補(bǔ)腎益智方對(duì)老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力保護(hù)作用的觀察

1、    補(bǔ)腎益智方對(duì)老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí) 記憶能力保護(hù)作用的觀察         摘要：為尋求防治老年性癡呆的有效措施，運(yùn)用Morris水迷宮評(píng)價(jià)了中藥補(bǔ)腎益智方(由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參等組成)對(duì)由D_半乳糖致亞急性衰老加上Meynert核損毀所致阿爾茨海默病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用。結(jié)果表明：補(bǔ)腎益智方能夠改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)，包括縮短模型大鼠在Morris水迷宮中尋找到平臺(tái)的逃避潛伏期(P0.01)，延長(zhǎng)其在原平臺(tái)象限游泳的距離(P0.05)

2、。提示補(bǔ)腎益智方對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的保護(hù)作用。主題詞：癡呆，老年性/中藥療法；阿爾茨海默病/中藥療法；記憶障礙/中藥療法；補(bǔ)腎藥/治療應(yīng)用；補(bǔ)腎益智方/藥理學(xué)；疾病模型，動(dòng)物；大鼠中分類(lèi)號(hào)：R749.1+6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A老年性癡呆(又稱(chēng)阿爾茨海默病，Alzheimer's disease,AD)已成為嚴(yán)重危害老年人健康和影響其生活質(zhì)量的主要疾病之一，但目前仍缺乏有效的防治藥物和方法。為此，我們應(yīng)用 Morris 水迷宮評(píng)價(jià)了自制的補(bǔ)腎益智方對(duì)由  D_ 半乳糖致亞急性衰老加上鵝膏蕈氨酸(Ibotenic acid,IBO)損毀腦 Meynert 基底核

3、所致的 AD 大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用。1材料與方法1.1藥物與試劑補(bǔ)腎益智方由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參等中藥組成，制成濃縮液。雙益平片購(gòu)自上海紅旗制藥廠(批號(hào)為 970101)，每片含石杉?jí)A甲(Huperzine_A)0.05mg。D_ 半乳糖為上海試劑二廠出產(chǎn)，IBO 購(gòu)自 Sigma 公司，均為分析純。1.2動(dòng)物分組、造模與給藥15 月齡初老年雌性 Wistar 大鼠 48 只，體重 300450 g，均由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自然照明，隨意飲水和取食。隨機(jī)分成 4 組，每組 12 只：其中初老年正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)正常組)，腹腔注射生理鹽水 6 周及腦內(nèi)

4、Meynert 核注射生理鹽水；AD 模型組(簡(jiǎn)稱(chēng)模型組)，腹腔注射 D_ 半乳糖(48 mg.kg-1.d-1)6 周和腦內(nèi)雙側(cè) Meynert 核注射 IBO；雙益平片觀察組(簡(jiǎn)稱(chēng)雙益平組)和補(bǔ)腎益智方觀察組(簡(jiǎn)稱(chēng)補(bǔ)腎方組)，造模均同模型組，但在腹腔注射半乳糖(6 周)同時(shí)分別給予雙益平片(0.3 mg.kg-1.d-1)或補(bǔ)腎益智方濃縮液(相當(dāng)生藥量 6 g.kg-1.d-1)灌胃。腦內(nèi)注射在腹腔注射后參考有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行1。造模結(jié)束后，正常組、模型組、雙益平片組和補(bǔ)腎方組分別存活 9 只、8 只、7 只和 9 只。1.3Morris 水迷宮及檢測(cè)所有大鼠在腦內(nèi)注射后進(jìn)行 Morris 水迷

5、宮測(cè)試。Morris 水迷宮(Morris water maze,MWM)參照有關(guān)文獻(xiàn)制作2。為一不銹鋼的圓形水池，直徑 200 cm，高 50 cm，水深 30 cm，水溫控制在(26±1)。池壁標(biāo)明 4 個(gè)入水點(diǎn)，由此將水池等分為 4 個(gè)象限，任選其中 1 個(gè)象限，正中放置 1 個(gè)直徑 11 cm、高 29 cm 的平臺(tái)。迷宮上方安有攝像機(jī)，并和錄像機(jī)以及顯示器連接，自動(dòng)錄入大鼠游泳軌跡進(jìn)行分析。測(cè)試程序包括：(1)定位航行試驗(yàn)(place navigation)：歷時(shí) 5 d，每天上下午各 4 次，將大鼠面向池壁分別從 4 個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄其在 2 min 內(nèi)尋找到平臺(tái)的

6、時(shí)間(逃避潛伏期，escape latency)。如果大鼠在 2 min 未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其至平臺(tái)上，讓大鼠停留 10 s，再放回籠中。(2)空間探索試驗(yàn)(spatial probe)：第 6 天撤除平臺(tái)，將大鼠任選 1 個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄其 2 min 的游泳軌跡，分別計(jì)算其跨越各象限內(nèi)的游泳距離以及在原平臺(tái)象限游泳的時(shí)間和距離占整個(gè)游泳時(shí)間和距離的百分比。1.4統(tǒng)計(jì)方法采用 SAS6.12 統(tǒng)計(jì)軟件包分析。其中單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，分別采用 Newman_Keuls 法或 Scheffe 法。多因素重復(fù)測(cè)量方差分析采用 Huynh_feldt 法。顯著性水

