飼料中粗蛋白測定

1、實(shí)驗(yàn)二 飼料粗蛋白的測定飼料粗蛋白測定的意義： 蛋飼料中含氮物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)含氮化合物，兩者蛋飼料中含氮物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)含氮化合物，兩者總稱為粗蛋白?？偡Q為粗蛋白。 蛋白質(zhì)是畜禽日糧中最主要的物質(zhì)之一，蛋白質(zhì)是生命的物蛋白質(zhì)是畜禽日糧中最主要的物質(zhì)之一，蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。測定飼料中蛋白質(zhì)的含量，對于初步評價(jià)飼料的營質(zhì)基礎(chǔ)。測定飼料中蛋白質(zhì)的含量，對于初步評價(jià)飼料的營養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用飼料蛋白資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用飼料蛋白資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化飼料配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極重要的意飼料配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極重要的意義

2、。義。蛋白質(zhì)測定方法：1 1直接法直接法根據(jù)蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)直接測定蛋白質(zhì)含量雙縮脲法Folin酚試劑法（Lowry法）紫外吸收法（最常見的280nm）考馬斯亮蘭法（Bradford法）染料結(jié)合法2 2間接法間接法通過測定樣品中總含氮量推算蛋白質(zhì)含量（根據(jù)：每種蛋白質(zhì)的含氮量是恒定的，N6.25）。凱氏定氮法杜馬斯燃燒定氮法強(qiáng)堿直接蒸餾法飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法凱氏定氮法是9世紀(jì)建立的經(jīng)典方法，結(jié)果可靠但操作費(fèi)時(shí)。在經(jīng)典法基礎(chǔ)上選擇催化劑，加快分析速度，改進(jìn)儀器裝置。是目前飼料中粗蛋白分析最常用的方法。適應(yīng)范圍：本方法適用于配合飼料、濃縮飼料精料補(bǔ)充料和單一飼料。測定原理：飼料的有機(jī)

3、物質(zhì)在催化劑（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的幫助下，用濃硫酸進(jìn)行消化作用，使蛋白質(zhì)和氨態(tài)氮（在一定處理下也包括硝酸態(tài)氨）都轉(zhuǎn)變成氨，并被濃硫酸吸收成為硫酸銨；而非含氮物質(zhì)，則以CO2，H2O，SO2狀態(tài)逸出。消化液在濃堿的作用下釋放出氨，通過蒸餾，氨隨汽水順著冷凝管流入硼酸吸收液中，并與其結(jié)合成硼酸銨，然后以甲基紅溴甲酚綠作混合指示劑，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，求出氨的含量，再乘以一定的換算系數(shù)，即得出試樣中粗蛋白的含量。測定原理： 樣品消化樣品消化 2NH2(CH)2COOH 13H2SO4 (NH4)2SO4 6CO2 12SO2 16H2O 氮的蒸餾氮的蒸餾 2NaOH (

4、NH4)2SO4 2NH3 Na2SO4 2H2O NH3 + H3BO3=NH4H2BO3 滴定滴定 NH4H2BO3+HCl=NH4Cl+H3BO3濃硫酸的脫水性與強(qiáng)氧化性儀器設(shè)備： 分析天平：感量0.0001g 消煮爐或電爐 酸式或通用滴定管：25mL，50mL 消化管或者凱氏燒瓶：250mL 開始蒸餾裝置：常量直接蒸餾或半微量蒸餾式 三角瓶：150mL，250mL 容量瓶：100mL 定氮儀：以凱氏原理制造的各類型半自動和全自動蛋白質(zhì)測定儀。試劑與溶液： 濃硫酸：化學(xué)純 混合催化劑：0.4g硫酸銅（CuSO45H2O），6g無水硫酸鉀或無水硫酸鈉，磨碎混勻。 400g/L氫氧化鈉溶液：

