采用多種抗原測定靜注人免疫球蛋白(pH4)中抗體Fc段生物學(xué)活性的初探.docx

1、論著.采用多種抗原測定靜注人免疫球蛋白(pH4)中抗體Fc段生物學(xué)活性的初探席亮，錢秋娟，張繼鵬,趙一歡，劉曉，何彥林(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，蘭州730046)摘要：目的初步探討采用多種抗原測定靜注人免疫球蛋白(IVIG)(pH4)中抗體的Fc段生物學(xué)活性，了解IVIG中抗體的Fc段生物學(xué)活性。方法采用補體活化的經(jīng)典途徑中免疫復(fù)合物激活補體的方法，將不同濃度的麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、乙肝表面抗原(HBsAg)、破傷風(fēng)類毒素、腦膜炎球菌P64k外膜蛋白和白喉類毒素6種抗原分別致敏人0型血紅細(xì)胞形成紅細(xì)胞-抗原結(jié)合物;然后,6種致敏紅細(xì)胞分別與IVIG孵育，與特異性

2、抗體形成紅細(xì)胞-抗原-抗體復(fù)合物;最后,此復(fù)合物與補體反應(yīng)，在541nm波長處讀取吸光值，并繪制溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線,分別計算IVIG中針對上述6種抗原IgG的Fc段生物學(xué)活性。采用此方法，用6種抗原致敏的紅細(xì)胞測定IVIG的Fc段生物學(xué)活性10次，驗證此方法的重復(fù)性。結(jié)果麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、HBsAg、破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎球菌P64k外膜蛋白致敏的紅細(xì)胞分別與供試品和補體反應(yīng)后，測定的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線較平緩，而白喉類毒素致敏的紅細(xì)胞與供試品和補體反應(yīng)后，測定的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線下降明顯，呈典型的“S”型曲線。計算結(jié)果顯示,IVIG中針對此六種抗原的抗體Fc段生物學(xué)活性相對于參考品均大于80%

3、。Fc段生物學(xué)檢測方法重復(fù)性較好。結(jié)論采用多種抗原分別致敏紅細(xì)胞，可以用來檢測1VIG中多種抗體的Fc段生物學(xué)活性，為深入了解IVIG制品中的多種抗體的Fc段生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：抗原;靜注人免疫球蛋白;Fc段;生物學(xué)活性中圖分類號：R392.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1005-5673(2012)06002505DeterminationonbiologicactivityofFcfragmentinintravenousimmunoglobulin(pH4)byusingmultipleantigensXILiang,QIANQiu-juan,ZHANGJi-peng,ZHAOY

4、i-huan,LIUXiao,HEYan-lin(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd,9CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,China)Abstract:ObjectiveTodeterminebiologicactivityofFcinIVIG(pH4)byusingdifferentantigensfandtounderstandbiologicactivityofFcfragmentofvariousIgGinIVIG(pH4).Methods

5、TheclassicalcomplementactivationwascarriedoutindetermininationbiologicalactivityofFcfragmentinIVIG(pH4)byusing6differentantigenscoupled-tannedredbloodcells(RBC),respectively.FirstfItisbypreparationofmeaslesvaccines,rubellavaccinesfHBsAg,tetanustoxin,P64koutermembraneproteinofMeningococcusanddiphther

6、iatoxincouplingtoRBCrespectively.ThenIVIGwereaddedtotheantigencoupledRBCtoformacomplex(antigensensitizedRBCandantibody).Finally9thecomplementwasaddedtothecomplex.MeasurementbiologicactivityoftheFcwasbymeansofdetectionin541nmandmakingcurvesforhaemolysis.Analysiswasperformedfor10timesbyusing6different

7、antigenwithdifferentconcentrationcoupledRBCfrespectively.VerificationwascarriedoutinconfirmationoftherepetitionforbiologicactivityofFcinIVIG.ResultsThehaemolysiscurveswereinslopelinesfor5differentantigens(measlesvaccines,rubellavaccinesfHBsAg,tetanustoxin,andp64kproteinonoutermembraneproteinofMening

