第3章 DNA復(fù)制

1、 3.1. 基基 本本 概概 念念 ( Basic Concept ) 第第3章章 DNA復(fù)制復(fù)制 (DNA Replication) 3.1. 基本概念基本概念3.2. 復(fù)制起點與方向復(fù)制起點與方向 3.3. Semi-Conservation Replication 3.4. 復(fù)制的方式復(fù)制的方式 3.5. 線狀線狀 DNA的復(fù)制的復(fù)制3.6. DNA復(fù)制的基因與酶類體系復(fù)制的基因與酶類體系 3.7. DNA復(fù)制速率及拷貝數(shù)的調(diào)控復(fù)制速率及拷貝數(shù)的調(diào)控 3.8. Methylation of DNA 遺傳物質(zhì)的分子機制遺傳物質(zhì)的分子機制分子生物學(xué)的核心分子生物學(xué)的核心Watson &

2、; Crick:Watson & Crick: 一種遺傳物質(zhì)，必須能行使兩種 功能，即自我復(fù)制和對細(xì)胞的高 度特異性的影響遺傳物質(zhì)的基本屬性遺傳物質(zhì)的基本屬性：基因的自我復(fù)制基因的自我復(fù)制 基因的突變基因的突變 控制性狀的表達(dá)控制性狀的表達(dá)DNA復(fù)制復(fù)制 親代雙鏈親代雙鏈DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分別以聚合酶的作用下，分別以 每單鏈每單鏈 DNADNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補分子為模板，聚合與自身堿基可以互補 配對的游離的配對的游離的dNTP,dNTP, 合成出兩條與親代合成出兩條與親代DNADNA分子完分子完 全相同的子代全相同的子代DNADNA分

3、子的過程。分子的過程。 Replicon( Replicon(復(fù)制子復(fù)制子); ); 基因組中能獨立進行復(fù)制的單位?；蚪M中能獨立進行復(fù)制的單位。 Replisome ( (復(fù)制體復(fù)制體); ); A unit of the genome in which DNA A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator contain a region from origin to terminator The multi protein (30 The multi protein (30) st

4、ructure that assembles ) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNAat replicating fork to undertake synthesis of DNA DNA replication at phase S of cell cycle DNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs5

5、00-5000 bp/min G112hs?3.2. 復(fù)制起點與方向復(fù)制起點與方向（replication origin & direction ） isolation of ori rich AT & palindrom rich AT & palindrom Enzymes binding site Enzymes binding site 復(fù)制起點的特征復(fù)制起點的特征復(fù)制起點的特征復(fù)制起點的特征J. W. Zyskind 克隆到克隆到E.coli oriC確定其最小區(qū)段為確定其最小區(qū)段為245bp，并，并與沙門氏菌等與沙門氏菌等4鐘細(xì)菌的鐘細(xì)菌的oriC序列進行比

6、較分析發(fā)現(xiàn)；序列進行比較分析發(fā)現(xiàn)； 245bp minimal origin of replication 245bp minimal origin of replication rich AT & DNA polymerase (DnaA) binding site rich AT & DNA polymerase (DnaA) binding site RNA pol 發(fā)動發(fā)動primer真核生物復(fù)制起點的研究是以酵母為基礎(chǔ)的uARS (automatic Replication Sequence) 自主復(fù)制序列uARS1 (A, B1,B2,B3) A區(qū)具有高度保守性 u

7、B區(qū)變化較大AT rich 復(fù)制起始區(qū)的復(fù)制起始區(qū)的“呼吸呼吸現(xiàn)象現(xiàn)象” DNA復(fù)制原點處氫鍵迅速斷裂與再生，復(fù)制原點處氫鍵迅速斷裂與再生， 導(dǎo)致兩條導(dǎo)致兩條DNA鏈不斷解鏈與聚合，鏈不斷解鏈與聚合， 形成瞬間的單鏈泡狀結(jié)構(gòu)的過程。形成瞬間的單鏈泡狀結(jié)構(gòu)的過程。 在富含在富含AT的區(qū)域內(nèi)尤為明顯的區(qū)域內(nèi)尤為明顯 復(fù)制的多模式復(fù)制的多模式 單單起點、起點、單單方向方向多多起點、起點、單單方向方向單單起點、起點、雙雙方向方向多多起點、起點、雙雙方向方向1963 Cairns 1963 Cairns 37 , 5 ci / mM H3-T , 6min 37 , 52 ci / mM H3-T ,

