分子生物學實驗報告

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)分子生物學實驗分子生物學實驗 院系：院系：生命科學與技術(shù)學院生命科學與技術(shù)學院 專業(yè)：專業(yè)： 生物科學（基地）生物科學（基地） 班級：班級： 班班 學號：學號： 姓名：姓名： 精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)分子生物學基礎實驗分子生物學基礎實驗分子生物學實驗技術(shù)已成為生物化學及分子生物學以及相關(guān)學科院系教學科研不可缺少的一部分。為提高學生在分子生物學技術(shù)方面的動手能力，生物技術(shù)綜合實驗室主要開設常用而基本的分子生物學實驗技術(shù)。它的內(nèi)容包括質(zhì)粒 DNA 的制備；DNA 的重組；PCR 基因擴增等等。 實驗一實驗一 質(zhì)粒質(zhì)粒 DNA 的小量制備的

2、小量制備一、實驗原理一、實驗原理 要把一個有用的外源基因通過基因工程手段，送進細胞中去進行繁殖和表達，需要運載工具，攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具就叫載體（vector） 。載體的設計和應用是 DNA 體外重組的重要條件。作為基因工程的載體必須具備下列條件:(1)是一個復制子，載體有復制點才能使與它結(jié)合的外源基因復制繁殖；（2）載體在受體細胞中能大量增殖，只有高復制率才能使外源基因在受體細胞中大量擴增；（3）載體 DNA 鏈上有 1 到幾個限制性內(nèi)切酶的單一識別與切割位點，便于外源基因的插入；（4）載體具有選擇性的遺傳標記，如有抗四環(huán)素基因（Tcr） ，抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它

3、是否已進入受體細胞，也可根據(jù)這個標記將受體細胞從其他細胞中分離篩選出來。細菌質(zhì)粒具備上述條件，它是基因工程中常用的載體之一。質(zhì)粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小在 1120kb 之間，具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 DNA 分子，主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中。質(zhì)粒具有自主復制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達它攜帶的遺傳信息。它可獨立游離在細胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細菌染色體中，它離開宿主的細胞就不能存活，而它控制的許多生物學功能也是對宿主細胞的補償。質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復制，一般分為兩種類型：嚴密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxe

4、d control） 。前者只在細胞周期的一定階段進行復制，染色體不復制時，它也不復制。每個細胞內(nèi)只含有 1 個或幾個質(zhì)粒分子。后者的質(zhì)粒在整個細胞周期中隨時復制，在細胞里，它有許多拷貝，一般在 20 個以上。通常大的質(zhì)粒如 F 因子等，拷貝數(shù)較少，復制受到嚴格控制。小的質(zhì)粒，如 ColE 質(zhì)粒（含有產(chǎn)生大腸桿菌素 E1 基因） ，拷貝數(shù)較多，復制不受嚴格控制。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素時，染色體 DNA 復制受阻，而松弛型 ColE質(zhì)粒繼續(xù)復制 1216h，由原來 20 多個拷貝可擴增至10003000 個拷貝，此時質(zhì)粒 DNA 占總 DNA 的含量由原來的 2增加到精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你

5、奉上專心-專注-專業(yè)4050。本實驗分離提純化的質(zhì)粒 pBR322、pUC19 就是由 ColE 衍生的質(zhì)粒。所有分離質(zhì)粒 DNA 的方法都包括三個基本步驟:培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質(zhì)粒 DNA。采用溶菌酶可破壞菌體細胞壁，十二烷基硫酸鈉（SDS）可使細胞壁解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細菌染色體 DNA 纏繞附著在細胞壁碎片上，離心時易被沉淀出來，而質(zhì)粒 DNA 則留在清液中。用乙醇沉淀、洗滌，可得到質(zhì)粒 DNA。質(zhì)粒 DNA 的相對分子量一般在 106107范圍內(nèi)，如質(zhì)粒 pBR322 的相對分子質(zhì)量為 2.8106，質(zhì)粒 pUC19 的相對分子質(zhì)量為

6、1.7106。在細胞內(nèi)，共價閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，簡稱 cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫做開環(huán) DNA（open circular DNA，簡稱 ocDNA） 。在電泳時，同一質(zhì)粒如以cccDNA 形式存在，它比其開環(huán)和線狀 DNA 的泳動速度快，因此在本實驗中，自制質(zhì)粒DNA 在電泳凝膠中呈現(xiàn) 3 條區(qū)帶。二、實驗目的二、實驗目的1掌握最常用的提取質(zhì)粒 DNA 的方法和檢測方法。2了解制備原理及各種試劑的作用。三、實驗材料和試劑三、實驗材料和試劑材料：大

