第二十章 膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)研究方法

1、 第二十章 膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)研究方法第一節(jié)膽固醇及膽固醇酯測(cè)定一、高效液相色譜分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇及膽固醇酯(一)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品配制稱1.5g標(biāo)準(zhǔn)膽固醇溶于少許乙醇中，逐漸升溫到2o°C，并把乙醇體積補(bǔ)滿到150ml,標(biāo)準(zhǔn)膽固醇的工作濃度分別為0.129(50)、0.258(100)、0.516(200)、1.032(400)、2.064 (800)。單位mmol/L(mg/L)。4下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?二)細(xì)胞內(nèi)膽固醇及膽固醇酯的提取將每10ml細(xì)胞收集人帶蓋的10ml塑料管中，1500r/min、4離心15min、去上清，用1ml 0.9%Nacl溶液重新稀釋細(xì)胞，冰浴中超聲破碎細(xì)胞。工作條件為

2、600W,工作時(shí)間為4s，間隙時(shí)間為8s，定時(shí)次數(shù)為6次。用Lowrry法測(cè)定蛋白含量。在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中加人等體積新鮮配制的15%醇溶性KOH(一20)，振蕩至細(xì)胞溶解產(chǎn)物清亮，加人6%的三氯乙酸去蛋白，再加人等體積的正己烷：異丙醇溶液(4:1,V：V)，將混合物渦旋5min，然后1500r/min、15離心5min，收集上層有機(jī)相。(三)高效液相色譜(high performa·ce liquid chromatogram,HPLC)分析采用Waters991型色譜系統(tǒng)，其中包括510泵、U-6K進(jìn)樣器、991型光電二極管矩陣監(jiān)測(cè)器、TCM色譜恒溫盒，采用Waters公司生產(chǎn)的Ge

3、n-PAK FAX柱，以異丙醇：正庚烷：乙腈(35:12:53,V：V：V)為流動(dòng)相，進(jìn)行非梯度洗脫，流速1ml/min，柱溫保持4(加冰塊)，紫外檢測(cè)時(shí)間12min，檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm.Gen-Pak FAX柱子在使用前用去離子水洗10min(流速0.5ml/min)以除去柱中的醇類物質(zhì)。(四)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇及膽固醇酯定量1、游離膽固醇的定量膽固醇以峰面積定量，蛋白質(zhì)用BCA法定量。參照PierceChemical公司的BCA試劑盒說(shuō)明書的方法進(jìn)行。按A ：B=50 ：1的比例配置顯色工作液。以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，并以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的吸光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取11支潔凈的試管，分別標(biāo)好111

4、,1號(hào)為空白管，26號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白管，711號(hào)為待測(cè)蛋白管?？瞻坠苤屑尤?ml AB顯色工作液，1ml蒸餾水，26號(hào)管分別按順序加人濃度為31.25、62.5、125、250、500µg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白0.1ml，分別加入AB顯色工作液0.9ml，蒸餾水1ml，7、8、9、10、11號(hào)管為待測(cè)樣品，各測(cè)定管分別加入待測(cè)蛋白0.1ml,AB顯色工作液0.9ml，蒸餾水1ml，混勻，37水浴30min，室溫放置，以蒸餾水為空白管調(diào)零，在波長(zhǎng)562nm下，測(cè)各管的OD值。2、膽固醇酯的定量 以膽固醇酯酶(cholesterol esterase,CEase)水解，以HPLC測(cè)定總膽固醇(to

5、tal cholesterol,TC)，以總膽固醇減去游離膽固醇(free cholesterol,FC)代表膽固醇酯(cholesteryl ester,CE)的量，以mg/g細(xì)胞蛋白為單位。3、膽固醇峰鑒定(1)保留時(shí)間：通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)膽固醇出峰時(shí)間與樣品中各峰的出峰時(shí)間，與膽固醇標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間接近的峰即可能是膽固醇峰。(2)外標(biāo)法：首先進(jìn)一針樣品，記錄其色譜圖，接著用相同樣品量與相當(dāng)量膽固醇標(biāo)準(zhǔn)混合進(jìn)針一次，記錄其色譜圖，樣品中加標(biāo)準(zhǔn)膽固醇液色譜圖中明顯升高的峰就可能是膽固醇峰。(3)內(nèi)標(biāo)法：待細(xì)胞處理結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，加人細(xì)胞裂解液500µl，反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞

