補(bǔ)腎益智方對老年性癡呆大鼠突觸傳遞長時程增強(qiáng)的影響

1、    補(bǔ)腎益智方對老年性癡呆大鼠突觸傳遞 長時程增強(qiáng)的影響         摘要：觀察補(bǔ)腎益智方(蛇床子、枸杞子、女貞子、人參等組成)對老年性癡呆(又稱阿爾茨海默病，Alzheimer's disease,AD)模型大鼠突觸傳遞長時程增強(qiáng)現(xiàn)象(long_term potentiation,LTP)的影響，旨在探討該方治療AD作用的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。應(yīng)用D-半乳糖致亞急性衰老合并Meynert基底核損毀建立AD模型大鼠，用補(bǔ)腎益智方對AD大鼠灌胃治療4周，采用

2、電生理學(xué)方法，檢測大鼠海馬齒狀回強(qiáng)直刺激誘發(fā)的LTP的變化。結(jié)果表明：強(qiáng)直刺激后，各組間興奮性突觸后電位增強(qiáng)差異不明顯(P>0.05)，補(bǔ)腎益智方高、低劑量組群體峰電位幅度增強(qiáng)較模型組明顯提高(P<0.01或P<0.001)。提示補(bǔ)腎益智方對AD大鼠齒狀回LTP具有改善作用。主題詞：阿爾茨海默病/中藥療法；癡呆，老年性/中藥療法；補(bǔ)腎藥/治療應(yīng)用；補(bǔ)腎益智方/藥理學(xué)；海馬/藥物作用；突觸傳遞/藥物作用；疾病模型，動物；大鼠中分類號：R749.1+6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-3213(2000)02-0109-04 學(xué)習(xí)記憶能力的損害是老年性癡呆(又稱阿爾茨海默病，Al

3、zheimer's disease,AD)患者重要的病理生理特點(diǎn)，至今對其仍無有效防治措施。本研究在采用現(xiàn)已公認(rèn)的D-半乳糖致亞急性衰老作用1形成腦老化的基礎(chǔ)上，再以鵝膏蕈氨酸(ibotenic acid,IBO)損毀Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert nbM)2建立AD大鼠模型，觀察補(bǔ)腎益智方對該AD模型大鼠海馬齒狀回突觸傳遞長時程增強(qiáng)(long_term potentiation,LTP)的改變，旨在探討補(bǔ)腎益智方的作用機(jī)制。1材料和方法1.1材料IBO，sigma公司產(chǎn)品；D_半乳糖，上海試劑二廠；石杉堿甲，上海紅旗制藥廠(批號為97010

4、1)；補(bǔ)腎益智方，由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參等組成，經(jīng)廣東省中醫(yī)院制劑室制成1.2kg/L濃縮液。1.2分組、造模與給藥20月齡老年Wistar大鼠60只，分為老年正常對照組(N=10，簡稱正常組)和造模組(N=50)，造模結(jié)束后，存活的35只造模組大鼠再隨機(jī)分為模型對照組(N=10，簡稱模型組)、補(bǔ)腎方高劑量組(N=9，簡稱高劑量組)、補(bǔ)腎方低劑量組(N=8，簡稱低劑量組)和石杉堿甲對照組(N=8，簡稱石彬堿甲組)。所有大鼠均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。造模組大鼠腹腔注射D-半乳糖6周(48mg.kg-1.d-1)，然后用IBO(5g/L)損毀雙側(cè)nbM3。手術(shù)后1周，高劑量組和低

5、劑量組大鼠分別灌胃高、低劑量的補(bǔ)腎益智方(相當(dāng)于生藥6g.kg-1.d-1和生藥3g.kg-1.d-1)，石杉堿甲組以石杉堿甲灌胃(0.3mg.kg-1.d-1)，均連續(xù)灌胃4周。正常組均以生理鹽水進(jìn)行腹腔和腦內(nèi)注射作為對照。1.3電生理學(xué)灌胃結(jié)束后，大鼠再以戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉，固定于腦立體定位儀之上進(jìn)行電極埋植手術(shù)。記錄電極植于齒狀回顆粒細(xì)胞層，刺激電極植于內(nèi)嗅皮層穿通通路(perforant path,PP)，參考電極為固定在顱骨上的小螺絲釘。記錄電極和刺激電極均緩慢插入，直到選一固定強(qiáng)度而能記錄出最大群體峰電位(population spike,PS)的部位。檢測刺激為單個