7、腸桿菌 E.coli，含 pBR322 質(zhì)粒。試劑：1. LB 培養(yǎng)基：10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10g/L NaCl，用 NaOH 調(diào) pH 至7.3 左右。如固體培養(yǎng)基則添加 15g/L 瓊脂。2. 溶液（pH8.0G.E.T 緩沖液）：50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。滅菌后存放。3. 溶液（0.2mol/LNaOH(內(nèi)含 1SDS)）：預先配制 1SDS 母液，臨用前一天晚上加入 0.2mol/LNaOH，4保存。4. 溶液（pH4.8 乙酸鉀溶液）：5mol/L 乙酸鉀 60mL、冰乙酸 11.5mL、雙蒸餾水

8、28.5mL。5. 酚/氯仿液(V/V1/1)：酚為重蒸酚，配制時，先將氯仿中加入異戊醇，使其體積比為 24:1，然后等量的加入重蒸酚，混勻，并用 0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提幾次精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)以平衡這一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆蓋等體積的 0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4保存。6. 無水乙醇7. 70乙醇8. pH8.0 TE 緩沖液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含 RNA 酶20g/mL。儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、臺式高速離心機、臺式小型振蕩器、

9、EP 管(1.5mL 微量離心管)、加樣器(20uLlmL)、吸頭。四、操作步驟四、操作步驟（一）培養(yǎng)細菌將帶有質(zhì)粒 pBR322 的大腸桿菌接種在含 50g/mL 氨芐青霉素(Amp)的 LB 液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。注意：添加 Amp 時，須待 LB 培養(yǎng)基冷卻到 50左右方可加入。（二）從菌落中快速提取制備質(zhì)粒 DNA1取 1.4mL 菌液置于 1.5mL Ep 管中，7500rpm 離心 1min。2棄上清，加入 150L GET 緩沖液，在渦旋混合器上充分混勻，在室溫下放置10min。3加入 200L 新配制的 0.2mol/L NaOH(內(nèi)含 1SDS)，加蓋，顛倒（不要振

10、蕩）23 次，使之混勻，冰上放置 4min，最多不能超過 5min。4加入 150L 冰冷的乙酸鉀溶液。加蓋后，顛倒數(shù)次使之混勻，冰上放置 15min。510000rpm 離心 5min，上清液吸至另一干凈的 1.5mL Ep 中，如上清液渾濁則需重新離心一次。6于上清液中加等體積酚/氯仿液，振蕩混勻，12000rpm 離心 2min，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另一 1.5mL Ep 管中，注意勿將兩液相中間的白色蛋白薄層吸出。7向上清液加入 2 倍體積無水乙醇，混勻，室溫放置min。用離心機于 10000rpm離心 5min。倒去上清液。8用 0.5mL 70乙醇洗滌沉淀一次，10000rpm

11、離心 3min，除盡乙醇，室溫自然干燥(將離心管倒置于一張紙巾上)，備用。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)9用 30uL 含無 DNA 酶的胰 RNase(20 ugmL)的 TE 重新溶解 DNA，置于 4保存，供下午電泳使用。這里因為要檢測質(zhì)粒是否提取成功以及提取質(zhì)粒的濃度，故在此要進行一次電泳，下面為瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法：原理：原理：根據(jù) DNA 分子量不同，采用外加電場使其分開，用 EB 嵌入 DNA 分子后在紫外下顯熒光。而熒光強度正比于 DNA 的含量，如將已知濃度的標準樣品表 21 作為電泳對照，就可以估計出待測樣品的濃度。電泳后的瓊脂凝膠糖直接在紫外燈下拍照，只

12、需要510ngDNA，就可以從照片上比較鑒別。由于電泳時所用的樣品量非常少，只要將濃度控制在幾十納克即可，所以在基因工程中經(jīng)常被用做檢測 DNA 樣品。表 21 DNA/ Hind 中 DNA 片斷總 DNA 含量為 100%瓊脂糖凝膠板的制備瓊脂糖凝膠板的制備1瓊脂糖凝膠的制備稱取 1.0g 瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入 100mL TBE 緩沖液，于電爐上加熱，注意：防止溢出，由于瓊脂糖較難溶解，如果水分損失較大，則補充一定量的蒸餾水，使其終濃度為 1。片段堿基對數(shù)目/kb相對分子質(zhì)量DNA 含量/ %DNA 含量/(ng/mg)123.13015.010647.7476.929.4196.

