淺論積雪草酸與化療藥物聯(lián)用抗腫瘤效應(yīng)的初步研究

1、淺論積雪草酸與化療藥物聯(lián)用抗腫瘤效應(yīng)的初步研究                作者：林娜，高靜，方春錢，張海峰，楊永建，顧亞君，郭文潔【摘要】  目的： 研究積雪草酸（asiatic acid，AA）與化療藥物環(huán)磷酰胺（CTX），5氟尿嘧啶（5Fu）聯(lián)用的抗腫瘤作用。方法： 采用在體與離體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，觀察AA與5Fu或CTX聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖和Heps肝癌腹水瘤、實(shí)體瘤生長的影響。用MTT法檢測聯(lián)用AA和5Fu的抗腫瘤效果。結(jié)果

2、： 10，15，20，25 mol/L AA與50，7.5，1 mol/L 5Fu聯(lián)用，具有顯著的抗腫瘤作用，AA不降低5Fu對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。AA和CTX聯(lián)用于Heps腹水瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)AA（50,100 mg/kg）和CTX（20 mg/kg）聯(lián)用與單用CTX一樣，能抑制腹腔積液的增生，且可延長Heps腹水瘤小鼠的壽命；AA和CTX聯(lián)用于Heps實(shí)體瘤小鼠，有明顯的抑瘤作用，而且AA能對(duì)抗CTX誘導(dǎo)的谷胱甘肽（GSH）水平的降低，可能對(duì)肝臟的抗氧化能力有一定的保護(hù)作用。結(jié)論： AA與化療藥物聯(lián)用，可以減弱化療藥物的毒副作用。 【關(guān)鍵詞】  積雪草酸； 5氟尿嘧啶； 環(huán)

3、磷酰胺； 聯(lián)合用藥； 抗腫瘤AbstractObjective: Study the antitumor effects of asiatic acid（AA）combined with chemotherapeutics cyclophosphamide(CTX) or 5fluorouracil(5Fu).  Methods： The cytotoxic effects of the combination of AA and 5FU on tumor cell lines HepG2 were detected by MTT assay.Mice transplanted wi

4、th Heps solid tumor and ascites carcinoma were used to study the combination antitumor effect of AA(50,100 mg/kg) and CTX(20 mg/kg).  Results： When AA(10, 15, 20, 25 mol/L) and 5Fu(50, 7.5, 1 mol/L) was combinated to treat the cells, the growth of HepG2 cells were inhibited obviously. On the ot

5、her hand, AA prolonged the survival time of mice with Heps ascites carcinoma compared with those in CTX group and showed significant antitumor activity simultaneously. The protection of AA on hepatic GSH level insulted by CTX in mice with Heps solid tumor treated with AA and CTX confirmed the attenu

6、ated toxicity effects of AA, which might be associated with hepatopretection of AA. Conclusion： The present data suggest that AA attenuate the toxicity of some chemotherapeutics and may be helpful in cancer treatment with the combination of chemotherapeutics.Key words  asiatic acid; 5fluorourac

7、il; cyclophosphamide; drugcombination; antitumor   腫瘤已成為人類致死的三大疾病之一。目前臨床使用的環(huán)磷酰胺（CTX），5氟尿嘧啶（5Fu）等抗腫瘤藥物化療時(shí)均產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，引起正常組織的多器官毒性、免疫抑制、反復(fù)感染， 機(jī)體衰弱等現(xiàn)象1, 2。本實(shí)驗(yàn)室已有的研究也發(fā)現(xiàn)CTX通過影響小鼠肝臟線粒體功能從而導(dǎo)致肝損傷3。我國一些傳統(tǒng)中藥因其較少的不良反應(yīng) 、對(duì)機(jī)體具有保護(hù)和調(diào)理作用, 成為中西藥聯(lián)合化療的研究熱點(diǎn)。研發(fā)新型抗腫瘤增效、減毒劑可能是戰(zhàn)勝惡性腫瘤的途徑之一4。     積雪草酸（

8、asiatic acid，AA），又名亞細(xì)亞酸，是我國傳統(tǒng)中藥積雪草的五環(huán)三萜類組分之一。經(jīng)研究證明，AA具有促進(jìn)成纖維蛋白合成5, 6、對(duì)抗CCl4和DGalN誘導(dǎo)的肝損傷7、對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷8等細(xì)胞保護(hù)作用。另外，也發(fā)現(xiàn)AA具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用9, 10。但是對(duì)于AA應(yīng)用于在體抗腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。本研究將在體與離體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，觀察了AA與5Fu或CTX聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖和Heps肝癌腹水瘤、實(shí)體瘤生長的影響。   1  材料和方法1.1  材料   人肝癌細(xì)胞株（HepG2）：南京大學(xué)徐力致老師

9、惠贈(zèng)；ICR小鼠（雄性），體質(zhì)量1822 g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：SCXK（蘇）20020009。動(dòng)物飼養(yǎng)晝夜循環(huán)為10/14 h，環(huán)境溫度為25左右，自由飲食進(jìn)水；Heps腹水瘤種鼠源自江蘇省腫瘤醫(yī)院；MTT（Sigma公司）；5Fu（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）；積雪草酸，純度95%（廣西昌洲天然產(chǎn)物有限公司），用于在體實(shí)驗(yàn)的AA用環(huán)糊精包埋，由江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院張蓉仙老師制備；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H32020857）；環(huán)糊精（南京中脈遠(yuǎn)紅股份有限公司謝家坤高工惠贈(zèng)）；谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。1.2 