6、方波，波寬0.1ms，選取能誘發(fā)最大PS幅度1/21/3的強(qiáng)度。當(dāng)PS值穩(wěn)定于基線至少15min后給予強(qiáng)直刺激(tetanic stimulation,TS)誘發(fā)LTP。強(qiáng)直刺激結(jié)束后，每隔3min檢測1次PS，電位疊加4次平均，記錄時間持續(xù)120min，電位由屏幕顯示、檢測，以PS峰值和興奮性突觸后電位(excited postsynaptic potentials,EPSPs)斜率作為評價指標(biāo)，以PS的強(qiáng)直刺激前后電位比p(ps，i/ps，f)的百分率來反映LTP的變化。1.42結(jié)果2.1PS增強(qiáng)的比較強(qiáng)直刺激穿通通路后，PS的初潛期和峰潛期都比刺激前縮短(表1)，但各組間初潛期和峰潛期刺

7、激前后相比較差異不明顯(P>0.05)，1為正常組大鼠強(qiáng)直刺激前后誘發(fā)電位原始記錄。    左：強(qiáng)直刺激前；右：強(qiáng)直刺激后1強(qiáng)直刺激前后正常組大鼠誘發(fā)電位示例組別N/只tPS初潛期/mstPS峰潛期/ms強(qiáng)直刺激前強(qiáng)直刺激后強(qiáng)直刺激前強(qiáng)直刺激后正常組103.60±0.253.21±0.294.50±0.314.21±0.46模型組103.68±0.233.36±0.134.72±0.324.37±0.30高劑量組93.62±0.123.35±0.24

8、4.80±0.224.34±0.31低劑量組83.63±0.143.27±0.104.75±0.174.37±0.27石杉堿甲組83.71±0.223.31±0.254.55±0.344.22±0.28     強(qiáng)直刺激后各組動物PS幅度的增加都能超過20%，表明各組動物海馬齒狀回都有LTP的形成，但方差分析表明各組間PS幅度增強(qiáng)差異有顯著性(F=15.826，P<0.001)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組雖然有一定的增強(qiáng)，但相比正常組大大降低(P<0

9、.01，見表2)，高劑量組、低劑量組強(qiáng)直刺激后PS幅度增強(qiáng)明顯大于模型組(P<0.01和P<0.001)，石杉堿甲組相比模型組也明顯增強(qiáng)(P<0.01)；高劑量組、低劑量組與石杉堿甲組和正常組之間比較，PS的幅度差異不明顯。從時程觀察(見2)，模型組在強(qiáng)直刺激后的90min內(nèi)PS幅度的增強(qiáng)都能超過20%，但隨后一直低于20%，表明模型組LTP的維持能力下降；低劑量組在強(qiáng)直刺激后的36min內(nèi)，PS峰值的增強(qiáng)明顯大于正常組(P<0.01或P<0.05)，此外，強(qiáng)直刺激后21min內(nèi)，低劑量組與高劑量組、石杉堿甲組與正常組之間PS幅度增強(qiáng)差異有顯著性(P<0.0

10、5)。2.2強(qiáng)直刺激后各組EPSPs增強(qiáng)的比較強(qiáng)直刺激后，各組動物EPSPs的增強(qiáng)均比PS的增強(qiáng)要小(表2)，模型組EPSPs的增強(qiáng)低于其他4組，但各組之間并無顯著性差異(F=8.57，P>0.05)。 表2強(qiáng)直刺激后各組PS幅度和EPSPs斜率增強(qiáng)的比較組別N/只pps幅度/%SEPSPs斜率/%正常組10158.53±17.98135.10±15.17模型組10128.11±4.76*117.47±15.30高劑量組9163.03±15.71#138.28±24.96低劑量組8176.85±13.92#139.52

11、±16.94石杉堿甲組8164.97±29.60#140.89±14.89*與正常組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.01，#P<0.001 3討論諸多的研究提示，學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，其中，神經(jīng)元突觸的可塑性又是中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性中非常敏感的環(huán)節(jié)。海馬LTP的研究是目前研究與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的突觸功能可塑性的熱點(diǎn)。LTP現(xiàn)象被認(rèn)為反映了突觸水平的記憶過程，一些損害學(xué)習(xí)記憶的因素可減低或阻斷LTP的形成，而易化LTP的因素或藥物能提高動物的學(xué)習(xí)記憶能力4，因此，從學(xué)習(xí)記憶和突觸可塑性變化的關(guān)系出發(fā)，探查海馬突觸功能

12、可塑性在AD時的相應(yīng)變化及治療藥物影響，可能會為篩選有效的改善AD等疾病防治藥物的研究提供一個較新的角度，但目前有關(guān)這方面的研究還不多。AD的主要病理特征為腦內(nèi)出現(xiàn)大量老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及膽堿能系統(tǒng)逐漸喪失等，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。所以目前制備AD動物模型的方法雖然有多種，但每種方法均只能造成某些方面的病理改變，這種狀況為評價治療AD的藥物作用帶來不便。為了貼近AD多因素的病理特征，本研究采用D-半乳糖致亞急性衰老(D-半乳糖引起自由基代謝紊亂，使腦組織形態(tài)、生化及臨床檢測指標(biāo)呈現(xiàn)老化特征1)，并以IBO損毀Meynert基底核的膽堿能神經(jīng)元來建立AD大鼠模型。我們的早期工作已表明3，5，