6、，BCA法定量蛋白后，7.2%三氯乙酸沉淀蛋白，800g離心10min，取上清進(jìn)行膽固醇檢測(cè)，以豆甾醇為內(nèi)標(biāo)。取100µl上清液加入8.9mol/L，醇溶性氫氧化鉀溶液400µl，水解30min后使膽固醇酯為膽固醇。各待測(cè)樣品分別與內(nèi)標(biāo)混勻，用正己烷和無(wú)水乙醇抽提后，1.5mol/L三氧化鉻氧化衍生30min后，真空干燥，200µl乙腈：異丙醇(80 ：20)溶解樣品，進(jìn)樣進(jìn)行高效液相色譜分析，采用C18柱，柱溫4，流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，膽固醇以峰面積定量，內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)，計(jì)算值以蛋白含量校正（µg/g蛋白)。(4)光譜分析法：把樣品中各峰的

7、光譜圖形與標(biāo)準(zhǔn)膽固醇的光譜圖形進(jìn)行比較，與標(biāo)準(zhǔn)膽固醇光譜圖形相同的就是樣品中膽固醇峰。(5) L-B(Liberman-Burchard)反應(yīng)法：收集樣品中各峰，并濃縮，然后用L-B法直接顯色。具體操作如下：取10ml試管一支，往其中加人0.2ml樣品、0.5ml冰醋酸和5.0ml乙酸酐，于振蕩器上劇烈振蕩混勻，5min后1500g離心5min，吸取上清液4.0ml于25水浴5min，最后加0.2ml濃硫酸顯色，在630nm處比色，測(cè)定光密度值。注意以上幾種方法常聯(lián)合起來(lái)進(jìn)行分析。(五)高效液相色譜測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇及膽固醇酯的特點(diǎn)1、測(cè)定泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯的重要性 泡沫細(xì)胞(foam

8、cell) 的形成是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)步驟，研究泡沫化過(guò)程是探索動(dòng)脈粥樣硬化防治的一條重要途徑。泡沫細(xì)胞的形成是由于細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的積累而引起的，而泡沫細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)定義為細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯占總膽固醇的50%以上，因而，研究泡沫化過(guò)程的一個(gè)重要方面就是要求準(zhǔn)確地測(cè)定膽固醇與總膽固醇的比值。通過(guò)測(cè)定U937細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與總膽固醇，能找到一種判斷泡沫細(xì)胞與非泡沫細(xì)胞而較為精確實(shí)用的方法。2、高效液相色譜測(cè)定的特點(diǎn)  高效液相色譜具有適于微量分析的特點(diǎn)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者基本上不采用化學(xué)顯色法測(cè)定膽固醇(膽固醇酯)，而采用高效液相色譜的方法，如董軍等采用高效液相色譜法分析人胎肝細(xì)胞培養(yǎng)基

9、中7-酮基膽固醇。采用高效液相色譜測(cè)血清中膽固醇及胞內(nèi)膽固醇(膽固醇酯)測(cè)定要求較高。最近，國(guó)外學(xué)者采用HPLC分析胞內(nèi)膽固醇，但在細(xì)胞內(nèi)有些膽固醇酯種類尚未搞清楚的情況下，沒有標(biāo)準(zhǔn)品，因而，尚不能單獨(dú)依靠HPLC法來(lái)對(duì)膽固醇酯進(jìn)行精確定量。因此在對(duì)U937單核細(xì)胞株泡沫化前后胞內(nèi)膽固醇(酯)分析時(shí)，采用適于用核酸分離的Gen-PAX分離柱，能較為直觀地看出ox-LDL處理48h的U937細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的膽固醇酯的含量，并且其膽固醇酯與總膽固醇的比值大于50%，符合泡沫細(xì)胞的定義(這種處理的U937細(xì)胞以通過(guò)細(xì)胞形態(tài)鑒定，油紅O染色可見胞漿有許多細(xì)小的紅染脂質(zhì)顆粒，電鏡

10、下胞漿中可見大小不一的融合脂滴)，故可以認(rèn)為處理組細(xì)胞為泡沫細(xì)胞。采用異硫氰酸苯酯衍生法和苯甲酰氯衍生法雖能對(duì)膽固醇較好定量，但對(duì)膽固醇酯也同樣不好單獨(dú)定量。采用高效液相色譜雖具有很多優(yōu)點(diǎn)，但在操作時(shí)仍有很多值得注意的地方。其中之一是色譜柱的選擇，一般來(lái)說(shuō)，三種常規(guī)柱子(分子篩、反相、離子交換)中以反相柱分辨率最高，但由于膽固醇(酯)本身疏水性較強(qiáng)，如采用C18填料反相柱，即使采用非極性較強(qiáng)的洗脫劑(如正庚烷：異丙醇：乙腈)，膽固醇根本就無(wú)法從柱子上洗下來(lái)，如再采用非極性更高的洗脫劑，則黏度太大，壓力太高，造成分辨率低。有些非極性試劑即使可以把膽固醇(酯)洗下來(lái)，但表現(xiàn)出是一種非特異性洗脫，故

