westernblot操作步驟

1、western blot操作步驟2012版2012-02-03 00:00   來(lái)源：丁香園   點(diǎn)擊次數(shù)： 4016 關(guān)鍵詞： western blot 操作步驟 分享到： 收藏夾 騰訊微博 新浪微博 開(kāi)心網(wǎng) 文轉(zhuǎn)載于丁香園站友dlzhangyu的論壇大作，點(diǎn)此查看詳情，感謝dlzhangyu站友的分享。2011年鄙人做western的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)目前的資料都很老，網(wǎng)上的資料也大多互相傳抄，說(shuō)法各異，于是綜合了目前網(wǎng)上所能找到的資料和個(gè)人實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，編輯了這份western blot操作步驟2012版，內(nèi)容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細(xì)節(jié)，并附上參考文獻(xiàn)（原諒我無(wú)法像

2、Endnote那樣一一注明文獻(xiàn)出處，只能大概標(biāo)注出引用的參考資料），希望對(duì)大家有幫助。鄙人按下文的步驟操作已經(jīng)做出來(lái)了穩(wěn)定可重復(fù)的、背景干凈的western條帶了，所以相信你也行。為了節(jié)省時(shí)間，鄙人總結(jié)了一下western blot Quick Guide和一天做出western的具體時(shí)間規(guī)劃，附在文末。初次發(fā)這么長(zhǎng)的帖子，難免有錯(cuò)，歡迎批判指正。背景：蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是斯坦福大學(xué)George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱(chēng)為Western Blot。最開(kāi)始做印跡的是一個(gè)叫Southern的科學(xué)家，但印跡的對(duì)象是

3、DNA鏈，他把這種技術(shù)稱(chēng)為Southern blot，后來(lái)出現(xiàn)了兩個(gè)過(guò)程相似，但是對(duì)象不同的印跡方法，一個(gè)針對(duì)RNA，一個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱(chēng)為Northern和Western，與這兩個(gè)技術(shù)的發(fā)明人沒(méi)有關(guān)系了。一、蛋白質(zhì)的樣品制備：由于這一步方法各異，具體步驟請(qǐng)參考試劑盒的說(shuō)明書(shū)即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問(wèn)題:> 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。> 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶

4、液。盡量去除核酸，多糖，脂類(lèi)等干擾分子。> 防止蛋白質(zhì)在樣品處理過(guò)程中的人為的修飾，制備過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類(lèi)的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。> 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測(cè)蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80中長(zhǎng)期保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀?huì)使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。> 若蛋白提取過(guò)程存在問(wèn)題或蛋白發(fā)生降解則很難進(jìn)行好之后的實(shí)驗(yàn)，也就很難做出好的結(jié)果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)也應(yīng)注意將樣品與loading buffer混合均勻。二、

5、蛋白質(zhì)定量如果要定量的話(huà)，一般選擇BCA或者Bradford方法，BCA要求檢測(cè)波長(zhǎng)為562nm，Bradford為595nm。具體方法見(jiàn)各試劑盒說(shuō)明書(shū)。為避免假陽(yáng)性結(jié)果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬G250混合看是否產(chǎn)生顏色。測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個(gè)泳道最大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug，所以如果從組織提取蛋白的話(huà)上樣量不宜過(guò)大）。網(wǎng)上有人喜歡等質(zhì)量上樣（即每個(gè)泳道的上樣體積不一但質(zhì)量一定），也有使用等體積上樣（即先把各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)量上樣，計(jì)算上樣體積時(shí)需包含loading bu

6、ffer的體積）。按分子克隆的說(shuō)法，還是使用等體積上樣比較好。上樣總體積一般不超過(guò)15ul，加樣孔的最大限度可加20ul樣品。上樣前要將樣品置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮35min使蛋白充分變性。也可以使用PCR儀95°加熱5min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在4冰箱短時(shí)間保存，也可在-20°冰箱保存數(shù)月，但是反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。三、SDSPAGE電泳1. 清洗玻璃板：蘸點(diǎn)洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續(xù)使用，需用無(wú)水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來(lái)，玻璃板之間墊玻璃紙隔開(kāi)。梳子應(yīng)