13、該AD模型能呈現(xiàn)多種病理改變，更符合AD多因素的發(fā)病機(jī)制，是進(jìn)行有效中藥治療研究的合適模型。    2強(qiáng)直刺激后LTP的時程比較Nalbantoglu等最近的研究表明，表達(dá)淀粉樣前體蛋白C-末端的轉(zhuǎn)基因AD大鼠不僅空間學(xué)習(xí)記憶能力受損，而且海馬腦片CA1區(qū)LTP的維持能力受損6。本實(shí)驗(yàn)中，AD大鼠海馬PP-DG通路誘發(fā)的PS峰值雖有一定的增強(qiáng)，但增強(qiáng)幅度大大低于正常組，并且在強(qiáng)直刺激后的120min內(nèi)PS幅度的增加已經(jīng)下降到20%以下，表明AD大鼠在體齒狀回LTP的產(chǎn)生及維持能力亦顯著下降，這與Nalbantoglu等在海馬CA1區(qū)的研究結(jié)果是相似的。本

14、實(shí)驗(yàn)結(jié)合有關(guān)的研究工作表明，突觸傳遞功能可塑性的下降很可能是AD病人學(xué)習(xí)記憶能力下降的原因之一。補(bǔ)腎益智方高、低劑量組和石杉堿甲組大鼠海馬齒狀回產(chǎn)生的LTP均比模型組顯著提高，提示補(bǔ)腎益智方和石杉堿甲具有改善AD大鼠突觸傳遞的能力，說明補(bǔ)腎益智方的組方切中AD的腎虛、氣血不足的病理機(jī)制，具有補(bǔ)腎填精、益髓健腦、益氣養(yǎng)血活血之效能。我們以前的研究提示，補(bǔ)腎益智方能夠保護(hù)AD模型鼠腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)，該方灌胃組大鼠腦內(nèi)膽堿酯酶(AchE)陽性神經(jīng)纖維密度呈現(xiàn)廣泛和非特異性增高3，膽堿能系統(tǒng)在LTP及學(xué)習(xí)記憶中的作用已被一些研究所證實(shí)，海馬CA1和齒狀回的LTP可被東莨菪堿抑制，而膽堿酯酶則能增強(qiáng)LTP

15、7。據(jù)此推測，本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)腎益智方改善AD大鼠LTP的形成與影響膽堿能系統(tǒng)的功能有關(guān)。尤其值得注意的是，在強(qiáng)直刺激后的30min左右時間，低劑量組和石杉堿甲組PS的增強(qiáng)明顯大于其他各組，可能低劑量的補(bǔ)腎益智方和石杉堿甲在易化短時程增強(qiáng)方面具有明顯的作用，但具體的機(jī)制目前還不清楚，需要進(jìn)一步研究?；痦?xiàng)目：國家“九五”科技重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(NO：96-906-09-02)；國家醫(yī)藥技術(shù)創(chuàng)新博士項(xiàng)目(NO：98-B-13)作者簡介：第一作者，饒燕女，1972年8月出生，碩士，助教；饒燕（廣州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所中心，廣州510405）賴世?。◤V州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所中心，廣州510405）胡鏡清

16、（廣州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所中心，廣州510405）王奇（廣州中醫(yī)藥大學(xué)老年腦病研究所中心，廣州510405）參考文獻(xiàn)：1張熙，張葆樽，楊新平，等.D-半乳糖誘導(dǎo)擬衰老動物模型的記憶行為改變J.中國老年學(xué)雜志，1996，16(4)：2302Rasool CG,Svendsen CN,Selkoe DJ.Neurofibrillary degeneration of cholinergic and noncholinergic neurons of the basal forebrain in Alzheimer's diseaseJ.Ann Neurol,1986，20:4823胡鏡

17、清，賴世隆，王奇，等.補(bǔ)腎益智方對阿爾茨海默病大鼠模型腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用J.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1999，16(3)：2014Bliss T V P,Collingridge GL. A synaptic model of memory:long_term potentiation in the hippocampusJ.Nature,1993，361:315胡鏡清，賴世隆，王奇，等.D-半乳糖加速衰老合并Meynert核損毀大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化的初步觀察J.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2000，19(2)：56Nalbantoglu J,Tirado_Santiago G,Lahsaini A， et al.Impaired learning and LTP in mic