11、在HPLC分析膽固醇(酯)時(shí)采用疏水性較弱的柱子，Waters公司生產(chǎn)的Gen-PAX柱，是在以硅膠作填料的基礎(chǔ)上，在硅醇基上接上多聚堿基的陰離子材料，這種型號(hào)的柱子填料的堿基既具有部分疏水性，又具有部分陰離子交換的性質(zhì)。另外，我們采用真空冷凍干燥的濃縮方法，進(jìn)一步提高了該方法的靈敏度。通過(guò)圖20-1中“A”圖與“B”圖的比較，可見處理組細(xì)胞與非處理組細(xì)胞之間不但膽固醇酯與總膽固醇之比存在差異，其膽固醇酯的種類及不同膽固醇酯含量的多少都有可能存在差別。即有些種類的膽固醇酯可能在非泡沫細(xì)胞中原來(lái)沒有，而是在泡沫化過(guò)程中形成的；有些膽固醇酯種類也可能在泡沫化過(guò)程中丟失；有些則在泡沫化之前含量很少。

12、而在泡沫化過(guò)程中合成急劇增加；有些則在泡沫化前后無(wú)多大變化；有些則可能在泡沫化之前含量較多，而在泡沫化過(guò)程中含量較少。如能搞清楚以上所述這些膽固醇酯的變化，無(wú)疑有利于加深我們對(duì)泡沫化過(guò)程的了解。二、細(xì)胞內(nèi)膽固醇測(cè)定其他方法(一)化學(xué)法直接皂化-硫酸鐵銨比色法快速測(cè)定樣品中的膽固醇：準(zhǔn)確稱取充分混勻的樣品約0.20g于50ml具塞比色管中，加入2.0mol/L的K0H-乙醇溶液5.0ml，振蕩混勻，置65°C水浴中皂化30min(每隔5min振搖1次)后取出，經(jīng)流水冷卻，加入飽和氯化鈉溶液2.0ml后再加入石油醚20.0ml，旋渦混勻后離心分離，吸取上清液1.0ml于25ml具塞比色管

13、中，再于65°C水浴中通氮?dú)獯蹈?，加?.0ml冰醋酸溶解殘?jiān)?、加?.0ml硫酸鐵銨顯色劑，混勻，10min后在分光光度計(jì)560nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定。按測(cè)得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上査得相應(yīng)的膽固醇含量。         硫酸鐵銨儲(chǔ)備液：溶解4.463g硫酸鐵銨于100ml 85%磷酸中。硫酸鐵銨顯色劑；10ml硫酸鐵銨儲(chǔ)備液用濃硫酸稀釋至100ml，將此液放置在硅膠干燥器中備用。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液(1.0mg/m1)：準(zhǔn)確稱取膽固醇l00mg，溶于冰醋酸中，并稀釋至100ml。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.10mg/ml)取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10.0ml

14、，用乙酸稀釋至100ml.(二)生物法1、酶法(1)原理：以膽固醇酯酶(CEH)水解血清中的膽固醇酯(CE)，同時(shí)以膽固醇氧化酶(CHOD) 將膽固醇(chol)氧化成膽甾烯酮和過(guò)氧化氫(H2O2)的方法。終點(diǎn)產(chǎn)物的測(cè)定有4膽甾烯酮分光光度法及測(cè)H2O2的方法，其中應(yīng)用最廣的是用Trinder顯色反應(yīng)系統(tǒng)，試劑含過(guò)氧化酶(POD)、4-氨基安替比林(4-AAP)和酚，三者合稱PAP,目前，國(guó)內(nèi)膽固醇試劑盒都用這種方法。CEHCE十H2Ochol十脂肪酸 Chol十O24膽甾烯酮十H2O2PDOH2O2十4AAP十酚醌亞胺染料十4H2O紅色醌亞胺的最大吸收波長(zhǎng)為500nm，由于吸收峰平坦，波長(zhǎng)4