13、1210619.4194.136.5574.2610613.5135.244.3712.84106989.952.3221.511064.847.962.0281.321064.241.870.5640.371061.111.680.1250.081060.32.6精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)2膠板的制備將有機玻璃內(nèi)槽洗凈、晾干。取膠帶紙將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好，形成一個邊腳模子。注意：將橡皮膏緊貼在有機玻璃內(nèi)槽兩端邊上，不能留空隙。將有機玻璃內(nèi)槽置于水平位置，放好樣品槽模板(一般稱之為梳子)，將冷卻至 65左右的瓊脂糖凝膠，小心地倒在內(nèi)槽上，控制灌膠速度，使膠液緩慢地展開，

14、直到整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置 1h 左右，待凝固完全后，輕輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽。將有機玻璃內(nèi)槽放入電泳槽中，加入 0.5TBE 電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。膠板內(nèi)的樣品小槽3加樣用移液槍將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每次加完一個樣品為了避免交叉污染，各樣品用不同的槍頭，以免造成限制酶被污染。加樣時，槍頭不要插入膠板內(nèi)，防止碰壞樣品槽周圍的凝膠面，每個樣品槽的加樣量不宜過多，本實驗加樣為 10uL 左右。(每塊膠板需點一個 Marker，這里即為 DNA/ Hind )4電泳加完樣品后應立即通電，進行恒壓電泳。在低壓條件下，線形 D

15、NA 片段的遷移速度與電壓成比例關(guān)系，為了獲得電泳分離 DNA 片段的最大分辨率，電場強度不應高于5V/cm。當溴酚藍染料（藍色）移動到距離膠板下沿約 12cm 處，停止電泳。5染色將電泳后的凝膠浸入 EB 染液中，進行染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的 DNA 帶。染色20min 后，用大量水沖洗。6觀察在波長為 254nm 的紫外燈下，觀察染色后的電泳凝膠。DNA 存在處顯示出紅色熒光條帶。用凝膠自動成像儀處理代替。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)五、注意事項五、注意事項1收集菌體提質(zhì)粒前，培養(yǎng)基要去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮。2在添加溶液與溶液后溶液的混合一定要柔和，采用上

16、下顛倒的方法，千萬不能在旋轉(zhuǎn)器上劇烈振蕩。其中加入溶液后，溶液變成澄清，并有黏性；加入溶液后，出現(xiàn)絮狀沉淀。3苯酚具有腐蝕性，能造成皮膚的嚴重燒傷及衣物損壞，使用時應注意。如不小心皮膚上碰到苯酚則應用堿性溶液、肥皂及大量的清水沖洗。4苯酚可以用于抽提純化 DNA，由于苯酚的氧化產(chǎn)物可以使核酸鏈發(fā)生斷裂。所使用的苯酚在使用前必須經(jīng)過重蒸，且都必須用 0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)進行平衡。所以取酚/氯仿/異戊醇時應取下層溶液，因為上層是 Tris-HCl 液隔絕空氣層。5酚/氯仿/異戊醇抽提時，應充分混勻。經(jīng)酚/氯仿/異戊醇抽提后，吸取上清液時注意不要把中間的白色層吸入，其中含

17、有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。6實驗中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且與之接觸的吸頭、Ep 管，全部棄用，不回收。7有些質(zhì)粒本身可能在某些菌種中穩(wěn)定存在，但經(jīng)過多次移接有可能造成質(zhì)粒丟失。因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應挑單菌落。6、實驗結(jié)果與分析實驗結(jié)果與分析提取質(zhì)粒 DNA 后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，圖譜如下：圖中 M 為 Marker，4 號為本人所提取的質(zhì)粒DNA 凝膠電泳的檢測圖，本人所用的質(zhì)粒為pEGFP-N3。由跑膠結(jié)果可知，質(zhì)粒 DNA 分子條帶較為明亮，說明所提取的 DNA 濃度很高；前面原理部分提到，質(zhì)粒 DNA 分子的結(jié)構(gòu)多樣，包括超螺旋結(jié)構(gòu)，開環(huán)結(jié)構(gòu)以及線性結(jié)構(gòu)等，它們在凝膠中的泳

18、動速度不同，所以在圖譜中顯示有多條帶；膠孔中比較亮的部分表明提取的質(zhì)粒中有大量蛋白質(zhì)殘留；條帶非常寬而且兩側(cè)有輕微的拖尾跡象表明點樣時樣品量加的過多，在質(zhì)粒檢測中可以適當減少加樣量，使得條帶清晰均勻一點。一般在實驗室中，不會單獨檢測質(zhì)粒精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)DNA，或者檢測質(zhì)粒 DNA 時不用 Marker，這主要是因為質(zhì)粒 DNA 分子結(jié)構(gòu)多樣，在電泳圖譜中并不能夠正確顯示其大小。七、思考題七、思考題1裂解細菌時需注意的事項有哪些？裂解細菌時需注意的事項有哪些？答：首先注意的是 SDS-NaOH 處理的時間。質(zhì)粒制備過程中，如果質(zhì)粒長時間暴露于 NaOH, 質(zhì)粒有可能不可

