對(duì)于誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞

1、摘要：對(duì)于誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）的可靠和有效的方法一直是研究的熱點(diǎn)，本次試驗(yàn)主要在于動(dòng)物模型的研究，這種動(dòng)物模型允許測(cè)試新穎的疫苗策略并且最終實(shí)現(xiàn)一個(gè)更有效率的臨床試驗(yàn)的計(jì)劃。在這里，由一串部分重疊的CTL表位（20個(gè)人，3只貓猴和1只老鼠）傳遞和表達(dá)人類免疫缺陷病毒（HIV） 疫苗候選人被創(chuàng)建通過(guò)使用質(zhì)體DNA和被修改病毒安卡拉（MVA；一個(gè)衰減痘苗病毒）,它們是兩種可接受的疫苗工具為了在人類使用。在老鼠中，在單一的靜脈肌肉注射后這些疫苗被表現(xiàn)誘導(dǎo)病毒特異性干擾素的產(chǎn)生和細(xì)胞毒CD8+TI田 胞，隨著免疫試驗(yàn)方案被尋找來(lái)提高誘導(dǎo)特異性的 HIV白T細(xì)胞水平， DNA首要的-MVA的提

2、升被發(fā)現(xiàn)作為最有力的試驗(yàn)方案，這種多態(tài)表 位的DNA也引出CTL當(dāng)用Accell?基因槍傳遞裝置在細(xì)胞內(nèi)傳送。基因傳遞裝置（基因槍），最后，一個(gè)組合的內(nèi)部的基因槍 DNA HMVA 疫苗方法誘導(dǎo)在貓猴高頻率的循環(huán) CTL,這種高頻率CTL與在猴子所 觀察到的猿類免疫缺陷病毒（SIV）感染的猴子。對(duì)這種方法的優(yōu)化在 非人類的靈長(zhǎng)類也正在進(jìn)行，因此，為了有效的引出CTL一個(gè)免疫的方 法已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，這種方法很可能促進(jìn)這些淋巴細(xì)胞在控制SIV和HIV感染中起評(píng)價(jià)的作用。關(guān)鍵詞： HIV 疫苗； CTL 多態(tài)位； DNA 首要的 MVA 的提高1.引言一個(gè)有效的疫苗是最希望來(lái)控制獲得性免疫缺陷病綜合癥（

3、AIDS）的恐慌。通過(guò)保護(hù)免疫組織不被人體免疫缺陷病毒 （HIV）感染 的這種疫苗將起幫助的作用，盡管一個(gè) HIV疫苗可能誘導(dǎo)CD8+和 CD4+ T 細(xì)胞的反應(yīng)，以及中和抗體，但是缺乏這些誘導(dǎo)的人群中也能說(shuō)明這些組成成分在保護(hù)中的作用。對(duì)于這種方法最主要的障礙是在于識(shí)別足夠地高的CD8+T 細(xì)胞的反應(yīng)，和識(shí)別抗體中和最初的HIV 分離。識(shí)別這些反應(yīng)的疫苗作為重大進(jìn)展朝著預(yù)防HIV 感染或衰減它的方向，從而長(zhǎng)期地延緩HIV 的發(fā)作。CD8 +T 細(xì)胞在參與機(jī)體的防御不止一個(gè)方面：它們通過(guò)殺傷被感染的細(xì)胞來(lái)阻止病毒的繁殖，和分泌一系列的細(xì)胞因子如IFN-r 和腫瘤壞死因素，直接或間接有助于控制病

4、毒的感染。這一新興的數(shù)據(jù)顯示在CD8 +T 細(xì)胞艾滋病病毒感染所有階段起到了核心的保護(hù)作用： CD8 +T 細(xì)胞的存在而不是與起初感染的病毒血癥控制有關(guān)的中和抗體；他們很容易發(fā)現(xiàn)許多無(wú)癥狀的個(gè)體和圍繞著的細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞（CTL）多次與逆轉(zhuǎn)病毒的聯(lián)系，艾滋病的CTL逃逸突變體在某些情況惡化被孤立；隨著疾病的進(jìn)展細(xì)胞毒性的降低；在未感染的的人群中CTL 被發(fā)現(xiàn)，但是已經(jīng)感染HIV 的婦女和在未受感染的攜帶 HIV 病毒的母親所生嬰兒（這句不會(huì)翻譯）。這是公認(rèn)的為了實(shí)際的和安全的原因，病毒的亞單位而不是全滅活或者是被減弱的艾滋病病毒的制劑極有可能被用來(lái)作為AIDS的疫苗。 抗原表位的使用來(lái)自幾個(gè)