7、用水洗干凈，臨用前用無(wú)水乙醇擦拭晾干。2. 灌膠與上樣 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。 按配膠試劑盒說(shuō)明書(shū)選擇合適的分離膠濃度配置，最后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時(shí)要充分混勻，此外應(yīng)保證試劑的新鮮，特別是過(guò)硫酸銨。灌膠時(shí)掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變形）。未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，

8、操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù)。梳子插入濃縮膠時(shí)，應(yīng)確保沒(méi)有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長(zhǎng)度為插入的梳齒長(zhǎng)再加1cm）。 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等幾分鐘覺(jué)得差不多的時(shí)候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時(shí)間由AP以及TEMED決定，通常在30min左右，AP不新鮮會(huì)導(dǎo)致聚合變慢，氣溫較低時(shí)膠是會(huì)凝得慢一些，必要時(shí)可適當(dāng)增加AP以及TEMED的量，但通常不會(huì)超過(guò)1h，若超過(guò)1h甚至更長(zhǎng)仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無(wú)錯(cuò)誤。由于TEMED催化APS釋放相關(guān)化學(xué)基團(tuán)，再由APS釋放的基團(tuán)催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鮮的話(huà)加再多的TEMED效果

9、也不佳，這就是為什么推薦APS每周新鮮配置的原因。 按說(shuō)明書(shū)配積層膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 趁積層膠聚合的這段時(shí)間，取適當(dāng)體積樣本混合1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95100°加熱5min，若有沉淀可用稍低溫度，比如455

10、5°加熱1h達(dá)到變性的目的。我一般習(xí)慣分裝20ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，臨用前用PCR儀加熱95°C 5min，效果不錯(cuò)。 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣（我們使用的是大連競(jìng)邁科技公司的MV-III型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用5ml注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外

11、槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。目前我們做的mini膠上有10個(gè)上樣孔，一般在第一個(gè)孔加入marker（我用的是Fermentas預(yù)染marker），其余9個(gè)孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nèi)加入marker，中間8個(gè)孔加樣品。加樣前樣品應(yīng)先離心，尤其是長(zhǎng)時(shí)間放置的樣品。在未加樣的孔中應(yīng)加入等量的樣品緩沖液。上樣時(shí)，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用10ul的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時(shí)注意不要插得太深，容易把玻璃板撐開(kāi)，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。3. 電泳電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網(wǎng)上有資料建議低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳，清除凝

12、膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過(guò)程中電泳的暢通，但是在分子克隆上卻反對(duì)這種做法，理由是會(huì)破壞緩沖系統(tǒng)pH的不連續(xù)性。請(qǐng)各位按照實(shí)際經(jīng)驗(yàn)來(lái)做即可。電泳時(shí)間和電壓說(shuō)法各異。按照各實(shí)驗(yàn)室的慣例或者電泳槽的使用說(shuō)明來(lái)操作。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。四、轉(zhuǎn)膜我們實(shí)驗(yàn)室使用的是半干轉(zhuǎn)膜電泳槽。對(duì)于轉(zhuǎn)印90kd以下的蛋白，轉(zhuǎn)膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的話(huà)可以加入0.037%的SDS。1. 在電泳結(jié)束前20min開(kāi)始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張的濾紙（長(zhǎng)一般為8.18.3cm，寬度根據(jù)裁的膠大小

13、實(shí)際測(cè)量，但膠一般會(huì)縮水，所以裁8cm就行）和1張PVDF膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴干凈手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。PVDF膜使用前用無(wú)水甲醇中浸泡1min2min。目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。2. 將玻璃板撬開(kāi)才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板（撬時(shí)一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。也可取10ml注射器吸滿(mǎn)轉(zhuǎn)印緩沖液，往玻璃板與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者

14、自然分開(kāi)。取出凝膠后應(yīng)注意分清上下，可以在右上角裁一個(gè)小角。之后有兩種方法供選擇，一是按照marker指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來(lái)，二是把整張膠轉(zhuǎn)膜，前一種方法更加節(jié)約材料，但操作稍微麻煩了一點(diǎn)。在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過(guò)甲醇的PVDF膜和濾紙，平衡10min左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的SDS。3. 帶上手套，平放轉(zhuǎn)移槽的底座，依次在石墨電極上疊放3張浸泡過(guò)緩沖液的濾紙、PVDF膜（此時(shí)可在PVDF右上角減去一個(gè)角，以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面與非蛋白面）、剛剛完成電泳的凝膠和另外3張浸泡過(guò)緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動(dòng)，除去氣泡。注意每

