雄黃中砷對(duì)大鼠肝腎功能的影響

1、雄黃中砷對(duì)大鼠肝腎功能的影響 【摘要】 【目的】采用混合效應(yīng)線性模型評(píng)價(jià)不同毒性劑量雄黃在大鼠體內(nèi)的血砷濃度變化及對(duì)其肝腎功能的影響?！痉椒ā窟x用SD大鼠分別單次灌服3738、1869、0935g/kg雄黃，測(cè)定不同劑量組大鼠藥后各時(shí)間點(diǎn)/段血砷濃度及尿N乙酰D氨基葡萄糖苷酶(NAG)、堿性磷酸酶(AKP)活性，血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)活力，并采用混合效應(yīng)線性模型對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?！窘Y(jié)果】大鼠單次灌服不同劑量雄黃，尿AKP、NAG活力，血清BUN、GOT活力的改變有顯著的劑量依賴關(guān)系，并與血砷濃度變化有顯著的線性關(guān)系?！窘Y(jié)論

2、】在本研究劑量范圍內(nèi)，雄黃中的砷可造成腎小管上皮細(xì)胞及肝臟的損傷，但未影響到腎臟的排泄能力。 【關(guān)鍵詞】 雄黃/毒性;砷/血液;肝腎功能;混合效應(yīng)線性模型;大鼠雄黃(realgar)為硫化物類礦物雄黃族雄黃，具有燥濕、殺蟲、解毒之功效，既可單獨(dú)使用也可在復(fù)方中配伍使用?，F(xiàn)代藥理研究顯示1，雄黃具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用，臨床上多用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、帶狀皰疹、膿皰瘡、潰瘍性黑色素瘤、淋巴結(jié)核等疾病。雄黃是一種常見的含砷礦物藥，而砷(As)是一種常見的環(huán)境毒物和已知的人類致癌物。近年來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)調(diào)查均表明砷可引起不同程度的肝腎功能損傷3-4。現(xiàn)就毒性劑量

3、下，雄黃在大鼠體內(nèi)血砷濃度變化的毒代動(dòng)力學(xué)及對(duì)大鼠肝腎功能的影響進(jìn)行研究，以期為雄黃的合理、安全使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。1材料與方法11儀器AFS920型雙道原子熒光光度計(jì)(中國(guó)北京吉天儀器公司產(chǎn)品)，As2型高性能砷空心陰極燈(中國(guó)北京有色金屬研究總院產(chǎn)品)，MK1型光纖壓力自控微波溶樣系統(tǒng)(中國(guó)海新科微波技術(shù)應(yīng)用研究所產(chǎn)品)，Echo Lcd型全自動(dòng)生化分析儀(意大利Lagotech儀器公司產(chǎn)品)，UV260型紫外可見光分光光度計(jì)(日本Shimadaz公司產(chǎn)品)。12主要試劑As標(biāo)準(zhǔn)溶液：1000g/mL，5%H2SO4介質(zhì)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)溶液GSB G 6202790，國(guó)家鋼鐵

4、材料測(cè)試中心配制;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT)試劑盒，上?？迫A東菱診斷用品有限公司，批號(hào)：20070112;天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)試劑盒，上?？迫A東菱診斷用品有限公司，批號(hào)：20070122;肌酐(Cr)試劑盒，上海科華東菱診斷用品有限公司，批號(hào)：20070320;尿素氮(BUN)試劑盒，上?？迫A東菱診斷用品有限公司，批號(hào)：20061222;堿性磷酸酶(AKP)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20070208; N乙酰D氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒，上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：67115。13受試動(dòng)物SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(30050)g，清潔級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