5、不同的蛋白在蛋白質(zhì)數(shù)量上的降低了或在接種疫苗時(shí)遺傳物質(zhì)的傳遞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答集中在主要的或者保守的蛋白質(zhì)區(qū)域，降低非重疊的區(qū)域（免疫致病原或者免疫抑制）和篩 選混合的單一的多態(tài)位點(diǎn)（分支疫苗）。表位疫苗的障礙是MHC的抗原決定簇，這些抗原決定簇引起不同的 T細(xì)胞具有不同的抗原表位。然而， 據(jù)估計(jì)五個(gè)常見(jiàn)的人類白細(xì)胞抗原類型可能在白人和東方的人群中包括 80-90% ，和由9個(gè)人類白細(xì)胞抗原分子的表位會(huì)被要求對(duì)于一般人群覆蓋面無(wú)關(guān)種族血統(tǒng)，如果每個(gè)人超過(guò)一個(gè)相關(guān)的表位被需要，一個(gè)廣泛有效的表位疫苗的復(fù)雜性也會(huì)增加，而且是可行的。重點(diǎn)對(duì)新疫苗的策略的評(píng)估是使用動(dòng)物模型，小動(dòng)物模型對(duì)于起初的免疫原性研

6、究是有用的，這種研究使用大量的動(dòng)物的成本便宜。對(duì)于 HIV 和 AIDS 病毒而言，根據(jù)在疾病的嚴(yán)重性和防止病毒感染難點(diǎn)上， 為帶有免疫缺陷病毒的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的感染提供一系列的模型。這些模型從含有HIV-1 SF2 的黑猩猩的感染到含有SIV_mac的恒河猴的感染，這種感染很容易被中和抗體保護(hù)，受感染的部位在部分或完全地依賴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。這些模型允許免疫設(shè)計(jì)的重要方面和以更快、更便宜的方法對(duì)免疫方案的擬定與在人類中的研究進(jìn)行比較，并且最終提供更有效率的臨床研究計(jì)劃。此外，一個(gè)臨床前具有 AIDS 疫苗的人的進(jìn)展被描述。2 .實(shí)驗(yàn)設(shè)置2.1 DNA 多 CTL 表位疫苗一個(gè)艾滋病疫苗的

7、原型被構(gòu)造，這基于合成的基因編碼對(duì)于一系列部分重疊的表位，指定H區(qū)。這種CTL多表位肽蛋白質(zhì)有20個(gè)人的 表位（受12個(gè)不同的HLA等位基因的限制），3個(gè)貓猴表位和1個(gè)鼠表 位組成，因此在老鼠,獼猴和人類中同種疫苗可以被測(cè)試他們的CTL免疫原性（免疫遺傳性），為了使在老鼠中兩種不同的表位誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的T細(xì)胞，另一個(gè)多表位基因包含一個(gè)瘧原蟲(chóng)鼠科表位與 H基 因末端3%產(chǎn)生HM基因，直接無(wú)害的DNA是一種特異性的活性疫苗， 這種疫苗已成功用于誘導(dǎo)體內(nèi)的體液和細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，包括MHC-I 分子的 CD8+T 細(xì)胞，一種用于向量鍍通孔（一種新型的載體pTH被設(shè)計(jì)）DNA免疫被構(gòu)造，用于使H和HM

8、基因被插入。在瞬間轉(zhuǎn) 染的培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)這些載體表達(dá)高水平的重組多肽。用DNA疫苗在老鼠靜脈肌肉注射產(chǎn)生細(xì)胞毒性因子（ 23% 殺死在靶細(xì)胞比率為100:1）和干擾素r的產(chǎn)生（300每106脾細(xì)胞）CD8+T細(xì)胞特異性對(duì)于兩鼠表 位。2.2 . MVA多CTL表位疫苗MVA是一種減弱痘苗病毒應(yīng)變而在雞胚細(xì)胞生長(zhǎng)得很好，但實(shí)質(zhì) 上失去了它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制的能力，此外， MVA已失去了幾個(gè) 基因編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白如可溶性的載體對(duì) IFN-r, IFN a:b,腫瘤壞死因 子，CC趨化因子。更為重要的是，MVA已經(jīng)被證實(shí)是安全被用于超過(guò) 120萬(wàn)人類。重組的MVA攜帶H和HM基因被構(gòu)建，靜脈注射小鼠（i