15、疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因?yàn)橐粋€(gè)氣泡的厚度對(duì)于蛋白來(lái)說(shuō)都是十萬(wàn)八千里的。用干凈紗布將疊層上面和周?chē)亩嘤嗑彌_液吸干（這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話(huà)多余的緩沖液會(huì)導(dǎo)致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時(shí)轉(zhuǎn)好幾條膠的時(shí)候更要小心，有一個(gè)膠短路就會(huì)影響整體的轉(zhuǎn)移效率）。最后將轉(zhuǎn)移槽的上蓋扣上，接通電源開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。由于設(shè)備昂貴，第一次操作應(yīng)向熟手請(qǐng)教，否則短路可能燒壞設(shè)備！轉(zhuǎn)完后立即清洗設(shè)備，特別是金屬上蓋，轉(zhuǎn)膜液特別容易在金屬上蓋上形成結(jié)痂，影響設(shè)備的正常使用，我們實(shí)驗(yàn)室今年做western的同志因?yàn)楹雎赃@一點(diǎn)，轉(zhuǎn)膜儀燒壞了好幾次。4. 依據(jù)分子量大小電泳156

16、0min。如果初次轉(zhuǎn)膜，可以根據(jù)一般經(jīng)驗(yàn)，即多少kD的蛋白就轉(zhuǎn)多少分鐘，再根據(jù)結(jié)果調(diào)整時(shí)間。之后斷開(kāi)電源，取出轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。5. 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染。傳統(tǒng)方法是將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。實(shí)際上更常用且簡(jiǎn)便的方法是先將膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（此方法僅僅適合PVDF膜）。將膜晾干備用。使用預(yù)染marker話(huà)可以看見(jiàn)marker的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上，但是憑借這個(gè)顏色來(lái)判斷是否轉(zhuǎn)印完全或轉(zhuǎn)印過(guò)頭是不可靠的。五、免疫雜交反應(yīng)

17、1. 將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h即可。如果是自己配置的封閉液，最好過(guò)濾一下以消除固體雜質(zhì)。實(shí)際經(jīng)驗(yàn)表明與其封閉過(guò)夜，不如一抗孵育過(guò)夜，具體原因可以參考這個(gè)帖子：2. 將一抗用封閉液稀釋?zhuān)ㄒ话阌梅忾]液稀釋即可，如果背景不高用TBST稀釋也可以，當(dāng)然熟練后還可以自由發(fā)揮，配制一些自己的復(fù)方稀釋液）至適當(dāng)濃度（可以在1.5mlEP管中配置工作液，常用稀釋倍數(shù)為1:200，1:500，1:1000，具體需要預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索，用后可回收重復(fù)用23次，但回收重復(fù)利用的效果如何就要看抗體的質(zhì)量，分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應(yīng)在23天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。）；撕下適當(dāng)大小

18、的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡（也可使用手術(shù)室的病理袋，質(zhì)量不錯(cuò)，減去下面的折疊部分，用封口器（4080元一個(gè)）封上，不漏液即可）。37°孵育1h之后轉(zhuǎn)移到室溫下再孵育1h（或者4°孵育過(guò)夜），用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。也可以多洗幾次，比如4次，每次5min。3. 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入二抗稀釋液（10ml足夠了，一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋?zhuān)?，放在搖床上，室溫

19、下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。選擇好一個(gè)合適的條件不要輕易改變，另外相比一抗，二抗作用的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，實(shí)踐證明一抗時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)可能沒(méi)什么關(guān)系，而二抗時(shí)間若過(guò)長(zhǎng)過(guò)短都將會(huì)直接影響結(jié)果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影是背景可能臟。六、化學(xué)發(fā)光（ECL），顯影，定影1. 現(xiàn)在工作臺(tái)上鋪一張保鮮膜，將PVDF膜放在保鮮膜上。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合（注意吸完A試劑后吸B試劑前要患槍頭），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應(yīng)12min后，將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后轉(zhuǎn)移到在X片夾

20、中預(yù)先鋪好的保鮮膜上一側(cè)，把另一側(cè)翻過(guò)來(lái)蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。2. 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中；在紅燈下取出X光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大1cm）；打開(kāi)X-光片夾，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min到2min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果（也有人重疊壓好幾張片，固定曝光510分鐘，從這好幾張片中選出最合適的底片）；曝光完成后，打開(kāi)X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為12min（2025