19、逆變性，使得抽提質(zhì)粒中有部分是變性質(zhì)粒。這些變性質(zhì)粒，不能酶切。所有一般情況下，SDS-KOH 處理時間不能超過 5 分鐘，最好在冰里處理，觀察到液體變得清就可以加入中和液。其次是在添加溶液與溶液后溶液的混合一定要柔和，采用上下顛倒的方法，千萬不能在旋轉(zhuǎn)器上劇烈振蕩，否則會是質(zhì)粒 DNA 斷裂，影響提取的效果與濃度。2質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？答：質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，是雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 DNA 分子；具有自主復制和轉(zhuǎn)錄能力；可獨立游離在細胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細菌染色體中。3堿裂解法提取質(zhì)粒堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 中各溶液的作用是什么？中各溶液的作用是什么？答

20、：溶液溶液:pH8.0:pH8.0 GETGET 緩沖液緩沖液，葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會很快沉積到管EP 的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止 DNA 受機械剪切力作用而降解。 是 Ca2 和 Mg2 等二價金屬離子的螯合劑，在溶液 I 中加入 EDTA，是要把大腸桿菌細胞中的二價金屬離子都螯合掉。從而起到抑制 DNase 對 DNA 的降解和抑制微生物生長的作用。溶液溶液：0.2mol/LNaOH(0.2mol/LNaOH(內(nèi)含內(nèi)含 1%1%的的 SDS)SDS)，NaOH 是最佳溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會在瞬間溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從

21、bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向 micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化。SDS 是離子型表面活性劑。它主要作用是：a 溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，從而破壞細胞膜。b 解聚細胞中的。c 能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為 R-O-SO3 -R-蛋白質(zhì)的復合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。SDS 能抑制核糖的作用，所以在接下來的提取過程必須把它去除干凈，以便下一步試驗的更好進行。溶液溶液：pH4.8pH4.8 乙酸鉀溶液，乙酸鉀溶液，pH4.8 的乙酸鉀溶液是為了把抽提液的 pH 調(diào)至中性，從而使變性的質(zhì)粒 DNA 復性，且穩(wěn)定存在。溶液 III 加入后的沉淀實際上是 K+ 置換了 SDS 中的Na+ 形成了不溶性的 PD

22、S，而高濃度的鹽有利于變性的大分子染色體 DNA、RNA 以及 SDS- 蛋白復合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鹽與 SDS蛋白復合物作用后，能形成較小的鹽形式復合物。酚酚/氯仿液氯仿液(V/V1/1)：用苯酚處理時，能使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了 DNase 的降解精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)作用，由于蛋白與 DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相，使用酚能有效變性蛋白質(zhì)，抑制了 DNase 的降解作用；氯仿能克服酚的缺點，加速有機相與液相分層，去除核酸溶液中的跡

23、量酚（酚易溶于氯仿中） ；異戊醇的作用是減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡，異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生，另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含質(zhì)粒 DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。無水乙醇：無水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而 DNA 溶液是 DNA 以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，同時乙醇與核酸不起化學反應，因此是理想的沉淀劑。加入乙醇后，乙醇會奪去 DNA 周圍的水分子，DNA 失水聚合。70%70%乙醇：乙醇：將質(zhì)粒 DNA 表面的離子洗去。pHpH 8.08.0 TETE 緩沖液：緩沖液：由于緩沖液是 TrisH+ /Tris，不存在金屬離子的干擾作用，

24、而 TE 緩沖液中的 EDTA 更能穩(wěn)定 DNA 的活性。酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提 DNA 過程中，不致吸收樣品中含有 DNA 的水分，減少 DNA 的損失。用 Tris 調(diào)節(jié)至 pH為 8 是因為 DNA 在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH57） ，RNA 比 DNA 更容易游離到水相，所以可獲得 RNA 含量較少的 DNA 樣品。4. 抽提質(zhì)粒抽提質(zhì)粒 DNA 的方法包括哪幾個步驟？的方法包括哪幾個步驟？答：DNA 提取分為三個基本步驟：1、破碎細菌細胞壁，加入去污劑除掉膜脂從而裂解細胞，使蛋白質(zhì)與 DNA 變性，利用醋酸鹽沉淀基因組 DNA、細胞碎片與蛋

