異體脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合纖維蛋白BMP修復(fù)兔橈骨缺損(一)

1、異體脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合纖維蛋白 BMP 修復(fù)兔橈骨缺損 (一) 【摘要】 探討以纖維蛋白復(fù)合脫蛋白松質(zhì)骨作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP) 的載體修復(fù)兔節(jié)段性骨缺損。 方法于 36 只青紫藍(lán)兔兩側(cè)橈骨干處 造成1.5cm缺損，采用三種方法進(jìn)行處理：A組，植入脫蛋白松質(zhì)骨、 纖維蛋白、BMP的復(fù)合物；B組，植入脫蛋白松質(zhì)骨；C組，空白對(duì)照。 術(shù)后 2、 4、 8、 12、 16 周進(jìn)行放射學(xué)、組織學(xué)和電鏡檢查。 結(jié)果 A 組骨缺損區(qū)在成骨活潑程度、骨再生量和再生髓腔結(jié)構(gòu)等方面均顯著 優(yōu)于B組，使骨缺損得到了較徹底的修復(fù)。B、C兩組均不能產(chǎn)生骨性 愈合。結(jié)論脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合纖維蛋白是較理想的BMP載體材

2、料，以三者的復(fù)合物修復(fù)骨缺損可到達(dá)滿意效果?！娟P(guān)鍵詞】脫蛋白松質(zhì)骨纖維蛋白 BMP組織工程骨缺損修復(fù) AbstractObjectiveTorepairsegmentalbonedefectwiththecompositeofdeproteinisedcancellous bone,bonemorphogeneticprotein(BMP)andfibrin. Method Bonedefectswerecreatedin36NewZealandrabbitsonthebilateralradiiandtre atedwiththreekindsofimplantations:A,compos

3、iteofdeproteinisedcancellous bone,BMPandfibrin;B,ofdeproteinisedcancellousbone;C,blankcontrol.Thed efectswereobservedbyentgenography,opticalmicroscopy,andelectron-micr oscopyat2,4,8,12,16weeks.ResultThedefectstreatedwithAimplantationregeneratedmuchmorenewboneandb ridgedearlierthanthedefectstreatedwi

4、thBimplantationandgotcompletelyrepaired16weeksafteroperation.ThedefectswithBandCimplantationcouldn' tgetosseoustissuehealing. Conclusion Thecompositeofdeproteinisedcancellousbone,bonemorphogeneticprotein( BMP)andfibrincanbeeffectivelyusedtorepairsegmentalbonedefect.Keywords ： deproteinisedcancel

5、lousbone;fibrin;bonemorphogeneticprotein(BMP);tiss ueengineering;bonedefect;repair 骨具有再生和修復(fù)能力，因腫瘤切除、外傷、骨異常生長所造成的骨 缺損，在單純依靠骨自行修復(fù)無法愈合的情況下， 那么需采用手術(shù)治療。 自體骨移植是一種較好的治療方法，已被廣泛應(yīng)用于臨床。但其來源 有限，不能滿足臨床需求，而且對(duì)患者造成創(chuàng)傷，于是人們把眼光轉(zhuǎn) 向能促進(jìn)組織或細(xì)胞生長、分化和增殖的材料。本實(shí)驗(yàn)就異體脫蛋白 松質(zhì)骨復(fù)合纖維蛋白、 BMP 修復(fù)兔橈骨缺損的方法和機(jī)制進(jìn)行探討， 以評(píng)價(jià)復(fù)合材料作為骨組織工程材料的作用。1 材料和

6、方法1.1 植入材料的制備1.1.1 異體松質(zhì)骨的制備取青紫藍(lán)兔 (蘭州生物制品研究所提供 )脊柱骨、 骨盆骨、長骨干骺端，剔除骨膜和軟組織，去除其外表皮質(zhì)骨，制成 直徑約O.5cmx O.5cmx 0.5cr大小松質(zhì)骨顆粒，用流動(dòng)自來水反復(fù)沖洗 骨粒45h,致無血漬浸出為止，將其放入蒸餾水三角瓶中，搖床上震 動(dòng)45h。其間每30min換蒸餾水一次，再將其放入超聲波清洗機(jī)中反復(fù)進(jìn)行清洗，每次30min，清洗35次，自然晾干后，將其放入甲醇 與氯仿(1 : 1)混合液中，不時(shí)攪拌，12h更換混合液，倒棄混合液，蒸 餾水沖洗骨粒3次，自然晾干。用0.6mol/LHCL脫鈣5min，蒸餾水沖 洗3次