9、.v.） or i.m. 使用單一劑量的106血小板形成單位（pfu） of MVA和CTL的誘導(dǎo)被估 計(jì)。研究結(jié)果表明兩種方式誘導(dǎo)特異性的 CTL反應(yīng)持續(xù)了至少55天， 和在i.v.的途徑是緩和地比免疫遺傳比i.m.途徑多（分別42和33%正 在死亡，防御較多的HIV表位在靶細(xì)胞的比率100:1）。ex vivo脾淋巴 細(xì)胞的頻率產(chǎn)生干擾素與MHC I類分子結(jié)合被確定用ELISPOT分 析，每106脾細(xì)胞平均283和227個(gè)細(xì)胞各自在i.v. and i.m.的HIV表 位。3 .結(jié)果3.1 T細(xì)胞誘導(dǎo)的增強(qiáng)由一個(gè)起初的DNA MVA疫苗方法的提高 我們探究免疫的方案，該方案將能夠提高誘導(dǎo)H

10、IV特異性T細(xì)胞的水平。據(jù)發(fā)現(xiàn)之前的免疫對(duì)MVA 暴露， MVA 降低之前的效果和使用相同的疫苗的方法加強(qiáng)。然而，以動(dòng)物重組的方法是第一個(gè)帶有DNA的疫苗，和MVA提高是最有力的方案適合于在干擾素r的產(chǎn)生 （ 1000個(gè)細(xì)胞每106脾細(xì)胞）和細(xì)胞毒 （ 55%殺死靶細(xì)胞的比率是100：1） CD8+T細(xì)胞對(duì)兩個(gè)CTL表位的不利。3.2 Accell基因槍傳遞能夠在一種雙模型的疫苗方法替代 DNA的注射 基因槍介導(dǎo)的免疫傳遞被包裹的DNA金粉顆粒進(jìn)入表皮，一個(gè)主 要的免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)，和要求在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中少于100 1000的重復(fù)序列。通過(guò)內(nèi)部肌肉時(shí)有很多重要的優(yōu)勢(shì)， 具有多表位DNA載體的CTL的

11、有效誘導(dǎo)被實(shí)現(xiàn)通過(guò)疫苗，這種疫苗是使用基因槍或者重組疫苗的方法（70%殺死靶細(xì)胞的比率是100: 1）。因此，攜帶多CTL表位基 因的基因槍介導(dǎo)的免疫和能夠在 DNA起初MVA提高疫苗方案中替 代注射 DNA。3.3 在非靈長(zhǎng)類動(dòng)物中誘導(dǎo)高水平的CTL在過(guò)去， 一些在小鼠內(nèi)的疫苗免疫遺傳不能誘導(dǎo)在人體內(nèi)的免疫反應(yīng)。因此，測(cè)試多表位疫苗在人類的臨床試驗(yàn)是十分重要，這個(gè)疫苗含有一個(gè)MHC等位基因抑制SIV的表位和三個(gè)MHC等位基因激活SIV的表位，和三個(gè)Mamu-A*01陽(yáng)性 恒河猴使用PCR-SS限術(shù)被選 擇，以及用Accell基因傳遞裝置的DNA疫苗的二倍被用5x108pfu的 MVA （周1

12、7 22周）兩種胞內(nèi)免疫，在最后的免疫之后 PBL被隔離 一周，在細(xì)胞外的肽的表達(dá)和CTL 的溶解的確定。這種疫苗的方法誘導(dǎo)CTL的反應(yīng)，該反應(yīng)的結(jié)果是分別加入48,50和66%肽特異性與靶細(xì)胞的比率高各自是37:1,45:1 和 14:1, 35周溶血的淋巴細(xì)胞能夠裂解PHA刺激SIV感染的PBL。高頻率循環(huán)的SIV特異性T細(xì)胞被疫苗誘 導(dǎo)，這種T細(xì)胞被證實(shí)通過(guò)使用可溶性四聚體 Mamu-A*01-肽復(fù)合物和 波動(dòng)達(dá)到CD8+淋巴細(xì)胞的最大值1 % （未出現(xiàn)的結(jié)果），因此DNA 首要的MVA提高疫苗方案誘導(dǎo)的有效性和持續(xù)性地的高頻率的 CTL 不僅在小鼠中存在，而且在非人類的靈長(zhǎng)類的動(dòng)物與人