5、提供，合格證號(hào)：0026252。14受試藥雄黃由廣州藥材公司購(gòu)得，批號(hào)：20040612。經(jīng)氫化物發(fā)生原子熒光法(HGAFS)測(cè)定其中As2S2的含量為9829g/kg，符合中華人民共和國(guó)藥典規(guī)定;經(jīng)測(cè)定可溶性砷為(49900223)g/kg，其中可溶性砷中的三價(jià)砷為(24290195)g/kg。15給藥劑量和方法SD大鼠分為3組，分別一次性灌胃雄黃高劑量3738g/kg、中劑量1869g/kg、低劑量0935g/kg，灌胃量為10mL/kg。給藥前12h禁食，不禁水。16樣品采集161采血時(shí)間點(diǎn)及方法分別于藥前，藥后0、005、015、025、05、075、1、2、3、4、6、8、12、24

6、、32、48、56、72、80、96、168h眶后靜脈叢采血約10mL。張娟，等.雄黃中砷對(duì)大鼠肝腎功能的影響第4期2010年第27卷廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)162分組每個(gè)劑量組32只大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，第1組在藥后005、075、4、24、72h采血，第2組在藥后015、1、6、32、80h采血，第3組在藥前、藥后0、025、2、48、96、168h采血，第4組在藥后05、3、8、12、56h采血。血樣經(jīng)2400r/min離心10min分離血清，于-70冰箱保存待測(cè)。17檢測(cè)指標(biāo)準(zhǔn)確量取0406mL血清于聚四氟乙烯溶樣杯中，加入濃硝酸2mL，室溫下放置2h進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，然后進(jìn)行微波消化，05

7、、10mPa壓力下各加熱2min，冷卻后開啟消解罐。將聚四氟乙烯溶樣杯置于電熱板上加熱，趕盡NO2和過(guò)剩的HNO3，加水定容至10mL，稀釋一定倍數(shù)，測(cè)定樣品中血砷濃度。取第3組藥前、藥后0、025、96、168h血清，用于GOT、GPT、Cr、BUN測(cè)定;收集第1組大鼠096h各時(shí)間段尿液用于尿NAG、AKP的測(cè)定。18統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS 913 統(tǒng)計(jì)分析軟件(SAS. . Institute Inc.， Cary， NC， USA.)進(jìn)行混合效應(yīng)線性模型的分析?；旌闲?yīng)線性模型：Yijk=0j+1jArsenicij+b0i+ijk變量說(shuō)明：Y代表待測(cè)指標(biāo)(AKP、NAG、BUN、GOT

8、、Cr、GPT);i=1，2，3，分別代表雄黃高、中、低劑量組;j=1，2，3，分別代表待測(cè)指標(biāo)不同測(cè)量點(diǎn);k=1，8，代表第k次重復(fù)測(cè)量;Arsenicij代表第i個(gè)劑量組，在第j次測(cè)定待測(cè)指標(biāo)時(shí)間點(diǎn)，平均血砷濃度去空白變化值;0j代表在第j次采血測(cè)量指標(biāo)的時(shí)間段內(nèi)，血砷濃度變化為零時(shí)，待測(cè)指標(biāo)的去空白的測(cè)量值(即截距)，單位與待測(cè)指標(biāo)的單位相同;1j代表在第j次采血測(cè)量指標(biāo)的時(shí)間段，單位血砷濃度上升時(shí)，待測(cè)指標(biāo)平均上升的值(即斜率)，單位為“待測(cè)指標(biāo)/血砷濃度”;0j和1j共同表達(dá)固定效應(yīng)，即血砷濃度變化對(duì)待測(cè)指標(biāo)的影響;b0i代表不同劑量組的隨機(jī)效應(yīng)，即不同劑量對(duì)待測(cè)指標(biāo)與血砷濃度之間關(guān)