15、70550nm均可用，為了減少膽紅素與血紅蛋白的干擾，可用520nm比色。(2)試劑及純度CEH (EC3.1.1.13)：來(lái)源于假單胞菌屬等微生物，雜酶中葡萄糖氧化酶與尿酸酶應(yīng)小于0.01%，不含過(guò)氧化氫酶，比活約100U/mg酶蛋白(25°C，chol油酸酯為底物)。CHAD (EC1.1.3.6)：來(lái)源于諾卡菌等微生物，雜酶中葡萄糖氧化酶與尿酸酶應(yīng)小于0.01%，不含過(guò)氧化氫酶，比活約45U/mg酶蛋白(37°C，chol為底物)。POD(EC1.1 1.1.9)：來(lái)源于辣根，純度值(reinheitszahl比值，A403nm/A275nm）約為3.0，比活1000

16、U/mg酶蛋白(25，ABTS單位)。   表面活性劑Triton X-100:不含過(guò)氧化酶，不會(huì)使配好的酶試劑增加空白讀數(shù)。磷酸鹽、膽酸鈉、4-AAP與酚均為分析試劑。試劑配制(終點(diǎn)法測(cè)定用)。磷酸鹽緩沖液，pH7.7,0.3mol/L，CEH(假單胞菌)800U/L，CH0D(諾卡菌) 400U/L，POD(辣根1000U/L，膽酸鈉3mmol/L，4AAP 0.5mmol/L，酚3. 5mmol/L. Triton X-100 3g/L.緩沖液用于復(fù)溶其他試劑，酶與顯色劑可以分裝為兩管，其劑型可以為水溶液、凍干晶或干粉。磷酸鹽緩沖液可用Tris緩沖液替代，后者的濃度為

17、l00mmol/L,pH7.7，為了提高靈敏度，酚可以用其衍生物或其他色原代替。(3)膽固醇參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(standard reference material,SRM) ：TC測(cè)定要求做到標(biāo)準(zhǔn)化，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)取得一致，必須有準(zhǔn)確可靠的SRM.   酶法測(cè)血清TC時(shí)，由于血清中大部分膽固醇是酯化的，而血清基質(zhì)對(duì)這些酶促反應(yīng)有明顯的影響，故不宜采用純膽固醇結(jié)晶配制的溶液作為TC酶法分析的標(biāo)準(zhǔn)液，而應(yīng)以準(zhǔn)確定值的血清作為SRM,國(guó)際上有美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(NIST)的SRM909人血清及美國(guó)疾病控制中心(CDC)提供的定值人血清，我國(guó)已有國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)的"人血

18、清膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”(國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)GBW09138，衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所研制）。     血清SRM的TC定值應(yīng)按參考方法進(jìn)行。操作者必須訓(xùn)練有素，能準(zhǔn)確與熟練地掌握參考方法，測(cè)定誤差應(yīng)1%，參考方法中所用標(biāo)準(zhǔn)物為純膽固醇結(jié)晶，如美國(guó)NIST的SRM911b，其純度為(99.8%土0.1%)。我國(guó)相應(yīng)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)GBW09203a的純度也達(dá)到 (99. 8%土10. 1%).常規(guī)TC酶法測(cè)定中所用定值血清是商品TC試劑盒所帶的次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(可稱為定標(biāo)物或校正物calibrator)時(shí)須用我國(guó)的血清cholSRM(國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)GBW09138)為標(biāo)準(zhǔn)，用參考方法或文本規(guī)定

19、的酶法作準(zhǔn)確測(cè)定的定標(biāo)物使用。血清cho1SRM及定標(biāo)物有凍干的與冰凍保存的液態(tài)血清兩種，用前必須徹底混勻，血清保存太久可能出現(xiàn)渾濁，凍干血清復(fù)溶后也會(huì)有渾濁，一般不影響chol標(biāo)定值。(4)操作步驟：終點(diǎn)測(cè)定法：標(biāo)本(血清或血漿)10µl，標(biāo)準(zhǔn)液10µl，酶試劑1.0µl,設(shè)空白對(duì)照管。溫度與時(shí)間：37 5min或2025 10min，檢測(cè)波長(zhǎng)520nm，顏色穩(wěn)定至少60min，故在達(dá)終點(diǎn)后60min內(nèi)比色。計(jì)算公式：         TC(mmo1/L)=A1/A0×定標(biāo)血清TC濃度(mmol/L)注