8、6min 42 , T, one circle DNA雙向復(fù)制的證據(jù)雙向復(fù)制的證據(jù) 模式？模式？E. coli mut.ts 復(fù)制發(fā)動溫度敏感突變型復(fù)制發(fā)動溫度敏感突變型42不能發(fā)動不能發(fā)動DNA復(fù)制、但可完成復(fù)制、但可完成DNA延伸延伸模式 ？單單 起起 點、點、雙雙 方方 向向兩個復(fù)制叉 子鏈子鏈DNA延伸方向延伸方向 DNA polymeraseDNA polymerase reacts on the 3 reacts on the 3 end only end only5 OHT C AT C A C 5 OH 3New DNA elongation from 5New DNA elo

9、ngation from 5 to 3 to 3 direction direction ppp OH C+ ppi 如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp因能量的需要，因能量的需要， DNA的的5 端必須帶有端必須帶有PPP游離游離dNTP具有具有pppppp OH 3 A T C G 在在0.2M Nacl 的生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負(fù)性，使的生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負(fù)性，使dNTP難以聚合到難以聚

10、合到DNA的的5端，而且端，而且 雙鏈雙鏈DNA的的5端堿基配對困難。端堿基配對困難。堿基發(fā)生錯配后的校正堿基發(fā)生錯配后的校正 費時、費能（增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗）費時、費能（增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗） A T C G ppp OH+ pppAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 3.3. DNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制 （Semi-Conservative Replication） 半保留復(fù)制的半保留復(fù)制的實驗驗證實驗驗證(Meselson and Stahl, 1958)3535OK !How ?5353one strand of DNA repli

11、cation in Okazaki fragment 1kb5353DNA replication in Okazaki fragment 1kb5353（semi-discontinuous replication ! semi-discontinuous replication ! ） ？a)Okazaki fragment a)Okazaki fragment 1968 Reiji Okazaki1968 Reiji Okazaki 半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制 Olivera, 1978 （semi-discontinuous replicationsemi-discontinuous r

12、eplication） 證據(jù)證據(jù) Okazaki片段的發(fā)現(xiàn)，為不連續(xù)復(fù)制提供片段的發(fā)現(xiàn)，為不連續(xù)復(fù)制提供了有力的證據(jù)了有力的證據(jù)。 Prok. 1-2kb, Euk. 0.1-0.2kb 在復(fù)制叉上發(fā)生一條新鏈為連續(xù)合成，在復(fù)制叉上發(fā)生一條新鏈為連續(xù)合成，另一條鏈為不連續(xù)合成的復(fù)制機制。另一條鏈為不連續(xù)合成的復(fù)制機制。leading strand lagging strand leading strand（前導(dǎo)鏈） ：連續(xù)復(fù)制：連續(xù)復(fù)制lagging strand（后隨鏈）：按后隨鏈）：按Okazaki 片段不片段不連續(xù)復(fù)制連續(xù)復(fù)制3.4. DNA復(fù)制的模式復(fù)制的模式 (DNA replica

13、tion model)(DNA replication model) 新起始方式新起始方式 （de novode novo initiation initiation） 或復(fù)制叉式或復(fù)制叉式（replication forkreplication fork） 環(huán)狀環(huán)狀DNADNA復(fù)制復(fù)制 （ form form ，5050，000bp/min)000bp/min)多復(fù)制子多復(fù)制子 真核生物（真核生物（1000-3000bp/min) 1000-3000bp/min) 大多數(shù)生物染色體采取大多數(shù)生物染色體采取雙向?qū)ΨQ復(fù)制雙向?qū)ΨQ復(fù)制?？莶輻U菌采取不對稱復(fù)制。枯草桿菌采取不對稱復(fù)制。startin

14、g pointstarting point RNA primer RNA primer transcriptional activation transcriptional activation leading strand leading strand fork fork lagging strand lagging strand DNA聚合酶不能發(fā)動子鏈聚合酶不能發(fā)動子鏈DNA的復(fù)制起始的復(fù)制起始. DNADNA聚合酶行使聚合作用需要：聚合酶行使聚合作用需要：以四種以四種dNTPdNTP作為底物作為底物模板指導(dǎo)模板指導(dǎo)延伸方向延伸方向5 533引物提供引物提供3 3-OH-OH RNARN