9、系的影響;ijk代表隨機(jī)誤差。2結(jié)果21大鼠單次灌服雄黃后各劑量組血砷濃度時(shí)間關(guān)系結(jié)果見圖1。大鼠單次灌服雄黃后，總砷在血清中吸收較快，分布、清除較緩慢，整個(gè)藥時(shí)過(guò)程中出現(xiàn)2個(gè)峰。高、中、低劑量組吸收半衰期t1/2(Ka)分別為146、0716、1542h;分布半衰期t1/2()分別為773、9437、8895h;消除半衰期(t1/2)分別為1721、24285、24234h;達(dá)峰時(shí)間tmax分別為3、6、1h。22血砷濃度對(duì)尿酶活性的影響結(jié)果見圖2和表1。為比較各時(shí)間段尿酶活力和血砷濃度的關(guān)系，故將各時(shí)間段內(nèi)所測(cè)得各時(shí)間點(diǎn)血砷濃度進(jìn)行平均，得到血砷的時(shí)間段數(shù)據(jù)。圖2-a、b中上面的3個(gè)圖從左

10、到右分別是低、中、高劑量雄黃組在10個(gè)時(shí)間段(time1)的AKP、NAG活力，下面的3個(gè)圖從左到右分別是低、中、高劑量雄黃組在10個(gè)時(shí)間段(time1)的血砷濃度去空白的變化值。其中time1=1、2、10分別代表02h、26h、612h、1224h、2432h、3248h、4856h、5672h、7280h、8096h。圖中折線是對(duì)圖中的數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值的連接。固定效應(yīng)參數(shù)估計(jì)隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)估計(jì)時(shí)間段j截距(0j)斜率(1j)劑量組截距(b0i)02h1272819-01142低劑量組-3797526h2187564-004413612h3184853-0022161224h4247017-0

11、062332432h514502800662中劑量組0018013248h6157450006674856h7223596001535672h8256725-00466高劑量組377957280h919261702278096h1027544207704注：表示血砷濃度和AKP之間有顯著的線性關(guān)系(P=00134);表示3248h時(shí)間段斜率顯著比02h時(shí)間段高01809(P=00094);表示4856h時(shí)間段斜率顯著比02h時(shí)間段高01295(P=00103);表示7280h時(shí)間段斜率顯著比02h時(shí)間段高03412(P=00107);表示8096h時(shí)間段斜率顯著比02h時(shí)間段高08846(P0

12、0001)表1-a中固定效應(yīng)參數(shù)估計(jì)說(shuō)明，血砷濃度和AKP活力之間存在顯著的線性關(guān)系(P=00134)。從表中對(duì)應(yīng)的參數(shù)估計(jì)可以看出，在實(shí)驗(yàn)的前期，即224h各時(shí)間段的斜率比02h低，血砷濃度變化對(duì)AKP的影響基本是下降或接近水平。由此說(shuō)明，在實(shí)驗(yàn)前期， 隨著血砷濃度變化，AKP下降，隨時(shí)間推移下降幅度在變小;但是在后面的3248h、4856h、7280h和8096h時(shí)間段， 其斜率顯著高于02h時(shí)間段(均P002)，效應(yīng)的參數(shù)估計(jì)分別是00667、00153、0227、 07704。即在實(shí)驗(yàn)的后期，隨著血砷濃度變化，AKP上升，隨時(shí)間推移上升的幅度變大;通過(guò)隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)估計(jì)可以看出，雄黃給藥

13、劑量對(duì)AKP的影響是高劑量的AKP比群體平均劑量高出37795;中劑量基本與群體平均劑量類似，只高出001801;低劑量比群體平均劑量低37975。表1-bNAG活力和血砷濃度混合效應(yīng)線性模型的參數(shù)估計(jì)固定效應(yīng)參數(shù)估計(jì)隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)估計(jì)時(shí)間段j截距(0j)斜率(1j)劑量組截距(b0i)02h160789-00285低劑量組-0987326h235021-000779612h329539-0002251224h46080403-0019742432h579626-003027中劑量組031903248h6538970013354856h7621830018475672h8118877-00789