5、400g氫氧化鈉（化學(xué)純）溶于1000mL水中。 20g/L硼酸溶液：20g硼酸（化學(xué)純）溶于1000mL水中。 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：用基準(zhǔn)物質(zhì)碳酸鈉，按附錄八進(jìn)行標(biāo)定。c（HCl）=0.1mol/L：8.3mL濃鹽酸，注入1000mL水中（用于常量定氮法）c（HCl）=0.02mol/L:1.67mL濃鹽酸，注入1000mL水中（用于半微量定氮法） 混合指示劑：1g/L甲基紅乙醇溶液與5g/L溴甲酚綠乙醇溶液，兩溶液等體積混合，陰涼處保存期為三個(gè)月。 硫酸銨：分析純、干燥 蔗糖：分析純 硼酸吸收液（全自動定氮儀用）：10g/L硼酸溶液1000mL，加入1g/L溴甲酚綠乙醇溶液10mL，40g/

6、L氫氧化鈉溶液0.5mL混合，置陰涼處保存期為1個(gè)月。CuSO4的作用的作用防止飛濺防止飛濺實(shí)驗(yàn)步驟： （1）試樣的消化 電爐消化：稱取0.20.4g試樣（含氮量580mg），準(zhǔn)確至0.0002g,放入凱氏燒瓶中，加入6.4g混合催化劑，與試樣混合均勻，再加入濃硫酸10mL和2粒玻璃珠。將凱氏燒瓶放在通風(fēng)柜里的電爐上或凱氏消化架上小心加熱。開始小火，待樣品焦化，泡沫消失，再加大火力，并消化直至溶液呈透明的藍(lán)綠色后，再加熱消化15min。 消化管消化：稱取0.20.4g試樣（含氮量580mg），準(zhǔn)確至0.0002g,放入消化管中，加入6.4g混合催化劑與試樣混合均勻， 或加入2片商業(yè)消化片，再加

7、入濃硫酸10mL，于420下消化爐上消化6090min,取出后冷卻，用少量蒸餾水沖洗消化管帽。建議消化爐消化程序一般設(shè)定為：200，30min；420，6090min。消化時(shí)間不宜過消化時(shí)間不宜過長，會使測定結(jié)長，會使測定結(jié)果偏低果偏低防止水中氨態(tài)氮的逸失而影響測定值。實(shí)驗(yàn)步驟：（2）氨的蒸餾半微量蒸餾法半微量蒸餾法使用凱氏定氮法定氮裝置。將試樣消煮液冷卻，加入20mL蒸餾水，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中。冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣分解液。取20mL/g硼酸溶液35mL于錐形瓶中，加23滴混合指示劑，使半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入此溶液。蒸汽發(fā)生器中的水應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴、硫酸數(shù)滴，

8、在蒸餾過程中保持此溶液為橙紅色，否則需補(bǔ)加濃硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液1020mL，注入蒸餾裝置的反應(yīng)室內(nèi)，用少量蒸餾水沖洗進(jìn)樣入口，塞好入口玻璃塞，再加400g/L氫氧化鈉溶液10mL，小心拉起玻璃塞使之進(jìn)入反應(yīng)室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水封好，防止漏氣，蒸餾4min，使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。使NH3全部吸收進(jìn)硼酸 最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸！ 1電爐;2水蒸氣發(fā)生器(2L 燒瓶);3螺旋夾;4小玻杯及棒狀玻塞;5反應(yīng)室;6反應(yīng)室外層;7橡皮管及螺旋夾;8冷凝管;9蒸餾液接收瓶。凱氏半微量定氮

9、裝置冷凝管的水流冷凝管的水流方向？方向？實(shí)驗(yàn)步驟：常量蒸餾法。 常量法蒸餾法使用凱氏半自動定氮儀。將試樣消煮液冷卻加入60-100mL水，搖勻，冷卻。將蒸餾裝置冷凝管的末端浸入盛有35mL硼酸吸收液和加2滴混合指示劑的錐形瓶內(nèi)。然后小心地將消化管裝入儀器中，然后向消化管中加入400g/L氫氧化鈉溶液40mL(或至溶液顏色變黑，再加少許)使溶液混勻后再加熱蒸餾5min,或至蒸餾出液體積約為150mL。降下錐形瓶，使冷凝管末端離開液面，繼續(xù)蒸餾1min,并用水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。開始半自動定氮儀使NH3全部吸收進(jìn)硼酸校正藥品不純帶來的誤差溴甲酚綠甲基紅指示劑變色范圍

