微生物限度檢驗方法驗證方案

1、微生物限度檢驗方法驗證方案1.適用范圍本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。2.目的通過驗證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定。3.職責(zé)項目責(zé)任人:負(fù)責(zé)驗證方案的起草及具體實(shí)施。驗證管理員:負(fù)責(zé)驗證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。QA現(xiàn)場監(jiān)控員:負(fù)責(zé)驗證實(shí)施過程中的監(jiān)督檢查,取樣,確保結(jié)果的可靠性。QC負(fù)責(zé)人:負(fù)責(zé)驗證方案中檢驗方法的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標(biāo)準(zhǔn)檢驗操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)行,負(fù)責(zé)組織實(shí)施。QC檢驗員:負(fù)責(zé)驗證方案的起草與參與實(shí)施,并對所測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。質(zhì)量部經(jīng)理:負(fù)責(zé)驗證方案及報告的審核和批準(zhǔn)。4.內(nèi)容通過驗證以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測

2、定;確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件,按制定的方法進(jìn)行試驗,根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標(biāo)準(zhǔn)。若符合,按驗證的方法和條件進(jìn)行藥品的微生物限度檢查;若不符合,重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件,再進(jìn)行驗證,直至驗證結(jié)果符合設(shè)立的驗證標(biāo)準(zhǔn)。4.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時,應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證,以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進(jìn)行。大腸埃希菌【CMCC(B44102】金黃色葡萄球菌【CMCC(B26003】枯草芽孢桿菌【CMCC(B6

3、3501】黑曲霉【CMCC(F98003】白色念珠菌【CMCC(F98001】。大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌,前述菌株作為細(xì)菌計數(shù)驗證用菌株;黑曲霉為霉菌,白色念珠菌為酵母菌,作為霉菌及酵母菌計數(shù)驗證用菌株。驗證實(shí)驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代,并采用適宜的菌種保藏技術(shù),以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。入35ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫,吸至無菌試管內(nèi),取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-410-6,制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。稀釋劑

4、:pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液液體供試品:供試品10ml置錐形瓶中,加入90ml稀釋劑,混勻,作為供試液(1:10。固體、半固體、粘稠性供試品供試品:稱取供試品10g置錐形瓶中,加稀釋劑至100ml,混勻后,作為供試液(1:10。當(dāng)供試品具有抑菌活性時,須先消除抑菌活性,其方法如下:離心沉淀集菌法:取一定量的供試液,3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘(供試液如有沉淀,先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,取全部上清液再離心,棄去上清液,留底部集菌液約2ml,加稀釋液補(bǔ)至原量。薄膜過濾法:取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液,過濾,沖洗,按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。中和法:選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適

5、當(dāng)?shù)膶Π被郊姿?含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸,洗必泰制劑加入聚山梨酸80(3%或卵磷脂(3%,鹵素中加入硫代硫酸鈉(0.1%等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。4.2.5.試驗組4.2.4.2.4.2.取規(guī)定量供試液,按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)(方法和試驗組相同。若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時,應(yīng)增加稀釋劑對照組,用稀釋劑代替供試品,加入試驗菌,使最終濃度為每1ml 供試液含50100cfu,按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。試驗組的菌回收率=試驗組的菌回收率供試品對照組平均菌落數(shù)×100% 菌液組

6、的平均菌落數(shù)試驗組的菌回收率=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)×100%菌液組的平均菌落數(shù)計數(shù)方法驗證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗,并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。在3次獨(dú)立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率70%。若試驗組的菌回收率(試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù);若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%,應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進(jìn)行

7、方法驗證,使試驗組菌回收率大于70%。4.3. 控制菌檢驗方法驗證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時,應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗證,以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時,檢驗方法應(yīng)進(jìn)行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進(jìn)行。大腸埃希菌(Esherichia coli【CMCC(B 44102】、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus【CMCC(B26003】、乙型付傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B【CMCC(B 50094】、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa【CMCC

8、 (B 10104】驗證實(shí)驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代,并采用適宜的菌種保藏技術(shù),以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,3537培養(yǎng)1824小時;分別取培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-510-7,制成每1ml含菌數(shù)10100cfu的菌懸液。大腸埃希菌取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,陽性菌對照加入大腸埃希菌10100cfu,陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu,3537培養(yǎng)1824小時

9、,取此培養(yǎng)物按微生物限度檢查SOP大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。沙門菌取供試品10g或10ml,直接或處理后接種至適量(不少于200ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,用勻漿儀或其他適宜方法混勻,陽性菌對照加入沙門菌10100cfu,陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu,3537培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查SOP沙門菌項下規(guī)定檢查。銅綠假單胞菌取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10100cfu,陰性菌對照加入大腸埃希菌10100cfu,3537培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查SOP沙門菌項下規(guī)定檢查。金黃色葡萄球菌取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu,陰性菌對照加入大腸埃希菌10100cfu,3537培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查SOP金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。5.中和法在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑,以減除供試品中抑菌成分的作用,中和劑應(yīng)對微生物無毒性,與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對微生物亦無毒性,或有毒性但不影響待檢菌的檢出。4.3.5.結(jié)果判斷至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌,照該供試液制備方法和控制菌檢查法