13、類的尺寸比較和免疫反應(yīng)比較接近，抵御SIV感染的疫苗有效性被檢測(cè)。人類CTL的克隆和對(duì)四種HLA限制HIV表位的方法用來(lái)檢測(cè)這些表位加工和呈遞的過(guò)程在受感染的具有MVA.H 或 MV.HM 人類細(xì)胞是可靠的，所有的這四個(gè)表位完全的來(lái)源于人類細(xì)胞，并且CTL 裂解這些敏感的受感染的靶細(xì)胞。4 . 討論4.1 為什么DNA-MV A方法誘導(dǎo)CTL是有效的？這項(xiàng)研究中通過(guò)篩選HIV 疫苗有幾種可能的原因?qū)τ谡T導(dǎo)有效的 CTL。 首先， 兩種疫苗接種于表皮，在表皮這些多表位蛋白被最大量的產(chǎn)生通過(guò)角質(zhì)化細(xì)胞和Langerhans 細(xì)胞。這些抗原呈遞細(xì)胞在抗原集中的部位是最有效的抗原識(shí)別和介導(dǎo)免疫反應(yīng)的細(xì)

14、胞，在老鼠體內(nèi)，比起在靜脈肌肉注射中這種免疫途徑是更有效的，其次，基本的免疫反應(yīng)是使用DNA 作為免疫工具，為了獲得起始的CTL 重組免疫原，簡(jiǎn)單的說(shuō)是因?yàn)閮H僅只是一個(gè)外源蛋白的表達(dá)，盡管重組天花病毒很可能有較多的免疫基因比DNA 載體作為免疫工具，但是病毒感染細(xì)胞能產(chǎn)生大量的病毒多肽位點(diǎn)由MHC I 類呈遞， MHC I 類分子能夠競(jìng)爭(zhēng)重組免疫原為CTL 免疫瞄定。以前，盡管所有的這些疫苗反應(yīng)是針對(duì)牛痘抗原，但是僅有少數(shù)的疫苗被免疫即用重組的疫苗對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行免疫。因此，提高 MVA， DNA 靶動(dòng)物已經(jīng)極大地提高特異性免疫原CTL 的活性。 第三， 使用 MVA 而不是牛痘病毒或天花病

15、毒是很有用的，由于特殊的免疫調(diào)節(jié)分子的爆發(fā)即MVA 的表達(dá)。 MVA 產(chǎn)生強(qiáng)烈的I 型干擾素反應(yīng)，這很可能用于CTL的表達(dá)，第四，這種特異性的多CTL, 表位在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中是無(wú)毒，歸因于一系列的多肽進(jìn)入大的胞囊泡中。細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間的產(chǎn)生免疫原，直到免疫應(yīng)答清除。最后， 一些機(jī)體出現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明具有不同的疫苗方法重組的疫苗方案，或者是對(duì)于免疫系統(tǒng)的抗原呈遞誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)時(shí)是十分有效的。4.2 CTL 怎樣預(yù)防免疫缺陷病毒的感染？CTL本身不能夠阻止受感染的宿主T細(xì)胞內(nèi)的病毒細(xì)胞，但是， 如果在相關(guān)的組織或者其周圍有高劑量的記憶 CTL呈遞細(xì)胞，和病毒 的感染性很低時(shí)，CTL能及時(shí)清除這些小量的感染細(xì)胞

16、在病毒迅速傳 染和產(chǎn)生子代病毒時(shí)。在人類中，能鑒別 HIV特異性的CTL反應(yīng)的發(fā) 生，但是未感染的類群上升的可能性，CTL可能保護(hù)或者防御HIV病毒的感染。在SIV貓猴模型中，控制SIV的感染與MHC I類分子的 Mamu-A*26等位基因有密切的聯(lián)系，使用四聚體復(fù)合物，同樣的 Mamu-A*01-被抑制肽在這次研究中被使用表明在受SIV感染的猴子中免疫占主導(dǎo)并地位，然而，到目前為止已經(jīng)有兩項(xiàng)研究攜帶疫苗誘導(dǎo)的 CTL 的動(dòng)物在抵制這種表位上遭到質(zhì)疑，和不完全地被保護(hù)，盡管有所下降在病毒被觀察到（S. Norley, Paul-Ehlrich 研究所），在這些研究中CTL 的水平可能比在我們所研究的動(dòng)物中低一些，預(yù)防 SIV感染的措施需要依靠疫苗誘導(dǎo)的CTL 的強(qiáng)度， 和 12-肽 p11C 被用來(lái)提高在以前的研究中可能已經(jīng)誘導(dǎo)潛在的CTL 反應(yīng)，抵制蛋白質(zhì)的表達(dá)的高水平的CTL 在再生循環(huán)中能更好的阻止感染比晚期結(jié)構(gòu)蛋5 .結(jié)論最初的多CTL 表位 AIDS 疫苗被構(gòu)建通過(guò)對(duì)這些疫苗的選擇為了適合應(yīng)用于人類，在老鼠中它們的免疫遺傳性被證明和一個(gè)混合的免疫方