靜脈血栓栓塞癥患者活化蛋白C抗性及凝血因子Ⅴ活性和基因多態(tài)性研究

1、            作者：韓軒茂，任景芳，郝斌，曹文東，劉秀娥， 侯麗虹，                     郭志萍，于斌，王學(xué)峰，丁秋蘭，楊林花【摘要】  本研究旨在觀察靜脈血栓栓塞患者凝血因子（Factor, F）活性改變，檢測活化蛋白C抗性（activated p

2、rotein C resistance, APCR）和凝血因子基因FLeiden、 FCambridge、FHong Kong、 FAsp79His和FI359T多態(tài)性。對95例靜脈血栓栓塞患者（其中下肢深靜脈血栓79例，肺栓塞4例，下肢深靜脈血栓合并肺栓塞12例）和95例正常對照者。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性測定FV Leiden、FCambridge和FHong Kong多態(tài)性， 用MassARRAYTM技術(shù)檢測FAsp79His、FI359T多態(tài)性。以一期法和校正的APTT試驗分別對其中的65例靜脈血栓栓塞患者和60例正常對照者行凝血因子活性水平和活化蛋白C抵抗檢測。結(jié)果表明：靜脈血

3、栓栓塞患者血漿凝血因子活性水平（108.03%±28.29%）高于對照組（95.17%±29.75%），差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008)；靜脈血栓栓塞組活化蛋白C抵抗陽性13例（20.0%），對照組3例（5.0%），二組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012）。二組均未發(fā)現(xiàn)FV Leiden、FCambridge、FHong Kong、 FVAsp79His和FV I359T多態(tài)性。結(jié)論：凝血因子活性升高和活化蛋白C抵抗是靜脈血栓栓塞的危險因素，但APCR與FLeiden、FCambridge、FHong Kong、 FAsp79His和FI359T多態(tài)性無關(guān)。 【關(guān)鍵

4、詞】  靜脈血栓栓塞 活化蛋白C抵抗 凝血因子 基因多態(tài)性 Analysis of Activated Protein C Resistance, Factor V Coagulation Activity and Gene Polymorphisms in Patients with Venous Thromboembolism       Abstract    The study was aimed to investigate  the  factor V coagu

5、lation activity (F:C), and to evaluate  Fgene polymorphisms and activated protein C resistance (APCR) in the patients with venous thromboembolism (VTE). 95 patients with VTE and 95 normal controls were investigated for F gene polymorphisms. FV Leiden, FCambridge, and FHong Kong were detected by

6、 PCR, MnlI and BstNI digestion respectively. FAsp79His and FI359T were detected by MassARRAYTM. F:C and APCR in 65 patients with VTE and 60 normal controls  were determined by a onestage clotting method and the APTTbased assays respectively. The results showed that the mean levels of plasma F:C

7、 were significantly higher in VTE group than that in controls  (108.03%±28.29% vs 95.17%±29.75%)  (P=0.008), the incidence of APCR were 20.0% (13 of 65 cases) in patients with VTE and 5.0% (3 of 60 cases) in normal controls (P=0.012）. FV Leiden, FCambridge, FHong Kong, FAsp79His

8、and FI359T mutations were not found in two groups.  It is concluded that  the increased plasma level of F:C is a risk factor for VTE. There is APCR in both groups, APCR is also a risk factor to VTE. APCR may not be associated with  mutations of FV Leiden, FCambridge, FHong Kong, FVAsp

9、79His and FV I359T polymorphisms, other factors need to study further in APCR.    Key words    venous thromboembolism;  activated protein C resistance;   factor V          coagulation activity;   gene

10、  polymorphisms    J Exp Hematol 2007; 15(3):612-616    靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism， VTE）包括深靜脈血栓形成 （deep venous thrombosis， DVT）和肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism， PTE），是一組嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病。在西方國家的人群中，VTE是僅次于冠心病和高血壓的重要疾病。年發(fā)病率約為1-5，且復(fù)發(fā)率高（2年1，8年30.3）。在美國，每年發(fā)生VTE的病例約為20

11、0萬，其中1/3為PTE，2/3為單獨的DVT 1。在我國尚缺乏大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查資料,但VTE也是一種常見病和多發(fā)病，且發(fā)病率呈上升趨勢。   靜脈血栓栓塞癥患者活化蛋白C抵抗和凝血因子基因多態(tài)性的檢測本研究旨在觀察靜脈血栓栓塞患者凝血因子活性水平，了解活化蛋白C抵抗和凝血因子基因FVLeiden、 FVCambridge、FVHong Kong、 FVAsp79His和FVI359T多態(tài)性在靜脈血栓栓塞患者中的發(fā)生率。    材料和方法    研究對象    VTE組：選自山西醫(yī)科