8、ococcus)coupledRBC.However,haemolysiscurvefordiphtheriatoxoidcoupledRBCwasverytypicalandformedaclassical"S"curve.ThebiologicactivityofFcfragmentinIVIGcouldreachtomorethan80%byusingof6differentantigensincomparisonof收稿日期：201210-17；修回日期：2012-11-05referencematerials.Thetestforrepetitionofbiolo

9、gicactivityof作者簡介:席亮(1970-),男，醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師，主要從事生物FcinIVIGwasinanormalrange.ConclusionDetermination制品質(zhì)量保證工作。onbiologicactivityforFcfragmentinIVIGwasattemptedby通信作者:劉曉,E-mail：boylxl006usingmultipleantigensinthisstudyfwhichprovidedaprimarybasisinthisaspect.Keywords：Antigens;IntravenousImmunoglobulin(IV1G);

10、Fcfragment;Biologicactivity靜注人免疫球蛋白主要成分為IgG。IgG最主要的生物學(xué)功能是對微生物的調(diào)理作用。調(diào)理作用是微生物特異結(jié)合的抗體通過完整的IgG的Fc段與吞噬細(xì)胞的Fc受體結(jié)合，形成抗原抗體吞噬細(xì)胞的復(fù)合物，促使吞噬細(xì)胞對微生物的吞噬。所以，正常的調(diào)理作用需要IgG識別吞噬細(xì)胞表面Fc受體，這首先要求IVIG中IgG要有完整的Fc段生物學(xué)活性。另外JVIG對自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制也往往通過Fc段來完成,包括效應(yīng)細(xì)胞Fc受體的競爭性抑制、抑制性FcyRflB受體的誘導(dǎo)及FcRn受體飽和作用等。因此,IVIG的Fc段在體內(nèi)能否發(fā)揮良好的生物學(xué)活性與臨床療效

11、密切相關(guān)。生物制品的生物學(xué)功能應(yīng)通過臨床試驗來證實，但是一些體外檢測指標(biāo)也能間接證實其生物學(xué)活性。為體外檢測IVIG制品臨床應(yīng)用的有效性,1997年歐洲藥典已將1VIG的Fc段活化補體的功能作為質(zhì)控指標(biāo)來考核制品的質(zhì)量。中華人民共和國藥典）2010年版三部也已介紹了Fc生物學(xué)活性檢測方法。歐洲藥典和中華人民共和國藥典介紹的Fc段生物學(xué)活性的檢測方法基本一致，只能檢測針對某一種抗原的抗體Fc段生物學(xué)活性。這樣僅能了解IVIG中針對特定一種抗原的抗體生物學(xué)活性。為了解針對多種抗原抗體的Fc段生物學(xué)活性，一種途徑可以選擇多種抗原分別致敏紅細(xì)胞;第二,可以選用多種抗原的混合物致敏紅細(xì)胞;另外，可以采用

12、IgG的Fc能夠與吞噬細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合的原理來測定IVIG中抗體的Fc段的生物學(xué)活性，此種方法能夠測定IVIG中所有抗體的Fc段生物學(xué)活性，這對于體外評價IVIG的有效性更有利?；谀壳癐VIG的Fc生物學(xué)活性檢測方法和實驗條件的限制，為了能夠觀察IVIG中針對多種抗原的抗體Fc段生物學(xué)活性，研究選用6種抗原分別檢測IVIG中抗體Fc段生物學(xué)活性，期望能更全面地了解IVIG中針對多種抗原IgG的Fc段生物學(xué)活性。1材料和方法1.1試劑與儀器磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氫氧化鈉、單寧酸（鞋酸）和氯化銘均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；巴比妥鈉購自Sigma公司；