10、為5.0-5.2，pH5.0以下為暗紅色，pH5.1為灰綠色，5.2以上為綠色實(shí)驗(yàn)步驟： （3）滴定。半微量蒸餾法或常量定氮法蒸餾后的吸收液，分別立即用0.02mol/L或0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色為終點(diǎn)。 （4）空白測定。稱取蔗糖0.5g，以代替試樣，按（1）試樣的消化測定步驟進(jìn)行空白測定，消耗0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積不超過0.2mL。消耗0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積不超過0.3mL。 （5）蒸餾步驟的檢驗(yàn)。精確稱取0.2g硫酸銨，代替試樣，按以上（1）和（2）測定步驟操作，測得硫酸銨含氮量為（21.190.2）%，否則應(yīng)檢查加堿、

11、蒸餾和滴定各步驟是否正確。實(shí)驗(yàn)步驟： （6）結(jié)果計(jì)算與表示 半微量定氮法和常量定氮法試樣中粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別按式下面兩式計(jì)算。 式中:c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；m為試樣質(zhì)量，g;V2為滴定試樣時(shí)所消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL; V0為試樣分解液蒸餾用移取體積，mL;0.014為與1.00mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(HCL)=1.000mol/L相當(dāng)?shù)摹⒁钥吮硎镜牡馁|(zhì)量;6.25為氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。 每個(gè)試樣取兩平行樣進(jìn)行測定，以其算數(shù)平均值為結(jié)果。結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。201V -V *c*VCP =*mV（） 0.014 6.25（）20V -V *c*0.014*6.

12、25CP =m（）（）實(shí)驗(yàn)步驟： 7.重復(fù)性 當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在25%以上，允許相對偏差為1%;當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10%25%，允許相對偏差為2%；當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10%以下時(shí)，允許相對偏差為3%。注意事項(xiàng)： 消化時(shí)應(yīng)經(jīng)常轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以使消化得以快速而完全。 凱氏定氮蒸餾過程中，要求整套裝置呈密閉狀態(tài)，蒸餾前應(yīng)檢查定氮儀各導(dǎo)管間的連接處是否密閉，以免產(chǎn)生泄露。 蒸餾完畢應(yīng)先取下接收瓶，然后關(guān)閉電源，以免酸液倒流。 一次蒸餾后必須徹底洗凈堿液，以免再次使用時(shí)引起誤差。 含硝酸鹽較多的飼料，用凱氏定氮法測定粗蛋白時(shí)，很多硝酸鹽因還原而損失。 各種飼料的粗蛋白質(zhì)中實(shí)際含氮量差異很大，其變異范圍在14.

13、7%19.5%，平均為16%。反飼料的粗蛋白質(zhì)中氮含量尚未確定的，可用6.25平均系數(shù)乘以氮量換算成粗蛋白質(zhì)量。反飼料中的粗蛋白質(zhì)的含氮量已經(jīng)確定的，可用他們的實(shí)際系數(shù)來換算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論與分析：根據(jù)測得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算該樣本飼料中粗蛋白含量。標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的配制及標(biāo)定一般規(guī)定 1 除另有規(guī)定外,本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑的級別應(yīng)在分析純(含分析純)以上,所用制劑及制品,應(yīng)按GB/T603的規(guī)定制備,實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中三級水的規(guī)格。 2 本標(biāo)準(zhǔn)制備標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度,除高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、鹽酸-乙醇標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(NaNO2)=0.5mol/L外,均指20時(shí)的濃度。在標(biāo)

14、準(zhǔn)滴定溶液標(biāo)定、直接制備和使用時(shí)若溫度不為20時(shí),應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積進(jìn)行補(bǔ)正(見附錄A)。規(guī)定“臨用前標(biāo)定”的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液,若標(biāo)定和使用時(shí)的溫度差異不大時(shí),可以不進(jìn)行補(bǔ)正。標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液標(biāo)定、直接制備和使用時(shí)所用分析天平、滴定管、單標(biāo)線容量瓶、單標(biāo)線吸管等按相關(guān)檢定規(guī)程定期進(jìn)行檢定或校準(zhǔn),其中滴定管的容量測定方法按附錄B進(jìn)行。單標(biāo)線容量瓶、單標(biāo)線吸管應(yīng)有容量校正因子。 3 在標(biāo)定和使用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液時(shí),滴定速度一般應(yīng)保持在6mL/min8mL/min。 4 稱量工作基準(zhǔn)試劑的質(zhì)量小于或等于0.5g時(shí),按精確至0.01mg稱量;大于0.5g時(shí),按精確至0.1mg稱量。 5 制備標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度應(yīng)