20、：A1為測(cè)定樣品的吸光度值，A0為膽固醇標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值。2、熒光式光纖生物傳感裝置的測(cè)量原理  采用膽固醇氧化酶(C0D)作為傳感裝置的敏感基元，在膽固醇溶液中，COD對(duì)膽固醇的氧化起催化作用，膽固醇的氧化反應(yīng)如下所示：膽固醇十O2十COD4-膽烯酮十H2O2其中，C0D指膽固醇氧化酶，反應(yīng)中O2，的損耗量與溶液中膽固醇的含量成正比，因而通過(guò)測(cè)量耗氧量即可得出膽固醇的含量。熒光碎滅原理：根據(jù)物質(zhì)分子吸收光譜能級(jí)躍遷機(jī)制，具有吸收光子能力的物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光的照射下成為激發(fā)態(tài)分子，然后以輻射躍遷的形式降落到較低能級(jí)并在瞬間發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，即熒光。另有一些物質(zhì)與特定熒光物質(zhì)發(fā)生

21、作用可以導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，這就是熒光碎滅作用，產(chǎn)生這種作用的試劑稱為熒光碎滅試劑。熒光的碎滅過(guò)程可用Stern-volmer方程定量描述：I。/I=。/=1+KQ 式中，I。、I、。、分別為無(wú)氧和有氧環(huán)境下的熒光強(qiáng)度和壽命，K為Stern-Volmer常數(shù)，Q 為碎滅劑濃度，可以通過(guò)測(cè)量碎滅熒光強(qiáng)度以達(dá)到測(cè)量碎滅劑濃度的目的。因采用相移法測(cè)量所選用的光源經(jīng)過(guò)正弦調(diào)制，因而熒光試劑發(fā)出的熒光也呈正弦變化，并且相對(duì)于激發(fā)光有一滯后相移，它與熒光壽命存在如下關(guān)系：tan=式中，為正弦調(diào)制信號(hào)角速度，=2，為正弦調(diào)制信號(hào)的頻率。結(jié)合上面兩式，可以得出以下關(guān)系tan。/tan=1+ KQ 式中，。和分別

22、為無(wú)氧和有氧時(shí)的滯后相移。從上式可以看出，測(cè)量碎滅熒光強(qiáng)度已轉(zhuǎn)化成測(cè)量膽固醇溶液進(jìn)行催化反應(yīng)后的氧碎滅滯后相移值，在測(cè)定出各氧氣分壓和溶解氧含量的滯后相位值，通過(guò)作圖得到傳感裝置的特征曲線，然后由測(cè)出的任意氣體氧分壓、膽固醇溶液和血漿溶液的滯后相移值，通過(guò)換算求出所測(cè)氣體氧的分壓、膽固醇溶液的濃度和人體血漿中膽固醇的含量。第二節(jié)泡沫細(xì)胞模型及膽固醇流入/流出模型一、泡沫細(xì)胞模型(一)U937泡沫細(xì)胞模型1、氧化型低密度脂蛋(oxided low density lipoprotein，LDL）的制備    超速離心提取LDL。0.8%瓊脂糖凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色顯示為單一

23、條帶。采用Lowry方法,以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得LDL濃度為2.5 g/L。將LDL置于含10µmol/L Cu2SO4的PBS中37透析12h后，在含0.1%EDTA的PBS中透析24 h,0.2µm微孔濾膜過(guò)濾除菌備用。用硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)含量來(lái)鑒定LDL的修飾程度。以四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品，用每毫克LDL蛋白中丙二醛的含量來(lái)表示。按說(shuō)明書操作，測(cè)得新鮮LDL的丙二醛為2.1µmo1/g，經(jīng)CuSO4處理的LDL即ox-LDL的丙二醛含量為25.3µmol/g。   2、U937細(xì)胞的培養(yǎng)及處理U937細(xì)胞株系人類單核細(xì)胞系

24、，倍增時(shí)間為2448h,在含10%胎牛血清的RPMI-1 640培養(yǎng)基中呈懸浮生長(zhǎng)。U937細(xì)胞置于37。C含5%CU2和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為10 9個(gè)/L左右，毎兩天換液一次。將新?lián)Q液的U937細(xì)胞分為對(duì)照組和處理組，對(duì)照組只加培養(yǎng)基，處理組另加ox-LDL至終末濃度為80mg/L，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞。   3、U937細(xì)胞油紅O染色  收集細(xì)胞低速離心制成細(xì)胞懸液，涂于干凈的被有1%，明膠的玻片上，自然晾干。2.5%的戊二醛固定3h2.5%重鉻酸鉀處理16h新鮮配制的0.3%油紅O染色 20min氧化蘇木精襯染2min丙酮脫水125s 后PV

