevation after coronary artery bypass grafting surgery in patientswith non-ST-segment elevation acute coronary syndromes predict worse outcomes: results from fourlarge clinical trials. Eur Heart J. 2007;28:425-432.5.Shernan SK. Peripoperative myocardial ischemia reper

32、fusion injury. Anesthesiol Clin North America2003;21:465-85.6.Mackensen GB, Sato Y, Nellgard B, et al. Cardiopulmonary Bypass Induces Neurologic and Neurocognitive Dysfu nction in the Rat. An esthesiology 2001; 95:1485-491.7.Modine T, Azzaoui R, Fayad G, et al. A recovery model of minimally invasive

33、 cardiopulmonary bypassin the rat. Perfusion 2006; 21: 87-92.8.Dong GH, Xu B, Wang CT, et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with excellent survival. J SurgRes 2005;123:171-5.9.Zegdi OF, Vincentelli A, Cambillaud M, et al. A recovery model of partial cardiopulmonary bypass inthe rat. Perfusio

34、n 2001; 16: 215 -22010.G mzinger R, Wildhirt SM, Schad H, et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegicarrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol. 2007;102:508 -517.11.Ballaux PK, Gourlay T, Patnatunga CP, et al. A literature review of car

35、diopulmonary bypass modelsfor rats. Perfusion 1999; 14: 411-417.12.Lange FD, Yoshitani K, Podgoreanu M, et al. A novel survival model of cardioplegic arrest andcardiopulmonary bypass in rats: a methodology paper. Journal of Cardiothoracic Surgery 2008, 3:516表 1 血氣及基本生理指標分組PreCPBCPB15minCA5min(CPB20r

36、im)CA20mi n(CPB40rrn)CA45min(CPB60rrm)R 5minR 60mi nT (C)CPB36.0.534仕 0.433.仕 0.432.仕 0.334.仕 0.4 36.仕 0.736.仕 0.7CA36.仕 0.534仕 0.433.仕 0.332.仕 0.334.仕 0.535.仕 0.535.仕 0.4MAPCBP618621565146113691066136211(mmHg) CA6266016*416*468*4975796112CPBflowCPBCA17 吐 1117 吐 13*178 14*180 1217 吐 11ml/kg/min172 1

37、119 吐 15203 14200 11 17712pHCPB7.520.077.440.097.4 仕 0.09 7.460.047.430.04 7.40.027.420.。6CA7.5 牡 0.03 7.460.107.5 仕 0.08 7.510.087.510.077.4 仕 0.147.410.04PaCO2CPB382398406417415436427(mmHg) CA426365414394403423415SaO2CPB100 仕 010(仕 010(仕 0991100 010 吐 010(仕 0(%)CA990.910(仕 010(仕 0100 0100 010 吐 0991+KCPB4.450.34.410.44.5 仕 0.54.490.54.520.54.5 仕 0.5 4.510.4(mmol/L)CA4.540.34.320.34.