25、白質(zhì)。2、酚/氯仿抽提，以除掉細胞內(nèi)的蛋白。3、將 DNA 在冰乙醇中沉淀，因為乙醇與水互溶，而DNA 在醇中不可溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。5. 如何提高質(zhì)粒如何提高質(zhì)粒 DNA 的產(chǎn)量？的產(chǎn)量？答：第一是擴大質(zhì)粒 DNA 的拷貝數(shù)，一般認為，培養(yǎng) 16 小時的菌液狀態(tài)最好，最適合提取，可以在此基礎上擴大接種量，等比例擴大 LB 培養(yǎng)基的體積，采取多次抽提的方法提高質(zhì)粒 DNA 的產(chǎn)量；第二是在提取過程中小心謹慎，在加入苯酚/氯仿溶液離心之后小心吸取的同時盡量吸取完全，減少損失。6. 為什么質(zhì)粒為什么質(zhì)粒 DNA 不能反復在不能反復在 4、-20、室溫中放置？為達到這一目的，需要注、室

26、溫中放置？為達到這一目的，需要注意些什么？意些什么？答：當質(zhì)粒存放在-20的條件下保存時，由于 TE 緩沖液中含有水分，會結(jié)成冰晶插入到質(zhì)粒 DNA 分子的間隙中，而在 4條件下不會出現(xiàn)這種狀況。若是質(zhì)粒 DNA 分子反復凍溶，水溶液的反復結(jié)冰會導致環(huán)狀 DNA 分子斷裂，導致得到線性的質(zhì)粒 DNA，在接下來的實驗中將會影響到酶切與檢測。為了保護質(zhì)粒 DNA 分子不受到損害，應當將近期精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)需要使用的質(zhì)粒存放于 4冰箱保存，方便使用，而對于暫時不用的質(zhì)粒，則應存放于-20冰箱，長期保存。實驗二實驗二 DNA 的含量、純度與分子量的電泳法測定的含量、純度與分子

27、量的電泳法測定一、一、實驗原理實驗原理測定核酸通常采用兩種方法：即紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳法。1紫外分光光度法DNA 或 RNA 定量時，應在 260nm 和 280nm 兩個波長下讀數(shù)。根據(jù)計算在 260nm 波長下，每 1ug/mL DNA 鈉鹽的 A 值為 0.20，即在 A260=1 時，雙鏈 DNA 含量為 50ug/mL，單鏈 DNA與 RNA 含量為 40ug/mL，單鏈寡核苷酸的含量為 33 ug/mL。雙鏈 DNA 含量A26050稀釋倍數(shù)（ug/mL）RNA 含量A26040稀釋倍數(shù)（ug/mL）單鏈 DNA 含量A26033稀釋倍數(shù)（ug/mL）此外還可以根據(jù) 26

28、0nm 和 280nm 的讀數(shù)間的比值（A260/A280）估計核酸的純度。2瓊脂糖凝膠電泳法根據(jù) DNA 分子量不同，采用外加電場使其分開，用 EB 嵌入 DNA 分子后在紫外下顯熒光。而熒光強度正比于 DNA 的含量，如將已知濃度的標準樣品表 21 作為電泳對照，就可以估計出待測樣品的濃度。電泳后的瓊脂凝膠糖直接在紫外燈下拍照，只需要510ngDNA，就可以從照片上比較鑒別。由于電泳時所用的樣品量非常少，只要將濃度控制在幾十納克即可，所以在基因工程中經(jīng)常被用做檢測 DNA 樣品。表 21 DNA/ Hind 中 DNA 片斷精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)總 DNA 含量為 10

29、0%二、實驗目的二、實驗目的 1從以上實驗中提取到的質(zhì)粒 DNA，為了能作下一步的酶切，連接及轉(zhuǎn)化實驗，必須測定 DNA 的純度、含量以及分子量大小。2本實驗旨在學習水平式瓊脂糖凝膠電泳，學習檢測 DNA、含量與相對分子質(zhì)量大小。三、實驗材料和試劑三、實驗材料和試劑材料：自制的質(zhì)粒 DNA、DNA/ Hind 、 。試劑：1標準 DNAmarker(DNA/ Hind )2限制性內(nèi)切酶 EcoR或 Hind和 10X 緩沖液3酶反應中止液：0.2 5溴酚藍(含 40蔗糖)，已配好。4溴化乙錠染液（EB）：使用前稀釋 1000 倍，母液已配好。注意：EB 是一種誘變劑，配制和使用時應戴好手套，并