15、A引物的合成（引物的合成（ATPATP，GTPGTP，CTPCTP，UTPUTP） RNARNA聚合酶聚合酶和和引物合成酶引物合成酶(primase)(primase) 引物的長度：幾個引物的長度：幾個1010個核苷酸個核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶I I：RNARNA引物的消除和缺口的填補引物的消除和缺口的填補 DNA DNA復(fù)制過程中的復(fù)制過程中的RNA primerRNA primer DNA聚合酶不能發(fā)動聚合酶不能發(fā)動子鏈子鏈DNA的復(fù)制起始的復(fù)制起始 !E.coliRif s Rif S + M13E.coliE.coli Rif R M13+ S.S. DNA virus+RF無

16、M13 RFRifampinM13Rifampin有M13 RF有M13 RF M13 Rifampin Rifampin Rifampin 是是E.coliE.coli RNA polymerase RNA polymerase 的抑制劑的抑制劑 RNA primerRNA primer 的證據(jù)：的證據(jù)： DNA DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活 (transcriptional activation） RNA polymerase Rif RNA polymerase Rif S S 10 Nt RNA primer for leading Strand origin dnaGprima

17、se Rif R for lagging Strand Primosome（引物體）（引物體）pppRNA as primerDNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase RNApol (RNA polymerase) Rif RNApol (RNA polymerase) Rif S S dnaG (primase) Rif dnaG (primase) Rif R R 完成對后隨鏈引物的合成完成對后隨鏈引物的合成 完成完成10 Nt RNA引物合成后引物合成后. DNApol 進行進行DNA鏈的延伸鏈的延伸 D

18、NApol I 對對RNA引物切除并聚合填補引物切除并聚合填補 連接酶連接酶 (ligase）將）將 Okazaki Okazaki 片段片段.完成對前導(dǎo)鏈引物的合成完成對前導(dǎo)鏈引物的合成 實現(xiàn)實現(xiàn)DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始較前導(dǎo)鏈的啟動落后一個較前導(dǎo)鏈的啟動落后一個Okazaki片斷片斷 Conclusion 5333共價延伸方式共價延伸方式transcriptional activation ? 共價延伸方式共價延伸方式（covalence elongationcovalence elongation） 或或 滾環(huán)方式滾環(huán)方式 rolling circlerolling c

19、ircle） D.S. DNA Nick leading StrandElongation rolling Lagging Strand非岡崎片段模式非岡崎片段模式 置換式置換式 或或 D-Loop （Displacement formDisplacement form） D.S. DNA In mitochondrial DNA In mitochondrial DNA also in chloroplast DNA also in chloroplast DNA S.S. DNA as template New S.S. DNA Displacement D-Loop 復(fù)制叉兩側(cè)復(fù)制叉兩側(cè)

20、DNA雙螺旋的解旋雙螺旋的解旋E.coli E.coli C / genome = 4.2 106 bp 30-40m/ 每次復(fù)制歷時每次復(fù)制歷時 10 bp / 每圈螺旋每圈螺旋 84000 -105bp / min 解旋解旋 ( 8400-10000 rpm ! 高速離心機高速離心機 )能量？能量？復(fù)制叉兩側(cè)復(fù)制叉兩側(cè)DNA雙螺旋的解旋雙螺旋的解旋DNA topoisomerase I DNA的單鏈瞬間斷裂的單鏈瞬間斷裂 （transient single-strand break） 緩解緩解高速旋轉(zhuǎn)，高速旋轉(zhuǎn)， 引入正向超螺旋，解出引入正向超螺旋，解出overwinding的應(yīng)力的應(yīng)力D

21、NA topoisomerase II DNA的雙鏈瞬間斷裂的雙鏈瞬間斷裂 （transient double-strand break） 緩解緩解高速解旋時，高速解旋時，DNA雙鏈的相互纏繞雙鏈的相互纏繞 產(chǎn)生產(chǎn)生負(fù)超負(fù)超消除復(fù)制叉移動時產(chǎn)生的消除復(fù)制叉移動時產(chǎn)生的正超正超DNA Helicase (DNA 解旋酶）解旋酶） ATPase活性，解除活性，解除 1氫鍵氫鍵 水解水解2ATPTop I , Top II Helicase (rep protein) Single Strand Binding protein (SSB)DnaB proteinDnaC protein Primas

22、e DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase for primosome復(fù)復(fù)制制體體進進 化化 中中 形形 成成 了了 靈靈 活活 的的 多多 酶酶 復(fù)復(fù) 合合 體體 replisomeprimosome （引發(fā)體）（引發(fā)體） PriA (dual role) displace SSB from S.S DNA and helicase DnaT required at prepriming stage DnaB is central component, action with DnaC DnaC is central component, act