25、P封片。各步驟間均用雙蒸水沖洗干凈。胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅染顆粒的為脂質(zhì)染色陽(yáng)性。4、U 937細(xì)胞透射電鏡觀察 以1：1(V/V)的比例在每瓶培養(yǎng)細(xì)胞中加入2%戊二醛預(yù)固定30min，低速離心20min，去上清后制備出細(xì)胞團(tuán);以每份細(xì)胞團(tuán)與5份2%戊二醛的比例固定細(xì)胞。標(biāo)本送電鏡室行透射電鏡檢查。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)在透射電鏡下表現(xiàn)為泡。5、泡沫細(xì)胞內(nèi)形態(tài)學(xué)分析 泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的堆積在形態(tài)學(xué)上也有相應(yīng)的改變。光鏡下，正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯紅染顆粒，而處理組細(xì)胞體積增大·細(xì)胞漿內(nèi)可見較多的紅染顆粒，提示細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分增加。同樣，在透射電鏡下，正常對(duì)照組細(xì)胞漿內(nèi)無(wú)脂質(zhì)空泡(圖20-2左圖)，經(jīng)ox-TLD

26、L處理的細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量的脂質(zhì)空泡(圖20-2右圖)。光鏡和電鏡結(jié)果表明o×-LDL處理的細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量脂質(zhì)堆積。 泡沫細(xì)胞的生物學(xué)特征有二：其一是在形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞漿內(nèi)脂質(zhì)成分明顯增多，并聚集成商，蘇木索-伊紅染色鏡下可見胞漿呈泡沫樣改變；其二是細(xì)胞內(nèi)總膽固醇增加，且膽固醇酯占總膽固醇的一半以上。采用人類單核細(xì)胞株U937與80mg/L的ox-LDL孵育48h，模型細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)特別是膽固醇酯明顯增加，超過(guò)了膽固醇的含量。光鏡下處理組細(xì)胞經(jīng)油紅O染色胞漿內(nèi)可見明顯的紅染的脂質(zhì)顆粒；透射電鏡下處理組細(xì)胞內(nèi)可見大量的脂質(zhì)空泡，在生化和形態(tài)學(xué)上符合泡沫細(xì)胞的定義。提示成功地建立了人單核細(xì)胞

27、源性泡沫細(xì)胞模型。用高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)微量的膽固醇和膽固醇酯，克服了以往化學(xué)和博學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯的不足，提高了膽固醇和膽固醇酯檢測(cè)的穩(wěn)定性和靈敏度在形態(tài)學(xué)觀察上光鏡和透射電鏡相結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀可靠。以U937細(xì)胞株為基礎(chǔ)建立的泡沫細(xì)胞模型來(lái)源于人類的單核細(xì)胞，比其他動(dòng)物源性的如J744巨噬細(xì)胞及C57BL/6J小鼠腹膜巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞更接近于人體。曾有人用外周血單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞與100mg/L的乙?；疞DL孵育48h后獲得人單核細(xì)胞來(lái)源的泡沫細(xì)胞的報(bào)道，與本模型使用ox-LDL劑量和時(shí)間相近，但本模型使用的是已證明在As斑塊內(nèi)存在的o×-LDL

28、,且避免了個(gè)體差異，也避免了從人體取材原代細(xì)胞培養(yǎng)的麻煩，能為研究泡沫細(xì)胞提供大量穩(wěn)定可靠的細(xì)胞材料；U937細(xì)胞無(wú)經(jīng)典的A類清道夫受體，但存在B類清道夫受體CD36，故本泡沫細(xì)胞模型有利于研究CD36功能?？傊?，該細(xì)胞模型是在離體細(xì)胞水平上建立了As損傷中的一種病理細(xì)胞模型，為研究泡沫細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的機(jī)制提供了新的工具，也為篩選泡沫化相關(guān)基因的順利進(jìn)行奠定了可靠的基礎(chǔ)。(二)THP-1泡沫細(xì)胞模型 1、細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞用含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加青霉素和鏈霉素各1.0× 105 

29、;U/L。在每次實(shí)驗(yàn)前用160 nmol/L佛波酯孵育THP-1細(xì)胞24h，使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。 2、油紅O染色 細(xì)胞被處理后，1%HCI分色及返藍(lán)后，水性封片劑封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，適用于中性脂肪染色。3.操作步驟(1)將細(xì)胞培養(yǎng)于放有消毒蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)。(2)用PBS洗3次，50%異丙醇固定1min.(3)油紅O染色液染色8min，蘇木素染色6min.(4)1%鹽酸酒精分色。(5)水漂洗10min或于稀碳酸鋰水溶液中促藍(lán)，裱于玻片，把周圍水分抹干。(6)圖像分析系統(tǒng)收集圖像并顯微鏡下攝像。4、染色 結(jié)果判定：中性脂肪呈紅色，胞核藍(lán)色(圖20