14、9高劑量組066837280h969767012128096h1010084406471注 ：表示血砷濃度變化和NAG活力之間有顯著的線性關(guān)系(P=00094);表示3248h時(shí)間段斜率顯著比02h時(shí)間段高004185(P=00113);表示4856h時(shí)間段斜率顯著比02h時(shí)間段高004697(P=00001);表示7280h時(shí)間段斜率顯著比02h時(shí)間段高01497(P00001);表示8096h時(shí)間段斜率顯著比02h時(shí)間段高06756(P00001);表示5672h時(shí)間段截距顯著比02h時(shí)間段高58088(P=00099);表示8096h時(shí)間段截距顯著比02h時(shí)間段高40055(P=0034

15、8) 表1-b中固定效應(yīng)參數(shù)估計(jì)說(shuō)明，血砷濃度變化和NAG活力之間存在顯著的線性關(guān)系(P=00094)。 從表中可以看出232h各時(shí)間段的斜率比02h時(shí)間段低，因此，在實(shí)驗(yàn)的前期，血砷濃度變化對(duì)NAG的影響基本是下降的，即隨著血砷濃度變化，NAG下降。但是在后面的3248h、4856h、7280h和8096h時(shí)間段， 其斜率顯著高于02h時(shí)間段 (均P002)，對(duì)應(yīng)的參數(shù)估計(jì)分別是001335、001847、01212、 06471。即在實(shí)驗(yàn)的后期，隨著血砷濃度變化，NAG上升，隨時(shí)間推移上升的幅度變大;通過(guò)隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)估計(jì)可以看到，雄黃給藥劑量對(duì)NAG的影響是給藥高劑量的NAG比群體平均劑量

16、高06683;中劑量比群體平均劑量高出03190;低劑量比群體平均劑量低-09873。23血砷濃度對(duì)血生化指標(biāo)的影響結(jié)果見圖3、表2和表3。為比較各時(shí)間段血生化指標(biāo)和血砷濃度的關(guān)系，故將各時(shí)間段內(nèi)所測(cè)得各時(shí)間點(diǎn)血砷濃度進(jìn)行平均，得到血砷的時(shí)間段數(shù)據(jù)。圖3-a、b、c、d上面的3個(gè)圖從左到右分別是低、中、高劑量組在3個(gè)時(shí)間段(time2)的血BUN、GOT、Cr、GPT值;下面的3個(gè)圖從左到右分別是低、中、高劑量組在3個(gè)時(shí)間段(time2)的血砷濃度去空白的變化值。其中time2=1、2、3 分別代表 0025h、02596h、96168h。圖中的折線是對(duì)圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)平均值的連接。表2BUN活力和

17、血砷濃度混合效應(yīng)線性模型的參數(shù)估計(jì)變量參數(shù)估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差P 值固定效應(yīng)截距-012360253406406血砷濃度變化: 斜率0007028000203800009低劑量組截距-032720437704570中劑量組截距034340451104489隨機(jī)效應(yīng)高劑量組截距174220503800009注：表示血砷濃度與BUN有顯著線性關(guān)系，斜率估計(jì)0007028顯著大于零(P=00009);表示高劑量組的截距顯著比群體平均劑量的截距高17422(P=00009)由表2的固定效應(yīng)可見，血砷濃度變化和BUN有顯著的線性關(guān)系(P=00009)。 隨著血砷濃度升高，BUN升高。因?yàn)橥ㄟ^(guò)運(yùn)用似然比檢驗(yàn)可知，

18、血砷濃度變化時(shí)間段的交互作用是不顯著的，說(shuō)明在不同的時(shí)間段，血砷濃度變化和BUN之間呈現(xiàn)相同的顯著的線性關(guān)系;隨機(jī)效應(yīng)說(shuō)明劑量對(duì)BUN的影響表現(xiàn)為高劑量的BUN比群體平均劑量顯著升高，增高量是3個(gè)劑量組中最大的，為17422(P=00009);中劑量比群體平均劑量高03434;低劑量比群體平均劑量低03272。不同劑量對(duì)固定效應(yīng)，即對(duì)“血砷濃度變化與BUN之間的相關(guān)關(guān)系”的影響不顯著。表3GOT活力和血砷濃度固定效應(yīng)及隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)估計(jì)固定效應(yīng)參數(shù)估計(jì)隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)估計(jì)時(shí)間段j截距(0j)斜率(1j)劑量組截距(b0i)0025h1685904-02120低劑量組-3976102596h22171