7、平取 =0.05。2結(jié)果2.1大鼠逃避潛伏期的總體變化 1 是各組大鼠在歷時(shí) 5 d 40 次定位航行試驗(yàn)中日平均逃避潛伏期的變化。從中可以看到，4 組大鼠均隨著訓(xùn)練天數(shù)增加，逃避潛伏期越來(lái)越短，表明各組大鼠在歷次學(xué)習(xí)訓(xùn)練中均已逐漸學(xué)習(xí)尋找平臺(tái)。但學(xué)習(xí)記憶過(guò)程存有明顯差異。經(jīng)以測(cè)得的大鼠每次逃避潛伏期作為觀察值，以組別、測(cè)試天數(shù)作為效應(yīng)因子(effective factor)對(duì)各組大鼠的總體逃避潛伏期變化進(jìn)行多因素重復(fù)測(cè)量統(tǒng)計(jì)分析3，結(jié)果表明各組間逃避潛伏期 5 d 的總體變化具有顯著性差異(P0.01)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)：模型組的逃避潛伏期較正常組明顯延長(zhǎng)，差異有顯著性(P0.001)。補(bǔ)腎益智

8、方組分別與模型組、雙益平組比較，其逃避潛伏期顯著縮短(均 P0.001)，但同時(shí)其逃避潛伏期仍較正常組顯著延長(zhǎng)(P0.001)。雙益平組與模型組比較，差異則無(wú)顯著性(P0.05)，與正常組比較有顯著性差異(P0.001)。2.2大鼠空間探索所反映記憶能力的變化表 1 為各組大鼠撤除平臺(tái)后 2 min 在各象限游泳的距離(R、P、L、O 分別代表大鼠在原平臺(tái)右側(cè)象限、原平臺(tái)象限、原平臺(tái)左側(cè)象限和原平臺(tái)對(duì)側(cè)象限)。經(jīng)單因素方差分析，正常組大鼠各象限游泳距離的差異有顯著性(P0.001)，補(bǔ)腎方組大鼠各象限游泳距離之間的差異亦有顯著意義(P0.05)，而模型組、雙益平組大鼠各象限游泳距離差異無(wú)顯著性

9、(P0.05)。表明正常組和補(bǔ)腎方組大鼠對(duì)原平臺(tái)象限的記憶較模型組和雙益平組好。    1各組大鼠 5 d 逃避潛伏期動(dòng)態(tài)變化組 別N/只各象限游泳距離p1(tP/tT)p2(lP/lT)RPLO正常組9600.00±127.531095.94±260.53410.63±183.48328.13±110.140.53±0.100.45±0.08模型組8502.50±101.73532.50±334.55389.06±107.23450.00±177.390

10、.27±0.10#0.27±0.11#雙益平組7519.64±163.10617.14±225.65502.50±152.11462.54±204.650.29±0.12#0.30±0.11#補(bǔ)腎方組9472.50±211.24668.33±245.83442.50±188.62336.67±188.040.33±0.09#0.40±0.12#與正常組比較 P0.05，# P0.01；組內(nèi)各象限游泳距離比較 P0.05， P0.01 同時(shí)我們檢測(cè)了各組大鼠

11、在原平臺(tái)象限(P)游泳的時(shí)間(tP)和距離(lP)與總游泳時(shí)間(tT)和總距離(lT)之比p1(tP/tT)和p2(lP/lT)。經(jīng)單因素方差分析，上述 4 組之間的時(shí)間比和距離比比較，差異均有高度顯著性(P0.01)。兩兩比較結(jié)果顯示：模型組、雙益平組原平臺(tái)象限游泳的時(shí)間比和距離比分別與正常組比較，差異均有顯著性(均 P0.01)，二者之間比較無(wú)顯著性差異(均 P0.05)。補(bǔ)腎方組原平臺(tái)象限游泳的時(shí)間比和距離比分別與模型組和雙益平組比較，差異不顯著(均 P0.05)，但有增加的趨勢(shì)。3討論缺乏有效的防治方法是當(dāng)前 AD 研究中亟待解決的主要問(wèn)題之一。目前在臨床上已經(jīng)使用的 AD 治療藥物主

12、要包括膽堿酯酶抑制劑、鈣阻滯劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑等，但療效均不能令人滿意。如美國(guó) FDA(Food and Drug Administration)已批準(zhǔn)臨床用于治療 AD 的 Tacrine(他克林)、Aricept(安理申)均僅能改善部分認(rèn)知障礙的癥狀，且肝臟毒性等副作用較大4，5。發(fā)揮中醫(yī)特色，尋求治療 AD 的有效中藥有十分重要的意義。國(guó)內(nèi)外已有許多學(xué)者就此進(jìn)行了研究，初步結(jié)果提示補(bǔ)腎、調(diào)心等方藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性 AD 模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用68。但在既往的研究中常常存在模型不甚理想、學(xué)習(xí)記憶行為評(píng)價(jià)不夠科學(xué)客觀以及統(tǒng)計(jì)分析方法不當(dāng)?shù)葐?wèn)題。補(bǔ)腎益智方針對(duì) AD 腎精不足、氣血虧虛的病機(jī)設(shè)