30、且不能將該染液灑在桌面或地面上！使用后立即用大量的水沖洗干凈。50.5TBE 緩沖液：Tris 2.18g、硼酸 1.10g、EDTA-Na20.14g 用蒸餾水定容至400mL?？膳涑?5TBE 母液，使用時稀釋 10 倍即可。60.7瓊脂糖片段堿基對數(shù)目/kb相對分子質(zhì)量DNA 含量/ %DNA 含量/(ng/mg)123.13015.010647.7476.929.4196.1210619.4194.136.5574.2610613.5135.244.3712.84106989.952.3221.511064.847.962.0281.321064.241.870.5640.371061

31、.111.680.1250.081060.32.6精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)儀器：儀器：37水浴鍋、微波爐、穩(wěn)壓電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、Eppendorf 架、恒溫搖床、臺式小型振蕩器、Ep 管(1.5mL)、加樣器(20uLlmL)、吸頭。四、實驗操作四、實驗操作（一）質(zhì)粒（一）質(zhì)粒 DNADNA 的酶解的酶解1新提的質(zhì)粒，在 10uL 的體系中用單一酶（如 EcoR）進行處理，即：質(zhì)粒 DNA 5L10緩沖液 1L EcoR 0.5LddH2O 4L237，保溫 30min。3加入 1/10 體積的酶反應終止液，混勻以停止酶解反應。各酶解樣品于冰箱中貯存?zhèn)溆?。（二）?/p>

32、脂糖凝膠板的制備（二）瓊脂糖凝膠板的制備1瓊脂糖凝膠的制備稱取 1.0g 瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入 100mL TBE 緩沖液，于電爐上加熱，注意：防止溢出，由于瓊脂糖較難溶解，如果水分損失較大，則補充一定量的蒸餾水，使其終濃度為 1。2膠板的制備將有機玻璃內(nèi)槽洗凈、晾干。取膠帶紙將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好，形成一個邊腳模子。注意：將橡皮膏緊貼在有機玻璃內(nèi)槽兩端邊上，不能留空隙。將有機玻璃內(nèi)槽置于水平位置，放好樣品槽模板(一般稱之為梳子)，將冷卻至 65左右的瓊脂糖凝膠，小心地倒在內(nèi)槽上，控制灌膠速度，使膠液緩慢地展開，直到整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置 1h 左右，待凝固完

33、全后，輕輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽。將有機玻璃內(nèi)槽放入電泳槽中，加入 0.5TBE 電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。膠板內(nèi)的樣品小槽精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)3加樣用移液槍將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每次加完一個樣品為了避免交叉污染，各樣品用不同的槍頭，以免造成限制酶被污染。加樣時，槍頭不要插入膠板內(nèi)，防止碰壞樣品槽周圍的凝膠面，每個樣品槽的加樣量不宜過多，本實驗加樣為 10uL 左右。(每塊膠板需點一個 Marker，這里即為 DNA/ Hind )4電泳加完樣品后應立即通電，進行恒壓電泳。在低壓條件下，線形 DNA 片段的遷移速度與電壓成

34、比例關(guān)系，為了獲得電泳分離 DNA 片段的最大分辨率，電場強度不應高于5V/cm。當溴酚藍染料（藍色）移動到距離膠板下沿約 12cm 處，停止電泳。5染色將電泳后的凝膠浸入 EB 染液中，進行染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的 DNA 帶。染色20min 后，用大量水沖洗。6觀察在波長為 254nm 的紫外燈下，觀察染色后的電泳凝膠。DNA 存在處顯示出紅色熒光條帶。用凝膠自動成像儀處理代替。五、注意事項五、注意事項1基因工程是微量操作技術(shù)，DNA 樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的正確性，確認樣品確實被加入反應體系。2酶應在20冰箱中保存，取酶的操作必須嚴格在冰浴條件下進行，用完后

35、立即放回20冰箱，不要將酶在冰浴中放置過久，或放在高于 0以上的環(huán)境中，以防止酶失活。3酶切加樣次序為水、緩沖液和 DNA，然后混勻。酶永遠是最后加入的，如將酶直接加入濃縮的緩沖液中會引起嚴重的失水。酶切反應體系的溶液加完后，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底，不要用振蕩器。此步操作是整個實驗成敗的關(guān)鍵，注意防止錯加、漏加。4為了避免交叉污染，各樣品用不同的吸頭，且每次取酶時務必換吸頭，以免造成限制酶被污染。5溴化乙錠是一種強烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時，應戴手套進行操作。勿將溶液滴灑在臺面或地面上，用后用水徹底沖洗干凈。六、實驗結(jié)果與分析六、實