21、），溫度過(guò)低時(shí)（低于16）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為510min，以膠片透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干（注意：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響）。X光片一般選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用柯達(dá)X-OMATBT膠片 。顯影液和定影液最好每周配置一次，避光室溫保存，顯影和定影液是最便宜的試劑了，千萬(wàn)不要因?yàn)樗绊懥苏麄€(gè)結(jié)果。七、凝膠圖象分析將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，比如bio-rad的Quantity One。如何使用請(qǐng)看這里。主要參考資料：1

22、、WB實(shí)戰(zhàn)指南+正確使用Quantity One定量 by jacqueslm2001 2、Abcam的western新手指南 3、土豆網(wǎng)的western blot視頻 上海交大出品 4、分子克隆實(shí)驗(yàn)指南精編版 化學(xué)工業(yè)出版社5、抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南科學(xué)技術(shù)出版社6、milipore的western blot的優(yōu)化方案 7、Western blot步步看(網(wǎng)絡(luò)流傳最廣的資料) 作者不詳 8、Bio-rad 蛋白印跡手冊(cè) 9、窮人的勞斯萊斯-我的五年western blot體會(huì) by seagate 附：Western Blot Quick Guide（以及一天跑完Western的時(shí)間規(guī)劃）前期準(zhǔn)備

23、：蛋白已經(jīng)定量，各樣本已經(jīng)稀釋到某固定濃度，已經(jīng)和SDS loading buffer混合，已經(jīng)分裝好，保存與-20°。頭天下午或晚上配膠，分離膠和濃縮膠一起配好，帶上梳子，放入潮濕的自封袋內(nèi)放入4°冰箱備用。8:00 從冰箱里取出蛋白樣品，用PCR儀95度加熱5min?；旌暇鶆虿㈦x心。8:30 取出昨晚配好的膠，組合，加電泳液。在電泳液里拔梳子能稍微容易一些。用10ul的槍加樣。9:00 開(kāi)始電泳。恒流30mA一般1個(gè)小時(shí)足夠了。9:30 開(kāi)始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜用的濾紙和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。一般8cm的寬是固定的，所以如果要裁膠的話(huà)可以先大概估計(jì)一下。10:10 電泳結(jié)束

24、（假設(shè)電泳用了70分鐘），起開(kāi)玻璃板，裁出膠上所要的條帶，如果整塊膠轉(zhuǎn)就更方便了。把膠放在盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的培養(yǎng)皿里。11:00 轉(zhuǎn)膜開(kāi)始（這里裁紙和鋪三明治還是比較費(fèi)時(shí)間的，我一般要用30分鐘到50min，所以這里要抓緊時(shí)間）。12:00 轉(zhuǎn)膜結(jié)束（這里按60min的半干轉(zhuǎn)的時(shí)間來(lái)計(jì)算）。開(kāi)始封閉1h。13:00 封閉結(jié)束，開(kāi)始孵育一抗（在這里你可以選擇一抗孵育過(guò)夜，如果不過(guò)夜的那一天就能結(jié)束），如果不過(guò)夜的話(huà)我一般選擇37° 1h然后在室溫（23°左右）再1h。15:00 一抗孵育結(jié)束。TBST洗滌3*10min或者5*6min。15:30 開(kāi)始孵育二抗。室溫1h足夠了。

25、16:30 二抗孵育結(jié)束。TBST洗滌3*10min或者5*6min，這里推薦采用5*6min。17:00 ECL發(fā)光，壓片10min，顯影1min，定影10min，那么在18:00之前你就能看到結(jié)果了，呵呵，如果結(jié)果不好還有后招，用stripping（一抗二抗洗脫液）洗滌，我用的是碧云天的堿性一抗二抗洗脫液，按照說(shuō)明書(shū)來(lái)一般20min就行，然后洗滌幾次，重新封閉1h，然后一抗過(guò)夜，明日在繼續(xù)戰(zhàn)斗。這樣的話(huà)18:30之前也能結(jié)束戰(zhàn)斗了。 Western Blot(免疫印跡法)（圖）主要包括以下 4 個(gè)基本步驟：樣品制備；電泳分離；蛋白的膜轉(zhuǎn)移；免疫雜交與顯色蛋白檢測(cè)。溶液和試劑1.