13、牛血清白蛋白購自上海伯奧生物科技有限公司;U-2001型紫外分光光度計為HITACHI公司生產(chǎn);ModelJ-6M型離心機(jī)購自Beckman公司；HZS-H型恒溫水浴振蕩器購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;1VIG參考品為隨機(jī)抽取蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司（以下簡稱蘭州公司）生產(chǎn)的一批IVIG（pH4）以IVIG（pH4）國家標(biāo)準(zhǔn)品為參考品自行標(biāo)定的工作標(biāo)準(zhǔn)品，批號為R20120503,蛋白含量為50g/L；麻疹疫苗和風(fēng)疹病毒由蘭州公司疫苗一室提供;破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎球菌外膜蛋白P64k抗原由蘭州公司第一研究室提供；白喉類毒素由蘭州公司菌苗一室提供;乙肝表面抗原由蘭州公司血液制劑室保

14、存；人。型血由定西蘭生單采血漿有限公司岷縣站提供;補體采用豚鼠血清，由蘭州公司血液制劑室自行采集制備，補體效價為150CH50/mL；供試品為隨機(jī)抽取的蘭州公司生產(chǎn)的!VIC（pH4）o1.2方法1.2.1 6種抗原致敏紅細(xì)胞的最佳濃度優(yōu)化分別用原始濃度、2x稀釋和4x稀釋的6種抗原樣品致敏紅細(xì)胞，然后采用1.2.2介紹的方法測定其與補體反應(yīng)的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線，尋找抗原致敏紅細(xì)胞的最佳濃度。1.2.2 IVIG的Fc段激活補體的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線測定依據(jù)文獻(xiàn)2介紹的方法,首先用20mLPBS（pH7.2）洗滌人。型血紅細(xì)胞3次，再用1.3mg/L糅酸糅化紅細(xì)胞，采用10%氯化銘將適當(dāng)濃度的不

15、同抗原包被到紅細(xì)胞上，即為致敏紅細(xì)胞,致敏紅細(xì)胞濃度須在紫外分光光度計541nm處用牛血清白蛋白巴比妥緩沖液調(diào)節(jié)吸光值至1.0±0.1；按照表1的用量準(zhǔn)確取供試品、參考品和陰性對照（陰性對照用牛血清白蛋白-巴比妥緩沖液代替）加入致敏紅細(xì)胞孵育30min,用牛血清白蛋白.巴比妥緩沖液洗滌3次，用0.8mL的牛血清白蛋白-巴比妥緩沖液重懸統(tǒng)細(xì)胞。于紅細(xì)胞懸液中加入75CH50/mL補體后，抗體Fc段就會與補體結(jié)合,引發(fā)補體反應(yīng)，最終導(dǎo)致血細(xì)胞的細(xì)胞膜受到攻擊,血細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。加入補體后,立即在紫外分光光度計上541nm波長下記錄陰性對照、參考品和供試品的初始吸光值（4,）,然

16、后每分鐘記錄1次紫外吸光值（婦）。表1WIG的Fc段生物學(xué)活性測定各樣品的用量（mL）Tab.1VolumeofallsamplesusedindeterminationonFcfunctioninIVIG試驗組致敏紅細(xì)胞參考品供試品緩沖液補體參考品組0.10.9/0.2供試品組0.1/0.9/0.2陰性對照組0.1/0.90.2X參考品FC段生物學(xué)活性X100%時間A6424286陰性loooccibso-*-5(M)CCID5O-M-250CCID50141210810一陰性-1(MM)CC1D5O-5()OCC1D5M-M-2S0CCID500601201802403003r>04

17、2048。54060066072078084090()時間/s48642A：麻疹病毒;B：風(fēng)疹病毒;C：乙肝表面抗原;D：破傷風(fēng)類毒素;E：腦膜炎球菌P64k蛋白；F：白喉類毒素圖1使用不同濃度抗原致敏紅細(xì)胞與IVIG結(jié)合后分別與補體反應(yīng)的A即時間（s）溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線Fig.1HaemolysiscurvesforinteractionbetweencomplexofdifferentantigenscoupledRBCandIVIGandcomplementbytime1.2.3IVIG的Fc段生物學(xué)活性的計算在Excel中制作出4“時間（s）的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線，并計算出各曲線中相鄰三