36、驗結(jié)果與分析精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)如圖所示，M 為 Marker，泳道 1 為被酶 EcoR I 所切后的質(zhì)粒跑出來的條帶。因為質(zhì)粒在酶切之前大都以超螺旋的形式存在，在酶切之后以線性形式存在，所以泳道 1 只有一條條帶。查資料知道 pEGFP-N3 質(zhì)粒的大小為 4729bp，大小基本符合。2 號泳道為未酶切的對照組質(zhì)粒，因為狀態(tài)不同，所以顯示出比酶切之后的條帶跑的慢。分子量相同的超螺旋環(huán)狀、帶切口環(huán)狀以及線狀 DNA 通過瓊脂糖凝膠時速度不一。由圖中看，酶切后的質(zhì)粒條帶及未經(jīng)酶切的質(zhì)粒條帶都不明亮，且對照組質(zhì)粒的三條帶不明顯，說明提取的質(zhì)粒濃度較小。這三種 DNA 的相對

37、遷移率主要取決于凝膠濃度，但也受所用電流強度、緩沖液的離子強度及超螺旋度的影響。七、思考題七、思考題1.簡述簡述 EB 顯色的原理。顯色的原理。答：溴化乙錠（EtBr，EB） ，是芳香族熒光化合物，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸。是一種核酸染料，常在瓊脂糖凝膠電泳中用于核酸染色，是一種強的誘變劑，可能也是一種致癌物或致畸劑。EB 分子可以嵌入核酸雙鏈的配對的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，未與核酸結(jié)合的溴化乙錠可被激發(fā)出橙紅色螢光。在與 DNA 或雙股 RNA 結(jié)合時，螢光強度會增強20倍，使得核酸電泳后的膠片可以辨識核酸的相對位置。在核酸分子中，EB 分子插入到兩層堿基對之間，發(fā)出紅色熒光

38、。在凝膠中加入終濃度為0.5g/ml 的 EB，可以在電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況，這種方法使用于一般性的核酸檢測。2.使用溴化乙錠時應注意什么？使用溴化乙錠時應注意什么？答：不慎與眼睛接觸后，立即用大量清水沖洗并征求醫(yī)生意見；穿戴適當?shù)姆雷o服、手套和護目鏡或面具；若發(fā)生事故或感不適，立即就；避免皮膚接觸；吸入有極高毒性，避免吸入。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)3.說明不同電壓對電泳結(jié)果的影響是什么？說明不同電壓對電泳結(jié)果的影響是什么？答：限制性內(nèi)切酶消化后的 DNA 分子片段，低電壓時，遷移率與所用電壓成正比。在電場強度增加時，不同分子量的 DNA 段的遷移率將以不同的幅度增

39、長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。原則上場強度不要超過 5V8V/cm，高電壓可明顯產(chǎn)熱，嚴重時會引起凝膠熔化或 DNA變性。使用 50V 左右的低電壓可以讓 DNA 分子片段沉降到膠孔中的適當位置，分散更加均一后緩慢泳出加樣孔，條帶整齊集中，對于微量珍貴樣本（150ng）和小片段樣本（容易在凝膠中擴散消失，顯色不清）尤其有利于觀察到清晰結(jié)果。為了提高效率，節(jié)省時間，在核酸條帶濃縮集中后（1020min） ，可以轉(zhuǎn)換高電壓 100V，當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約 0.51.0cm 時，停止電泳。綜上，兩種電壓交替使用既提高分離效

40、果，又較好節(jié)余時間。4如何判斷如何判斷 DNA 的純度？的純度？答：DNA 純度的判斷根據(jù) OD260/OD280 的比值判斷，符合要求純度高的純化 DNA 其OD260/OD280 在 1.6-1.8 之間，低于此范圍表明蛋白質(zhì)含量超標，高于此范圍表明樣品中含有 RNA。實驗三實驗三 感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化一、實驗原理一、實驗原理 感受態(tài)就是細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)，只有發(fā)展為感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定攝取外來的 DNA 分子。轉(zhuǎn)化是將外源 DNA 分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化的基本原理是細胞處于 0，CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合

41、物中的 DNA 形成抗 DNase 的羥基鈣磷酸混合物粘附于細胞表面，經(jīng) 42短時間熱沖擊處理，促使細胞吸收 DNA 復合物，在選擇性培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。二、實驗目的二、實驗目的1學習和理解影響細胞感受態(tài)的因素，掌握感受態(tài)細胞的制備方法。2掌握質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法。把體外 DNA 引入受體細胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)選擇出轉(zhuǎn)化子。三、實驗材料和用具三、實驗材料和用具材料：自制的質(zhì)粒 DNA、大腸桿菌(E.coli)菌種(DH5 菌株)。試劑：LB 瓊脂平板 (無抗生素)、LB 瓊脂平板 (含 50g/L 卡那霉素)、LB 液體培養(yǎng)基