7、，自然晾干，轉(zhuǎn)入30%過氧化氫中，不時(shí)攪拌，12h更換過氧化 氫液一次，處理24h,蒸餾水沖洗3次，自然晾干，轉(zhuǎn)入-80 C深低溫 冰箱冷凍保存。及纖維蛋白的提取按照 Urist 1報(bào)道的方法從小牛新鮮皮 質(zhì)骨中提取，提取物置-4C保存。纖維蛋白原用冷沉淀法自同種異體兔 的血液中提取2。采集 1 5只健康成年青紫藍(lán)兔的抗凝全血并于 3000r /min，離心10min,別離出血清，置-30C冰箱凍存過夜，次日轉(zhuǎn)入4C 冰箱緩慢融解，待徹底融解后，于4C條件下離心，收集冷沉淀。冷沉 淀用冷凍枯燥機(jī)凍成干粉,再用重蒸水溶解,配成120mgml 的纖維蛋白原溶液。脫蛋白松質(zhì)骨/ BMP復(fù)合物的制備將

8、深低溫保存的異體脫蛋白松 質(zhì)骨取出，冷凍枯燥機(jī)枯燥，裝入培養(yǎng)皿中，1.0 x 106rads60CS照(蘭 州輻照中心)，將100mg提取的小牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶于10mL的 4mol/L 的鹽酸胍溶液中，參加10g異體松質(zhì)骨顆粒，4 C,充分?jǐn)嚢杌靹蛞后w 與固體成分，置冷凍枯燥機(jī)內(nèi)抽真空、透析、凍干24h,分裝。脫蛋白松質(zhì)骨/ BMP/纖維蛋白復(fù)合物的制備將處理好的異體脫 蛋白松質(zhì)/BMP復(fù)合物置于圓柱形模板內(nèi)，浸沒于纖維蛋白原中，按 纖維蛋白膠的制備比例混入凝血酶,復(fù)合支架制備成功。1.2試驗(yàn)方法選用青紫藍(lán)兔36只，體質(zhì)量23kg不等，雌雄不限，隨 機(jī)分為3組。在無菌手術(shù)室中，速眠新-H麻醉

9、滿意后，常規(guī)去毛、消 毒、鋪巾。取前臂縱行切口，長約 34cm,行雙側(cè)橈骨中段截骨，造 成 15mm 的骨和骨膜缺損，分別按組植入材料。具體分組見下表。創(chuàng) 口縫合,肢體不做固定。將其分籠飼養(yǎng),自由活動(dòng)。術(shù)后肌注慶大霉 素預(yù)防感染。分別于術(shù)后 4、 8、 12、 16 周取材,每次 3 只。表 1 試驗(yàn) 分組情況表左側(cè)右側(cè)數(shù)量A脫蛋白松質(zhì)骨/rhBMP/纖維蛋白復(fù)合物脫蛋 白松質(zhì)骨 /rhBMP/1.3觀察指標(biāo)1.3, 1X 線檢查各組動(dòng)物于手術(shù)當(dāng)日和取材日拍雙側(cè)尺、 橈骨正側(cè)位片, 觀察各組內(nèi)及組間術(shù)后不同時(shí)間的骨缺損愈合情況。組織學(xué)觀察取材標(biāo)本用 10%甲醛溶液固定,常規(guī)脫鈣、脫水、石 蠟包

10、埋、連續(xù)切片,行 HE 染色,光鏡下觀察骨缺損愈合情況。掃描電鏡觀察術(shù)后16周取A組標(biāo)本，生理鹽水漂洗，2.5%戊二醛 固定，O.1mol/L磷酸緩沖液漂洗3次后用1%鋨酸固定2h, 50%、70%、 80%、90%、95%丙酮梯級(jí)脫水各15min,醋酸異戊酯15min浸泡，干 燥,鍍膜,電鏡觀察。大體標(biāo)本各組動(dòng)物于取材當(dāng)日拍攝大體標(biāo)本,觀察其大體愈合情 況。2 結(jié)果2.1X線檢查A 組術(shù)后 4 周骨缺損兩端有少量密度較低的骨痂形成， 缺損區(qū)呈大片云 霧狀影，密度低于骨干；術(shù)后 8 周新骨橋接骨缺損，密度均勻，形成 連續(xù)性骨痂；術(shù)后 12周骨皮質(zhì)已完整形成， 髓腔未完全形成； 術(shù)后 16 周骨性連接形成，髓腔再通。B組術(shù)后4周缺損區(qū)大片云霧狀影，密度低于骨干，兩斷端有骨痂形成； 術(shù)后 8 周缺損區(qū)