26、1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA:1 mM ;PMSF: 1 mM;Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM;NaF: 1 mM3. 1X SDS 樣品緩沖液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于 25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚藍(lán)4

27、. 轉(zhuǎn)移緩沖液：25 mM Trisbase, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)5. 10X Tris緩沖鹽 (TBS)：準(zhǔn)備1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80 g NaCl；用1N HCl調(diào)pH為 7.67. 甲醇8. TBS/T緩沖液：1X TBS, 0.1% Tween-209. 封閉緩沖液（TBS/T）：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v脫脂奶粉或BSA10. 一抗的稀釋?zhuān)?X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或 5%脫脂奶粉( 單抗)。Note： 一般來(lái)說(shuō)，BSA被推薦用于多克隆抗體，脫

28、脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比。預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker，可用于監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)膜的效率。樣品制備原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為 定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。1培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。2棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。3加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate,100l /w或 75 cm2 plate,500- 1000l/瓶) ，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。4超聲 1015秒剪切DNA以減低樣品粘性。5煮沸樣品5 minutes。6離心12000g，5 min，取上清

29、。7電泳分離：上樣15l20l 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。 如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平， 應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2  flask)裂解細(xì)胞， 收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻415min，14000g離心15min（4），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。注意：一般上樣2030 g已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量 至100g，但電泳條帶

30、易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法） 轉(zhuǎn)膜雜交膜的選擇是決定 Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn) 移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起， 但在非離子型的去污劑作用 下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔 徑的 NC 膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，

31、膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。 通常用 0.45 m 和 0.2m 兩種規(guī)格的 NC 膜。 大于20kD 的蛋白可用 0.45m 的膜， 小于 20kD的蛋白就要用 0.2  m 的膜了， 如用0.45 m 的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低 分子量蛋白的檢測(cè)。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和 1-5 秒鐘。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易， 轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的 操作步驟。1. 將膠浸于轉(zhuǎn)

32、移緩沖液中平衡 10min。 注意：如檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 如用P VDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治： 海綿 3 層濾紙 膠 膜 3 層濾紙 海綿， 每層放好后， 用試管趕去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對(duì)黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液， 插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜免疫雜交與顯色1用25 ml TBS

33、洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。2置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng)。315mlTBS/T洗3次（5 min/T）。4加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過(guò)夜，緩慢搖動(dòng)。515 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。6加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的二 抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。715 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。815 ml TBS洗1次。9蛋白檢測(cè)( 顯色法或發(fā)光法，按相應(yīng)試劑說(shuō)明操作) 。注意事項(xiàng)：1操作中戴手套，不要用手觸膜。2PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不要超過(guò)5秒。3如檢測(cè)小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2m的

34、膜，并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。4某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。5關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.33% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。6如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測(cè)后可進(jìn)行蛋白染色。7如要同時(shí)檢測(cè)大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知

35、表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。一、原理與Southern或Northern雜交方法類(lèi)似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平

36、的表達(dá)。二、試劑準(zhǔn)備1. SDS-PAGE試劑:見(jiàn)電泳實(shí)驗(yàn)。2. 勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4  0.24g；加ddH2O至1000ml。5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5

37、%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。6. 顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H2O2 1.0l。三、操作步驟1. 蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過(guò)電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。2. 電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。3. 轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移） 電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。 膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜

38、緩沖液中10min。 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2 ，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開(kāi)電源將膜取出,割取待測(cè)膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對(duì)比。四、免疫反應(yīng)：1. 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。2. 加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。3. 棄包被液，用0.01

39、M PBS洗膜，5min×3次。4. 加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋?zhuān)后w必須覆蓋膜的全部），4 放置12hr以上。陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。5. 棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。6. 加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M  PBS稀釋?zhuān)?，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。7. 棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。8. 加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。四、注意事項(xiàng)1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，在同一個(gè)抗體公司，可能會(huì)有好幾種，甚至好幾十種；在不同的抗體公司，那就更多了。那怎樣在琳瑯滿(mǎn)目的抗體中，選擇自己實(shí)驗(yàn)需要的抗體呢？主要考慮如下幾種因素：分析自己實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法是哪種？分析自己實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本的種屬是哪種動(dòng)物或人的？分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，分析抗體的標(biāo)記和檢測(cè)，分析抗體的宿主來(lái)源種屬