42、5mL(無抗生素)、LB 液體培養(yǎng)基 100mL(無抗生素)、LB 液體培養(yǎng)基 5mL(含 50g/L 卡那霉素)、0.1mol/LCaCl2溶液(滅菌備用)。儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、接種環(huán)、涂布器、冷凍離心機、離心管、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋。四、操作步驟四、操作步驟(一一)大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備1從新活化的 E.coliDH5 菌平板上挑取一單菌落，接種于 5mL 液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜，直至對數(shù)生長期。將該菌懸液以 1：50 接種于 50mL LB 液體培養(yǎng)基中，37快速振蕩培養(yǎng) 34h。2取 5mL 培養(yǎng)液放入離心管中，在冰上放置 10min，于

43、 45000rpm 離心 10min。3可用移液槍將殘余液體盡量去凈，用 1mL 預冷的 0.1mol/LCaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰上放置 1530min。4于 4，5000rpm 離心 10min。5棄上清，加入 200L 預冷的 0.1mol/LCaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻，即制成了感受態(tài)細胞懸液。6制好的感受態(tài)細胞可在冰上放置。(二二)細胞轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)化取 200L 搖勻后的感受態(tài)細胞懸液，進行下一步的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化如下（單位：L）：編號質(zhì)粒感受態(tài)細胞無菌水0.1mol/LCaCl2精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)樣品組即為我們的轉(zhuǎn)化組：100L 感受態(tài)細胞2L 質(zhì)

44、粒 DNA對照 1 為受體菌對照組：100L 感受態(tài)細胞2L 無菌水對照 2 為質(zhì)粒 DNA 對照組：100L0.1mol/LCaCl22L 質(zhì)粒 DNA將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置 30min 后，于 42水浴中保溫 90s，然后迅速在冰上冷卻 35min。上述各管中分別加入 400L LB 液體培養(yǎng)基，使總體積為 500L，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應原液，搖勻后于 37振蕩培養(yǎng) 30min，使受體細胞恢復正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性。(三)平板培養(yǎng)取各樣品培養(yǎng)液 100L 分別接種于含卡那霉素和不含卡那霉素的 LB 平板培養(yǎng)基上（分別記為 Kan和 Kan） ，涂勻。37培養(yǎng) 24h，待菌

45、落生長良好且未相互重疊時停止培養(yǎng)。(四)檢出轉(zhuǎn)化體五、注意事項五、注意事項1這一個實驗中的所有操作均要為無菌操作，在超凈工作臺內(nèi)進行。2細胞轉(zhuǎn)化中，42水浴 90s 要準確操作。3制備感受態(tài)細胞過程中，需要在冰上放置的一定不要在室溫中放置。6、實驗結(jié)果與分析實驗結(jié)果與分析樣品2100/對照 1/1002/對照 22/100不含抗生素培養(yǎng)基含抗生素培養(yǎng)基結(jié)果分析受體菌對照組有大量菌落長出無菌落長出本實驗未產(chǎn)生抗藥性菌株質(zhì)粒對照組無菌落長出無菌落長出質(zhì)粒 DNA 不含雜菌轉(zhuǎn)化實驗組有大量菌落長出有菌落長出質(zhì)粒進入受體菌中產(chǎn)生抗藥性精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè) 經(jīng)過一夜培養(yǎng)后，第二天上

46、午 9 點從烘箱中取出培養(yǎng)皿觀察結(jié)果如下圖所示，實驗比較成功，轉(zhuǎn)化實驗組的不含卡那的平板有大量菌落長出，含卡那的平板有少許菌落長出；對照組 1 即受體菌對照組不含卡那的平板有大量菌落長出，含卡那的平板沒有菌落；對照組 2 即質(zhì)粒對照組不含卡那的平板上發(fā)現(xiàn)一個菌落，含卡那的平板沒有菌落。 轉(zhuǎn)化實驗組轉(zhuǎn)化實驗組 受體菌對照組受體菌對照組精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè) 質(zhì)粒對照組質(zhì)粒對照組思考題思考題1感受態(tài)細胞制備好后，為什么在轉(zhuǎn)化前還要在冰上放置？感受態(tài)細胞制備好后，為什么在轉(zhuǎn)化前還要在冰上放置？答：感受態(tài)細胞制備后在冰上放置一段時間后再進行轉(zhuǎn)化可提高轉(zhuǎn)化率。在 0 攝氏度的中，菌細胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化