23、ion with DnaB PriB function is unknown PriC function is unknown DnaG primase(引物酶引物酶) 進進 化化 中中 形形 成成 了了 靈靈 活活 的的 多多 酶酶 復(fù)復(fù) 合合 體體 replisome 3.5. 線狀線狀 DNA的復(fù)制的復(fù)制 及避免及避免5末端短縮的模式末端短縮的模式 （5-end shortend ） 3-OH ? 3-OHLagging strand of Lagging strand of 環(huán)狀環(huán)狀 DNA replication DNA replication Lagging strand of L

24、agging strand of 線狀線狀 DNA replication DNA replication But 3-OH ? Watson J. D Watson J. D T T7 7 phage phage Direct repeat in the end of linear DNA Concatermer between two offspring DNA after replication ?concatermer concatermer 3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHb) 真核生物染色體真核生物染色體 DNA末端補齊模式末端補齊模式 端粒的發(fā)現(xiàn)端粒的發(fā)現(xiàn) 193

25、8 Muller X-ray Drosophila 末端極少發(fā)生缺失和倒位末端極少發(fā)生缺失和倒位推測染色體兩端存在特殊結(jié)推測染色體兩端存在特殊結(jié)構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為并定名為Telomere 1938 B.McClintock 頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。 推測染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。推測染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。1970s 分子生物學(xué)發(fā)展 端粒研究獲得突破 2009年生理學(xué)年生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎醫(yī)學(xué)獎 Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Sz

26、ostak 加利福尼亞加利福尼亞舊金山大學(xué)舊金山大學(xué) 霍普金斯醫(yī)學(xué)院霍普金斯醫(yī)學(xué)院霍華德休斯霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)研究所 for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase 端粒端粒DNA ( (四膜蟲四膜蟲) ) E. BlackburnE. Blackburn，19841984TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端序列高度重復(fù)的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (rich G chain) 3 AACCCC AACCCC AAC

27、CCC 5 (rich C chain) pBR322PvuBg1ARSTELTELBam H1Bam H1四膜蟲四膜蟲rDNABg1PvuBam H1轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)化酵母Pvu傳代傳代酵母酵母TEL？??？！ Elizabeth H. Blackburn 加尾實驗加尾實驗 轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)化酵母 傳代傳代酵母酵母TELPvu 酶切連接Pvu酵母酵母 DNAPvu酵母酵母TEL酵母酵母TEL？??？！ 端粒的模板鏈在何處端粒的模板鏈在何處?端粒酶的發(fā)現(xiàn)為揭示端粒序端粒酶的發(fā)現(xiàn)為揭示端粒序列復(fù)制的模板及避免列復(fù)制的模板及避免5端端短縮的機制奠定了重要的基短縮的機制奠定了重要的基礎(chǔ)礎(chǔ) 端粒的模板鏈在何處端粒的模

28、板鏈在何處?加尾實驗未能證明延伸端加尾實驗未能證明延伸端粒序列的模板從何而來？粒序列的模板從何而來？ 1987. Carol W. Greider & Elizabeth H. Blackburn 端粒酶的發(fā)現(xiàn)及組成端粒酶的發(fā)現(xiàn)及組成尖毛蟲尖毛蟲 telomere binding proteintelomere binding protein 1 55kd telomere binding protein telomere binding protein 2 26 kd四膜蟲四膜蟲 telomerasetelomerase游撲蟲游撲蟲 telomerasetelomerase+ 100

29、 bp telomere 200500KDaRNA CAACCCCAA 鏈鏈 + 具有具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的 末端結(jié)合蛋白末端結(jié)合蛋白(TBP） 1990 Yu和和Blackburn 在體外加尾實驗的反應(yīng)體系中在體外加尾實驗的反應(yīng)體系中 加入這段加入這段RNA區(qū)域的反義序列區(qū)域的反義序列GTTTTGGGGTTG證明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重復(fù)序列（GGGGTT）n合成的模板 端粒酶的加尾功 能受到明顯抑制1990 Yu和Blackburn 在體外加尾實驗的反應(yīng)體系中證明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重復(fù)序列（GGGGTT）n合成的模板 轉(zhuǎn)化四膜蟲后代的染色體端粒出現(xiàn)了突變序列的端