19、104-14316中劑量3671529-15821高劑量組-144063注：表示02596h時(shí)間段的截距顯著大于零(P=00382);表示0025h時(shí)間段的截距顯著比02596h時(shí)間段低-14852(P =00009);表示96168h時(shí)間段的截距顯著比02596h時(shí)間段低-14996(P=00006);表示02596h時(shí)間段的斜率顯著小于零(P00001);表示0025h時(shí)間段斜率顯著比02596h時(shí)間段高12196(P=00003)從表3中的固定效應(yīng)參數(shù)估計(jì)可見， 在開始的0025h時(shí)間段，血砷濃度變化對(duì)GOT基本是接近的，對(duì)應(yīng)的參數(shù)估計(jì)是-02120(P005)

20、;在中間的02596h時(shí)間段， 斜率顯著(P00001)，截距也顯著比0025h、96168h時(shí)間段高14852(P=00009)、14996(P=00006)，表中對(duì)應(yīng)的斜率估計(jì)是-14316。在實(shí)驗(yàn)的中期，GOT很高，隨著血砷濃度變化，GOT大幅下降，到后期截距回到671529，GOT回到實(shí)驗(yàn)前期的水平。即在不同的時(shí)間段，血砷濃度變化和GOT之間呈現(xiàn)出不同的顯著的線性關(guān)系;表中的隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)估計(jì)說(shuō)明了劑量對(duì)GOT的影響表現(xiàn)為高、中、低劑量比群體平均劑量分別低144063、高183825、低39761，但不同劑量對(duì)固定效應(yīng)，即對(duì)“血砷濃度變化與GOT活力之間的相關(guān)關(guān)系”的影響不顯著。根據(jù)統(tǒng)計(jì)

21、分析，結(jié)果顯示Cr和GPT與血砷濃度變化之間無(wú)顯著相關(guān)性。3討論大鼠單次灌胃給藥雄黃的毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中劑量的選擇是以前期急性毒性實(shí)驗(yàn)所得半數(shù)致死量(LD50)為根據(jù)而設(shè)定的，分別設(shè)定1/2 LD50、1/4 LD50、1/8 LD50為毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)高、中、低劑量組，其中高、中、低劑量間呈比例關(guān)系，低劑量組是臨床等效劑量的10倍。尿酶活性在急性腎臟功能損害評(píng)價(jià)指標(biāo)中最敏感， NAG和AKP主要反映腎小管上皮細(xì)胞的功能情況，而重金屬主要損害近段腎小管，因此考慮該2項(xiàng)指標(biāo)可能對(duì)評(píng)價(jià)大鼠單次灌服毒性劑量雄黃的肝腎毒性更為敏感。BUN是從蛋白質(zhì)的正常代謝中產(chǎn)生的廢物隨尿排出，因而其在血中的升高通常說(shuō)明腎的損害。由于BUN含量受營(yíng)養(yǎng)情況和肝臟毒性的影響，而后者可為許多藥物共有的作用結(jié)果，因此，在評(píng)價(jià)腎功能損害程度方面還要綜合血清肌酐檢查。Cr是肌酸代謝的產(chǎn)物，可完全經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)，隨尿排出，血清肌酐常用來(lái)評(píng)價(jià)腎臟的排泄能力。肝臟血清酶學(xué)最常用的檢測(cè)指標(biāo)是GPT和GOT。血清轉(zhuǎn)氨酶活性的高低與肝細(xì)胞受損的程度一致，GPT存在于肝細(xì)胞胞質(zhì)水溶性部分，存在于細(xì)胞質(zhì)水溶性部分及線粒體中。肝細(xì)胞損害嚴(yán)重時(shí)，不僅胞質(zhì)中的酶釋放出來(lái)，而且線粒體中