15、在規(guī)定濃度的5%范圍以內(nèi)。 6 除另有規(guī)定外,標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度時(shí),需兩人進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別做四平行,每人四平行標(biāo)定結(jié)果相對極差不得大于相對重復(fù)性臨界極差CR0.95(4)r=0.15%,兩人共八平行標(biāo)定結(jié)果相對極差不得大于相對重復(fù)性臨界極差CR0.95(8)r=0.18%。在運(yùn)算過程中保留5位有效數(shù)字,取兩人八平行標(biāo)定結(jié)果的平均值為標(biāo)定結(jié)果,報(bào)出結(jié)果取4位有效數(shù)字。需要時(shí),可采用比較法對部分標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度進(jìn)行驗(yàn)證。 7 本標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度的相對擴(kuò)展不確定度不大于0.2%(k=2)。 8 本標(biāo)準(zhǔn)使用工作基準(zhǔn)試劑標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度。當(dāng)對標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度的準(zhǔn)確度有更高要求時(shí),可使用標(biāo)

16、準(zhǔn)物質(zhì)(擴(kuò)展不確定度應(yīng)小于0.05%)代替工作基準(zhǔn)試劑進(jìn)行標(biāo)定或直接制備,并在計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度時(shí),將其質(zhì)量分?jǐn)?shù)代入計(jì)算式中。 9 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度小于或等于0.02mol/L時(shí)(除0.02mol/L乙二胺四乙酸二鈉、氯化鋅標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液外),應(yīng)于臨用前將濃度高的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用煮沸并冷卻的水稀釋(不含非水溶劑的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液),必要時(shí)重新標(biāo)定。當(dāng)需用本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定濃度以外的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液時(shí),可參考本標(biāo)準(zhǔn)中相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備方法進(jìn)行配制和標(biāo)定。 10 貯存: a) 除另有規(guī)定外,標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液在1030 下,密封保存時(shí)間一般不超過6個(gè)月;碘標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(NaNO2)=0.1m

17、ol/L密封保存時(shí)間為4個(gè)月;高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、氫氧化鉀-乙醇標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、硫酸鐵()銨標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液密封保存時(shí)間為2個(gè)月。超過保存時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行復(fù)標(biāo)定后可以繼續(xù)使用。 b) 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液在1030下,開封使用過的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液保存時(shí)間一般不超過2個(gè)月(傾出溶液后立即蓋緊);碘標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、氫氧化鉀-乙醇標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液一般不超過1個(gè)月;亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(NaNO2)=0.1mol/L一般不超過15d;高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液開封后當(dāng)天使用。 c) 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液出現(xiàn)渾濁、沉淀、顏色變化等現(xiàn)象時(shí),應(yīng)重新制備。 11 貯存標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的容器,其材料不應(yīng)與溶液起理化作用,壁厚最薄處不小于0.5m

18、m。 12 本標(biāo)準(zhǔn)中所用溶液以“%”表示的除“乙醇(95%)”外其他均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的配制與標(biāo)定配制及標(biāo)定原理 配制原理：標(biāo)定原理：K是反應(yīng)系數(shù)nc =Vm=Vmn=M1122c V =k*c V以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液為例：1、配制按照下表量取鹽酸，注入1000mL水中，搖勻。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度c(HCl)/(mol/L)鹽酸的體積鹽酸的體積V/mL1900.5450.19鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度c(HCL)/（mol/L）工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉的質(zhì)量工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉的質(zhì)量m/g11.90.50.950.10.22、標(biāo)定按照下表規(guī)定稱取于270300高溫爐中灼燒至恒重的工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚綠甲基紅指示劑，用配制好的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸2min，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液