30、粒對對CAACCCCAA序列進行誘變序列進行誘變 端粒合成 modelmodel TBP is Reverse transcriptase-like RNA complement with 3 end of DNA & as template for cDNA Elongated T2G4 3-end as primer for 5-end DNA synthesis G鏈鏈 T2G4-TTGGGGT TGGG C鏈鏈-A2C4- telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 TTGG鏈鏈 T2G4-TTGGGGT TGGG C鏈鏈-A2C4-TTG telomer

31、ase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 GGGTTGG鏈鏈 T2G4-TTGGGGT TGGG C鏈鏈-A2C4-TTGGGGTTG- telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 When G-rich strand is longer enough telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 G G hoogsteen bond Tetraplex helix G鏈鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈鏈-A2C4- G鏈鏈 T2G4-

32、TTGGGG t t g g g g t t gC鏈鏈-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polor多細(xì)胞組織的體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一多細(xì)胞組織的體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代細(xì)胞分裂后染色體末端縮短。這種縮短如果到達(dá)信息代細(xì)胞分裂后染色體末端縮短。這種縮短如果到達(dá)信息DNADNA（ informational DNA informational DNA）, , 細(xì)胞將逐漸衰老和死亡。細(xì)胞將逐漸衰老和死亡。 細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂端粒閾值端粒閾值細(xì)胞停止分裂或死亡細(xì)胞

33、停止分裂或死亡When telomerase activity is repressed人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制，人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制， 細(xì)胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細(xì)胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂端粒閾值端粒閾值端粒長短端粒長短端粒酶活端粒酶活 Harley (1989)端粒的重復(fù)片段為探針檢測端粒的重復(fù)片段為探針檢測 胎兒細(xì)胞株胎兒細(xì)胞株嬰兒細(xì)胞株嬰兒細(xì)胞株青年細(xì)胞株青年細(xì)胞株老年細(xì)胞株老年細(xì)胞株年齡年齡小 大端粒長度端粒長度 長 短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短“多莉多莉”的衰老的衰老癌細(xì)胞的繁殖癌細(xì)胞的繁殖 ( (端粒酶的激活！細(xì)胞

34、得以永生！端粒酶的激活！細(xì)胞得以永生！) )研究端粒研究端粒（記時器）（記時器）丟失的速率丟失的速率/ 年，預(yù)測人類的壽命年，預(yù)測人類的壽命 隨著組織、細(xì)胞的老化隨著組織、細(xì)胞的老化染色體端粒的長度變短染色體端粒的長度變短小麥不同細(xì)胞內(nèi)端粒長度的變化The termination of DNA replication E.coli (單起點雙方向單起點雙方向)兩復(fù)制叉的相遇處具有多個終止位點兩復(fù)制叉的相遇處具有多個終止位點(不是復(fù)制叉簡單相遇）不是復(fù)制叉簡單相遇） terE, D, A terF, C, B (22bp保守區(qū)保守區(qū))F BTerminus Utilization Substan

35、ce（TUS 36kd）CADETer-TUS復(fù)合體 terE, D, A 僅對反時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng)僅對反時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng) terF, B, C 僅僅對對順時針順時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng)方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng) F BCADETer-TUS復(fù)合體復(fù)合體 (Rep. fork trap)終止終止DnaB(螺旋酶螺旋酶)防止防止DNA過度復(fù)制過度復(fù)制避免出現(xiàn)避免出現(xiàn)DNA多聚體，高拷貝多聚體，高拷貝氨基酸饑餓狀態(tài)，氨基酸饑餓狀態(tài)，DNA復(fù)制起始失控復(fù)制起始失控 . DNADNA的復(fù)制基因的復(fù)制基因 與酶類體系與酶類體系 a) 原核生物的復(fù)制基因與酶類原核生物

36、的復(fù)制基因與酶類 Initiation genes dna B prepriming 300kd 20 copies/cell hexamerRNApol primase for leading S. dna C acts with dnaB 25kddna G primase for lagging S. 60kd 25 (Okazaki fragment ) monomer SSB Binding with S.S.DNA 74kd 300 Prevents from anneal monomer Elongation genes與酶與酶 dnaE DNA polymerase III()

37、 140kddnaZ DNA polymerase III() 52kdpolA DNA polymerase I 109kdpolB DNA polymerase II 90-120kd解螺旋酶和連接酶解螺旋酶和連接酶 rep Relaxed protein (Helicase) D.S. DNA S.S. DNAlig Ligase缺口缺口酶活化酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化缺口腺苷化封口連接封口連接dAMP b) DNA聚合酶聚合酶 （DNA polymerase） 109kd 120kd 250kd monomer klenowklenow fragment + EF-II