13、計(jì)組方，全方具補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血、開(kāi)竅醒神之功效，臨床試用于癡呆已顯示了初步的療效。為進(jìn)一步明確補(bǔ)腎益智方對(duì) AD 學(xué)習(xí)記憶的作用，本研究在 AD 動(dòng)物模型、學(xué)習(xí)記憶檢測(cè)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等方面作了較大的改進(jìn)。在總結(jié)以前 AD 動(dòng)物模型研究成果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了 D_ 半乳糖致亞急性衰老合并 Meynert 核損毀的多因素復(fù)合實(shí)驗(yàn)性 AD 大鼠模型，即在國(guó)內(nèi)外認(rèn)可和廣泛使用的 D_ 半乳糖致亞急性衰老模型提供一個(gè)老化背景的基礎(chǔ)上，再以 IBO 損毀 Meynert 核模擬 AD 的膽堿能神經(jīng)功能缺失。我們的前期研究工作已表明，此模型大鼠表現(xiàn)為空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，大腦皮質(zhì)廣泛區(qū)域 AChE 陽(yáng)性

14、神經(jīng)纖維密度均較正常對(duì)照組顯著減低，提示該復(fù)合模型較以前的單因素 AD 動(dòng)物模型更貼近 AD 復(fù)雜的臨床病理變化過(guò)程1，9。同時(shí)，我們還認(rèn)為，由于中藥作用的多環(huán)節(jié)性，復(fù)合的 AD 模型可能更適合用作篩選防治 AD 有效中藥的研究。另外，我們選用了近年發(fā)展較快、能夠較好地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的 Morris 水迷宮測(cè)試系統(tǒng)，應(yīng)用了包括多因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)在內(nèi)的統(tǒng)計(jì)分析方法，提高了研究結(jié)果的客觀性和科學(xué)性。上述研究結(jié)果提示，D_ 半乳糖加速衰老加上 Meynert 核損毀的 AD 模型組大鼠在 Morris 水迷宮中平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)、原平臺(tái)象限游泳的時(shí)間和距離顯著縮短，表明模型組大鼠學(xué)

15、習(xí)記憶能力嚴(yán)重受損。而補(bǔ)腎方組大鼠逃避潛伏期較模型組和對(duì)照組縮短，以及原平臺(tái)象限游泳的距離和時(shí)間延長(zhǎng)。提示補(bǔ)腎益智方對(duì)本實(shí)驗(yàn) AD 模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有優(yōu)于對(duì)照藥的保護(hù)作用。另一方面，補(bǔ)腎方組大鼠與正常組在 Morris 水迷宮測(cè)試中存在的差異，似乎提示補(bǔ)腎益智方尚無(wú)法完全保護(hù) D_ 半乳糖和 IBO 所致的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損害，這可能與模型組神經(jīng)元損毀的程度較重、神經(jīng)元修復(fù)能力 的極限以及補(bǔ)腎益智方作用的強(qiáng)度、給藥劑量和作用機(jī)制有關(guān)。本研究顯示了補(bǔ)腎益智方對(duì) D_ 半乳糖和 IBO 所致 AD 模型大鼠空間學(xué)習(xí)認(rèn)知損害的初步保護(hù)作用，對(duì)其作用的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)尚有賴于今后進(jìn)一步研究和探討?；?/p>

16、金項(xiàng)目：國(guó)家“九五”科技重點(diǎn)攻關(guān)課題，編號(hào)：96-906-09-02作者簡(jiǎn)介：第一作者，賴世隆男，1940 年出生，教授，博士生導(dǎo)師；賴世隆（廣州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所，廣州510405）胡鏡清（廣州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所，廣州510405）王奇（廣州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所，廣州510405）溫澤淮（廣州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所，廣州510405）梁偉雄（廣州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所，廣州510405）參考文獻(xiàn)：1胡鏡清，賴世隆，王奇，等.補(bǔ)腎益智方對(duì)阿爾茨海默病大鼠模型腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用J.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，16(3)：2012Morris R.Developme

17、nt of a water_maze procedure for studying spatial learning in the ratJ.J Neurosci Meth,1984,11:473陳長(zhǎng)生，徐勇勇，曹秀堂.醫(yī)學(xué)研究中重復(fù)觀測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法J.中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)1996，13(6)：554Davis KL,Thal LJ,Garmzu ER,et al.A double_blind,placebo_controlled multicenter study of Tacrine for Alzheimer's diseaseJ.New Engl J Med，1992，327(8):12535Rogers SL,Farlow MR,Doody RS,et al.A 24_week,double_blind,placebo_controlled trial of donepezil in patients with Alzheimer's diseaseJ.Neurology 1998，