18、點連接成直線的最大斜率S.P，并根據(jù)下述公式計算IVIG的Fc段生物學(xué)活性（IFc）。二供試品sy人一陰性對照sy4參考品Sex/1陰性曲線Sex/42結(jié)果2.16種抗原致敏紅細(xì)胞的濃度優(yōu)化結(jié)果在圖1AE中，麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、HBsAg、破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎球菌的P64k蛋白致敏的紅細(xì)胞與供試品和補體結(jié)合反應(yīng)后，測定的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線都比較平緩。而圖1F顯示，白喉類毒素致敏的紅細(xì)胞與同一供試品和相同濃度的補體反應(yīng)后測定的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線明顯下降，典型的“S”型曲線。從圖1可以看出,6種抗原分別以不同的濃度致敏紅細(xì)胞與補體的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線有差別。IVIG的Fc段生物學(xué)活性測定方法要求測

19、定的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線能夠計算出曲線相鄰三點的最大斜率即可用于計算Fc段生物學(xué)活性。麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、HBsAg、破傷風(fēng)類毒素、腦膜炎球菌P64k外膜蛋白致敏的紅細(xì)胞與補體反應(yīng)后測定的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線較平緩，而白喉類毒素致敏紅細(xì)胞與補體的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線呈典型的“S”型曲線。由于麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、HBsAg、破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎球菌P64k外膜蛋白5種抗原濃度的限制,試驗中以上5種抗原的濃度均采用最高濃度用于后續(xù)試驗。而白喉類毒素使用150Lf/mL,但是試驗沒有對更高濃度的抗原致敏紅細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的研究。2.26種抗原致敏的紅細(xì)胞測定IVIG的Fc段生物學(xué)活性結(jié)果表2為使用6種抗原致敏

20、的紅細(xì)胞測定供試品的Fc段生物學(xué)活性情況，結(jié)果顯示,6種抗原的致敏細(xì)胞檢測供試品的Fc段生物學(xué)活性結(jié)果均高于80%。但是測定的同一批樣品的Fc段生物學(xué)活性結(jié)果差別較大，可能是由于供試品中針對此類抗原的抗體滴度差別造成的。表2分別用6種抗原致敏的紅細(xì)胞測定WIG的Fc段生物學(xué)活性Tab.2TheresultsofbiologicalactivityofFcfragmentinIVIGbyusingdifferentantigenscoupledRBC抗原供試品Fc段生物學(xué)活性麻疹病毒117風(fēng)疹病毒132乙肝表面抗原98破傷風(fēng)類毒素82P64k蛋白118白喉類毒素1292.3采用6種抗原測定IVI

21、G的Fc段生物學(xué)活性的重復(fù)性.采用6種抗原致敏的紅細(xì)胞分別測定IVIG的Fc段生物學(xué)活性10次，以考察采用此方法測定IVIG的Fc段生物學(xué)活性的重復(fù)性，更進(jìn)一步驗證結(jié)果的可靠性。表3所列數(shù)據(jù)顯示,6種抗原致敏的紅細(xì)胞測定IVIG的Fc段生物學(xué)活性結(jié)果較穩(wěn)定。表3采用6種抗原致敏的紅細(xì)胞測定IVTG的Fc段生物學(xué)活性試驗Tab.3TheresultsofbiologicalactivityofFcfragmentinIVIGbyusingdifferentantigenscoupledRBCintested試驗次數(shù)F。段生物學(xué)活也）麻疹病毒風(fēng)疹病毒乙肝表面抗原破傷風(fēng)類毒素P64k蛋白白喉類毒素1

22、1091349986109972108123878711298399109888010911441001129690107945113108868611189610912097921029671141089084107109811111883891061039104104828711410210951249181112101x±s106±6.1116±8.683±8.986±3.6109±3.4100±6.33討論20世紀(jì)40年代,Cohn-Oncley建立了適合工業(yè)化規(guī)模分離免疫球蛋白（IgG）的低溫乙醇法分離工藝，用該工