38、+ProkaryoteProkaryote I II III 5 3 elongation (dNMP)n + xdNTP (dNMP)n+x + xppi 10 dNt/sec 1/10 of pol I 500dNt/sec (75, 36) KornbergKornberg E Ehetero-multimer multimer 3 5 editing mismatch 10-8 10-3 yes 5 3 exonuclease small fragment repair No No I II III mutation lethal lethal 功能功能 切除引物，修復(fù)切除引物，修復(fù)

39、修復(fù)修復(fù) 復(fù)制復(fù)制大片段具有聚合酶和大片段具有聚合酶和3535的外切核酸的外切核酸酶活性酶活性(Klenow(Klenow酶酶) )小片段具有小片段具有5 35 3的外切核酸酶活性的外切核酸酶活性DNA polymerase IDNA polymerase I多亞基酶多亞基酶功能：不是復(fù)制酶，是修復(fù)酶功能：不是復(fù)制酶，是修復(fù)酶DNA polymerase IIDNA polymerase IIDNA polymerase III DNA polymerase III activable DNA pol III DNA pol III (holo Enzyme)(holo Enzyme) + (

40、dnaE)(dnaE) DNA pol III (core Enzyme)(core Enzyme) + EF-II 730 nt / sec. in vitro1000nt / sec. In vivo + ( dnaZ co-pol III ) +c) c) 真核生物真核生物DNADNA復(fù)制的特點及聚合酶復(fù)制的特點及聚合酶 multiple replicon Prok. 105 bp/min Euk. 1000-3000 bp/min 5-300kb/復(fù)制子復(fù)制子 DNApol + primase (50-60kd)DNApol + primase (50-60kd) 6-9 Nt RNA

41、 as primer 例；果蠅例；果蠅 5000 repliconsreplicons受精后受精后genome replication/3min Replicons 擴增到擴增到50,000Euk.Euk.染色體在全部復(fù)制完成之前起染色體在全部復(fù)制完成之前起點不再從新開始復(fù)制。而點不再從新開始復(fù)制。而Prok.Prok. 起點起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物在快速生長時，往往采用真核生物在快速生長時，往往采用更多更多的復(fù)制起點。的復(fù)制起點。 DNA polymeraseDNA polymerase (主要酶類主要酶類) Maxi. pol Mini. pol Nuclei Nu

42、clei mt 120-300 kd 30-50 kd 150-300kd polymerize 5 3 yes yes editing 3 5 No No RNA primer No No No No DNA primer 2000-6000mole. / cell3.8. DNA 復(fù)復(fù) 制制 速速 率調(diào)率調(diào) 控控 Repressor model Antisense RNA model RNA-2 Positive control RNA-2 Positive control 0-555 0 RNA-2 RnaseHOH RNA-2DNA / RNA primer for DNA repli

43、cation e.g. ColEI plasmid (15-20)e.g. ColEI plasmid (15-20)Negative controlRNA-1110 bp RNase H 不能識別不能識別D.S. RNA-1/RNA-2, 不能形成不能形成primer 的3-OH -555 -4450RNA-2RNA-1RNA-2 110 bp D.S. RNARNA-1 0 When RNA-2200-360Nt Rop Rop gene expressiongene expression RNA-1RNA-1 / / RNA-2 D.S. repressionRNA-2 D.S. rep

44、ression RNA-1 / RNA-2 不能形成不能形成primer的的 3-OH 促進促進 限限制制 63 aa ROP63 aa ROP(Rop protein)(Rop protein) RNA-2 只能轉(zhuǎn)錄到只能轉(zhuǎn)錄到100-220 base, 不能到達(dá)不能到達(dá)“0”原點原點 不能形成不能形成primer 的的3-OH0 ColEI plasmid (15-20 copies)以負(fù)控制為主的調(diào)控方式防止過度復(fù)制不相容性質(zhì)粒不相容性質(zhì)粒具有共同的復(fù)制調(diào)控機制具有共同的復(fù)制調(diào)控機制 (相互競爭相互競爭, 相互制約相互制約)相容性質(zhì)粒相容性質(zhì)粒( F, ColEI )復(fù)制調(diào)控機制完全不同復(fù)制調(diào)控機制完全不同 (和平共處和平共處, 互不干擾互不干擾)3.9. DNA的甲基化（的甲基化（Methylation） (m5C in Eukaryote) mm5 5C C a) DNA中中m5C的特點的特點 對對MspI,