30、 3)。5、注意事項(xiàng)（1）用于脂肪易溶于有機(jī)溶劑，所以顯示脂肪一般不能像石蠟切片一樣處理，而通過(guò)冰凍切片染色來(lái)顯示。(2) 作脂肪染色的冰凍切片不能太薄，過(guò)薄的切片常會(huì)使脂質(zhì)丟失。(3) Mayer蘇木素復(fù)染時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。(4) 染色結(jié)果不能長(zhǎng)期保存，應(yīng)盡快觀察及照相。(三)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞模型 收集巨噬細(xì)胞。取C57BL/6J小鼠80只(雄性，10周齡，23g左右)，腹腔注射2ml無(wú)血清培養(yǎng)基RPMI1640,96h后注射4ml RPMI1640收集腹膜巨噬細(xì)胞，以109/L.密度種植在培養(yǎng)瓶中，每瓶2ml，在37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，棄培養(yǎng)液，PBS沖

31、洗未貼壁的細(xì)胞組分，重復(fù)3次。分別加人4ml的空白對(duì)照培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的RPMI1640)和10g/ml ox-LDL,孵育96h，可建立腹腔巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞模型。(四)血管平滑肌巨噬細(xì)胞模型 血管平滑肌細(xì)胞的收集與培養(yǎng)：貼壁法收集血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)。行無(wú)菌操作取豬胸主動(dòng)脈，去脂肪組織，PBS和D-Hank液依次沖洗，37以0.25%胰酶消化37min，刮除內(nèi)皮細(xì)胞，剝離中膜，剪碎，組織黏塊，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中行原代培養(yǎng)，原代細(xì)胞呈融合生長(zhǎng)時(shí)棄去培養(yǎng)液，D-Hank液沖洗2次，0.

32、125%胰酶消化35min，棄消化液加含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，自瓶壁刮下細(xì)胞，收集培養(yǎng)液，以2× 107/L密度種植于50ml培養(yǎng)瓶。1周后細(xì)胞融合，按相同的方法繼續(xù)傳代，傳至第35代的細(xì)胞鋪滿后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，分別加入4ml的空白對(duì)照培養(yǎng)液(含20%胎牛血清的M199)，15µg/ml ox-LDL,孵育72h，可建立血管平滑肌源性泡沫細(xì)胞模型。 巨噬細(xì)胞用0.25%胰酶消化lmin，平滑肌細(xì)胞用0.125%胰酶消化5min，收集細(xì)胞，以1000r/min離心10min，棄上清，用PBS沖洗1次，加人異丙醇0.5ml，在超聲波清

33、洗器震動(dòng)10秒/次×3次，以1000r/min離心15min。吸上清，分別用總膽固醇、游離膽固醇試劑盒測(cè)定總膽固醇及游離膽固醇。離心沉淀物用0.1mol/L NaOH0.5ml裂解細(xì)胞，用Lowry法測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)含量，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量用每克細(xì)胞蛋白質(zhì)所含的總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯來(lái)表示，膽固醇酯含量由總膽固醇和游離膽固醇的差值獲得(五)乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)制備及鑒定1、LDL的分離 購(gòu)買健康人血漿，制備低密度脂蛋白，將210ml血漿置超速離心機(jī)作序列超速離心。首先4、42 000r/min離心18h，用吸管仔細(xì)吸出上層乳白色液體(VLDL)及

34、次層淡黃色液體(IDL)，收集下層液體，然后加入固體KBr 17.9g使最終密度為1.063g/ml，并加血漿密度標(biāo)準(zhǔn)緩沖液使總體積為210ml，再置超速離心機(jī)中，于42 000r/min、4下離心20h，用吸管仔細(xì)吸出漂浮于離心管頂部橙黃色液體即得LDL。提純的LDL在含200µmol/L  EDTA的BPS液中透析48h，過(guò)濾除菌，BCA法定量蛋白，用PBS液調(diào)節(jié)蛋白濃度至1mg/ml,4保存。2、LDL的乙酰化修飾 16ml LDL中加人1 ml 0.15mol/l NaCL和1 ml飽和醋酸鈉，冰浴中不斷攪拌，然后醋