12、大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院和上海血液病研究所2004年3月至2005年9月住院及門診VTE患者，共95例，男56例，女39例，年齡16- 82歲，平均50.8±14.3歲；其中深靜脈栓塞（DVT）79例，肺栓塞（PE）4例，DVT合并 PE 12例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病分會制訂的肺血栓栓塞癥的診斷與治療指南(草案)。DVT通過病史、多普勒超聲或靜脈造影確診，PE由血管造影或通氣灌注肺掃描證實。其中DVT患者均發(fā)生于下肢，包括腘靜脈、股靜脈、或髂股靜脈。排除疾?。簮盒阅[瘤、骨髓增生性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、全身感染、創(chuàng)傷、長期制動、口服避孕藥和肝、腎功能異常。  &#

13、160; 對照組：選自山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院體檢中心健康者共95例，其中男54例，女41例，年齡23-71歲，平均52.0±13.8歲。經(jīng)常規(guī)檢查未發(fā)現(xiàn)異常者，無VTE史、無動脈疾病（腦卒中、心肌梗死和周圍動脈疾病）、無反復(fù)妊娠丟失及腫瘤病史。    標(biāo)本采集    研究組與對照組均采用3.8%枸櫞酸鈉抗凝管，空腹抽取肘靜脈血4 ml，  2000×g離心15分鐘，分離血漿和血細(xì)胞，-80分別凍存，待測。    FC檢測    FC試劑盒購自

14、德國Dade Behring公司，一期法行FC水平測定。    APCR檢測    采用BIOCLOT FaaPC Resistance試劑盒，SYSMEX CA7000型血液凝固儀。用校正的APTT法行APCR測定，APC比值2.0提示APCR。    F基因多態(tài)性檢測    基因組DNA的抽提  按常規(guī)酚氯仿異戊醇抽提法抽提基因組DNA。標(biāo)化DNA濃度為5-15 ng/l。    多聚酶鏈反應(yīng)限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性（polymera

15、se chain reaction restriction fragment length polymorphism,  PCRRLFP）分析   PCRRLFP分析FLeiden和R306（FCambridge或FHong Kong） 用以擴增包含1691G/A和R306片段引物序列，詳見表1。    PCR條件  1691G/A和R306片段的PCR條件相同，取各樣本基因組DNA 0.5 g, PCR反應(yīng)總體積為25 l, 引物終濃度為1 mol/L，緩沖液及dNTP濃度按照常規(guī)。在熱循環(huán)儀上（PTC200 MJ RES

16、ARCH公司）95預(yù)變性5分鐘；95變性30秒，60 30秒，72延伸30秒，共30個循環(huán)；延伸，10分鐘。PCR 產(chǎn)物在2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。    1691G/A片段的酶切  取PCR 產(chǎn)物10 l, Mnl I 酶(Biolabs) 4 U , 于37酶切3小時，溴化乙錠染色, 紫外燈下觀察。    R306片段的酶切  取PCR 產(chǎn)物10 l, BstNI 酶(Biolabs) 1 l及酶切緩沖液2 l, 于37酶切16小時。酶切產(chǎn)物于2% 瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠染色, 在紫外燈下觀察，拍照。

17、60;   基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析（matrixassisted laser desertion/ioni timeof flight mass spectrometry, MALDITOF）  MALDITOF檢測FVAsp79His、FV I359T多態(tài)性引物由上海申蘭生物技術(shù)有限公司合成。    引物  FV AsP79His   P1:  ACGTTGGATGTTGAGGATGGATGCTCAAGG； P2:  ACGTTGGATGTGGGCCTACTTTATA

18、TGCTG。 FV I359T      P1:  ACGTTGGATGGGACTCATCTTCGTACTGTG；                       P2:  ACGTTGGATGATACAGGTCTCAGCATTTGG。    PCR多重擴增  反應(yīng)體系：總

19、體積20 l，其中10×Buffer 0.625 l，引物(10PM) 0.05 l×2，dNTPmix (10 mmol/L) 0.254 l, MgCl2(25 mmol/L)0.325 l, Hotstar Taq酶 0.03 l，DNA模板(5-10 ng) 1 l。 反應(yīng)程序：95 15分鐘, 95 20秒, 56 30秒, 72 1分鐘, 45個循環(huán)，72 3分鐘；4 。    PCR產(chǎn)物純化  反應(yīng)體系：總體積7 l，其中PCR產(chǎn)物5 l，SAP混合液2 l (SAP 0.3 l, hME buffer 0.17 l)。反應(yīng)程序