23、藝分離的IgG最初不能用于靜脈注射，原因是會產(chǎn)生嚴(yán)重的副反應(yīng)。這種副作用主要是與制劑中存在抗補體活性（ACA）有關(guān)。隨后IVIG的研制工作開始關(guān)注防止、減少ACA方面。于是，應(yīng)用胃酶或纖溶酶消化（酶解法）及化學(xué)修飾法減少ACA的方法相繼產(chǎn)生。但是，這些方法均會破壞IgG的結(jié)構(gòu)完整性，因而降低了IVIG的療效。要作用。20世紀(jì)80年代，人們開始開發(fā)天然、完!應(yīng)齊全，其含量與正常人血清IgG亞類分布相近，不=1IVIG的臨床療效與其生物功能密不可分,IgG分子的各個結(jié)構(gòu)域在機(jī)體的免疫反應(yīng)中均發(fā)揮著重的具有生物學(xué)效應(yīng)的IVIG0理想的IVIG應(yīng)具有與天然IgG相同的屬性,在制備IVIG過程中,IgG

24、亞類應(yīng)破壞其生物活性。由于IVIG的生產(chǎn)工藝中很多工藝步驟會影響IgG的Fc段生物學(xué)活性，所以建立IVIG的Fc段生物學(xué)活性的檢測方法是十分必要的。國內(nèi)王誓舟等在2003年就已經(jīng)建立了檢測方法，該方法已經(jīng)在中華人民共和國藥典2010年版三部中收載，但是在IVIG的Fc段生物學(xué)活性日常檢測中還受到很多因素的影響,并且該方法僅能檢測IVIG中一種抗原特異抗體的Fc段生物學(xué)活性。為盡可能地全面了解IVIG中多種抗原特異抗體的Fc段生物學(xué)活性,研究分別采用麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、乙肝表面抗原、破傷風(fēng)類毒素、腦膜炎球菌P64k蛋白和白喉類毒素6種抗原來測定蘭州公司生產(chǎn)的IVIGFc段生物學(xué)活性，為保證IVI

25、G質(zhì)量提供了參考依據(jù)。研究顯示,采用麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、乙肝表面抗原、破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎球菌P64k蛋白作為抗原，測定的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線較平緩，可能因為IVIG中針對這些抗原的抗體水平較低。但白喉類毒素作為抗原測定的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線下降明顯，是典型的“S”型曲線。通過計算,6種抗原的致敏細(xì)胞檢測供試品的Fc段生物學(xué)活性結(jié)果均高于80%o另外，在此基礎(chǔ)上,分別用6種抗原致敏的紅細(xì)胞檢測10次IVIG的Fc段生物學(xué)活性，結(jié)果顯示此檢測方法重復(fù)性良好。研究選用了6種抗原來檢測IVIG的Fc段生物學(xué)活性，國內(nèi)外有些學(xué)者也曾選用不同的抗原來進(jìn)行檢測，但采用乙肝表面抗原和腦膜炎球菌P64k外膜蛋白為抗原致敏紅細(xì)胞測定供試品Fc段生物學(xué)活性的研究在國內(nèi)外還未見報道。Vroljak等使用破傷風(fēng)類毒素作為抗原來檢測人免疫球蛋白的Fc段生物學(xué)活性，檢測方法準(zhǔn)確度較高。王菁舟等研究了使用風(fēng)疹抗原、麻疹抗原、流行性腮腺炎抗原和白喉類毒素檢測人免疫球蛋白的Fc段激活補體的功能，研究結(jié)果顯示，無論使用何種抗原，只要抗原效價為1：64J:128和1：256,所得的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線均為一條直線，而用效價為1：512的抗原進(jìn)行試驗得到較好的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線。歐洲藥典推薦使用風(fēng)疹病毒作為抗原來檢測,中華人民共和國藥典推薦致敏紅細(xì)胞的抗原使用白喉類毒素或流行性腮腺炎病毒，說明抗原的選擇應(yīng)該考慮