35、酸酐24µl以小液滴 (2¢µl/滴) 形式于冰浴中不斷攪拌下1 h內(nèi)全量加入，加入后繼續(xù)攪拌30min，將反應(yīng)溶液移人透析袋中，在Ac-LDL透析液(0.15 mol/l NaCl，0.3mmol/L EDTA)中4透析24 h。過(guò)濾除茵，4保存。3、Ac-LDL的鑒定 取氧化和乙?；昂蟮腖DL，經(jīng)5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，2.5 %考馬斯亮藍(lán)常規(guī)染色，脫色后可見清晰的LDL條帶，同時(shí)采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。二、膽固醇流入/流出模型(一)Caco-2膽固醇流入/流出細(xì)胞模型 Caco-2細(xì)胞是

36、一種人結(jié)腸癌細(xì)胞，其具有與小腸上皮細(xì)胞相同的微絨毛結(jié)構(gòu)和緊密連接。如主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)：糖類、氨基酸、二肽、膽酸及維生素B12內(nèi)源性因子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體。酶包括小腸細(xì)胞刷狀緣的酶、I相代謝酶CYP1A1、相代謝酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、-葡萄糖醛酸糖苷酶及磺基轉(zhuǎn)移酶。由于形態(tài)學(xué)及生化性質(zhì)都與小腸上皮很相似，Caco-2細(xì)胞模型已廣泛的用于體外藥物分子腸吸收的研究。 1、Caco2細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco2細(xì)胞種植在一種底部裝有聚碳酸酯膜的細(xì)胞培養(yǎng)插件(transwell clusters或snapwell，圖20-6)上，snapwell小井直徑為3cm，snapwell小井放置在六穴組合培養(yǎng)皿中，

37、種植密度約為每個(gè)snapwell小井為10×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)液含10%的小牛血清、非必需氨基酸、抗生素 (penicillin 1 × 107 U/L和streptomysin100mg/ L雙抗液) 的DMEM (dulbeccos modified eagle medium) 緩沖液。種植后第1周每天換1次培養(yǎng)液，1周后可隔天更換1次。在37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2128 d，建立Caco-2單層細(xì)胞模型后待用。2、膽固醇流入實(shí)驗(yàn) Caco-2單層細(xì)胞模型建立后，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基洗兩

38、次，然后用1ml混合膽固醇微膠粒和包含0.5%牛血清的培養(yǎng)基在37'C下共同孵育細(xì)胞24h。孵育后，把細(xì)胞放置在冰上，首先用包含有1mgBSA/ml的冰冷的PBS(pH7.4)洗兩次，然后再用冰冷的PBS(pH7.4)洗兩次。用1ml的正己烷：異丙醇 (3 ：2、V： V) 孵育細(xì)胞30min來(lái)提取細(xì)胞膽固醇。剩余的被溶解于0.1mol/L NaOH用于測(cè)蛋白質(zhì)含量，正己烷-異丙醇的萃取液用氮?dú)飧稍?，烘干后的脂質(zhì)重新溶解于含有0.5% TritonX- 100的氯仿中。蒸干氯仿后，片狀沉淀物重新溶解于水中后用商用試劑盒來(lái)確定TC。計(jì)算膽固醇流入量

39、。 3、膽固醇的流出實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞用含有10%胎牛血清和0.2UCi/ml中 3H 標(biāo)記膽固醇的DMEM培養(yǎng)基孵育24h后，用含有1mg/mlBSA的PBS洗3次，然后在含有0.5%BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中平衡16h。此后，在37下用未標(biāo)記的膽固醇微膠粒孵育細(xì)胞2h。比較上清液的放射性強(qiáng)度，用閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)培養(yǎng)液中和細(xì)胞中的 3H 膽固醇，膽固醇流出用總CPM除以培養(yǎng)液中CPM，再乘以100%來(lái)表示。由此來(lái)檢測(cè)膽固醇的流出量。(二)動(dòng)物整體水平膽固醇吸收與排出模型雙標(biāo)法 1、標(biāo)記膽固醇混合物 每只田鼠靜脈內(nèi)注射2.5µCi  1，2-3H 膽固醇，溶于20%的脂肪乳中，然后用含MCT油1.o pCi  4-14C 膽固醇灌胃，測(cè)定 3H 膽固醇活性時(shí)，先氮?dú)獯蹈?，然后重溶于無(wú)水乙醇中 (o.5µCi 3 H/µl，再加人未稀釋的脂肪乳 (0.16 ml