10、離體實(shí)驗(yàn)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %小牛血清的MEM培養(yǎng)基。細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37，5 % CO2的孵箱中培養(yǎng)，23 d傳代1次。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，接種密度為2×104 個(gè)/ml，每孔100 l。培養(yǎng)24 h后，加入10，20，30，40 mol/L AA，48 h后用檢測細(xì)胞活性，分析AA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。采用50，7.5，1  mol/L的5Fu分別與不同濃度AA（10，15，20，25 mol/L）聯(lián)合用藥。以含1 DMSO的培養(yǎng)基為對(duì)照。96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，棄去培養(yǎng)基，每孔加100  l MTT（Dha

11、nks液溶解，1 mg/ml），37孵育4 h后，吸去上清，每孔加DMSO 100  l，待結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀（Spectrum 190，Moleculer Devices）于570 nm處測光密度值。1.3  在體實(shí)驗(yàn)Heps腹水瘤模型:取Heps腹水瘤小鼠，處死后浸泡于75%乙醇5 min，腹腔穿刺取腹腔積液，計(jì)數(shù)稀釋至1×107個(gè) /ml，取0.2 ml腫瘤細(xì)胞懸液接種于ICR小鼠腹腔。Heps實(shí)體瘤模型：同Heps腹水瘤模型，制備2×107個(gè)/ml的Heps瘤細(xì)胞懸液，0.2 ml/只，接種于ICR小鼠右側(cè)腋下。  &#

12、160;      荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，對(duì)照組、CTX組、低劑量AA和CTX聯(lián)用組、高劑量AA和CTX聯(lián)用組及高劑量AA組，每組10 只。于腹腔接種瘤細(xì)胞的次日開始給藥，聯(lián)合用藥組每日皮下注射CTX（20 mg/kg）并分別灌胃低劑量（50 mg/kg）和高劑量（100 mg/kg）AA；CTX組皮下注射CTX（20 mg/kg），以等量環(huán)糊精灌胃作為對(duì)照；高劑量AA組灌胃高劑量AA（100 mg/kg），皮下注射等量生理鹽水。對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水，灌胃等量環(huán)糊精。   腹水瘤小鼠存活率檢測分3組：對(duì)照組,20 mg

13、/kg CTX組，50 mg/kg AA和20 mg/kg CTX聯(lián)用組。觀察小鼠的存活情況，并記錄每天存活小鼠只數(shù)，進(jìn)行生存期比較。存活率=存活小鼠/小鼠總數(shù)×100%給藥15 d后，小鼠眼底靜脈叢取血，然后頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，稱重，計(jì)算腫瘤抑制率。取肝臟左大葉相同部位肝組織，用適量生理鹽水制備成10%組織勻漿，試劑盒檢測GSH含量。1.4  統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），組間比較作SNKq檢驗(yàn)。顯著性標(biāo)準(zhǔn)為0.05。腹水瘤小鼠存活率比較用2檢驗(yàn)。2  結(jié)  果2.1  AA對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響&

14、#160;  如圖1所示，AA的劑量小于20 mol/L時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的生長沒有明顯影響；當(dāng)劑量達(dá)到30 mol/L時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低；隨著劑量的繼續(xù)加大，抑制細(xì)胞增殖的作用逐漸加強(qiáng)。2.2  AA和5Fu聯(lián)用抑制腫瘤細(xì)胞增殖   采用10, 15，20，25 mol/L的AA，分別與50，7.5，1 mol/L 5Fu聯(lián)用。結(jié)果如圖2所示。隨著5Fu濃度的降低，5Fu和AA聯(lián)用的抗腫瘤效果也逐漸降低。10, 15，20，25 mol/L 的AA和5Fu聯(lián)用后抗腫瘤趨勢與單用5Fu的趨勢一致。說明AA對(duì)3個(gè)濃度 5Fu的抗腫瘤效果均沒有影響。2.

15、3  AA與CTX聯(lián)用對(duì)Heps腹水瘤小鼠存活率的影響由圖3可以看出： CTX組小鼠出現(xiàn)死亡較早，和AA聯(lián)用后，死亡延緩。說明AA有降低CTX毒性，延長荷瘤鼠壽命的作用。      接種腫瘤后第14天荷瘤小鼠存活率統(tǒng)計(jì)分析表明，20 mg/kg CTX組小鼠的存活率低于對(duì)照組，說明CTX抑瘤的同時(shí)產(chǎn)生了明顯的毒性作用；而AA與CTX聯(lián)用組小鼠的存活率有所提高，提示AA有延長荷瘤小鼠壽命、降低CTX毒性的作用（表1）。表1  化療第14天各組荷瘤鼠的存活率（略）   2.4  AA與CTX聯(lián)用抑制Heps實(shí)

16、體瘤的作用   由圖4可以看出：20 mg/kg CTX對(duì)Heps實(shí)體瘤具有良好的抑制作用，單用100 mg/kg AA 的抗腫瘤活性較弱，兩者聯(lián)用后具有顯著的抗腫瘤作用，50，100 mg/kg AA均沒有減弱CTX的抗腫瘤活性。   2.5  AA與CTX聯(lián)用對(duì)荷瘤小鼠抗氧化能力的影響   從圖5可以看出：CTX組荷瘤小鼠肝組織中GSH含量顯著下降，而AA和CTX聯(lián)用組GSH含量和對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明AA對(duì)抗了CTX 誘導(dǎo)的荷瘤小鼠肝臟GSH水平的降低。3 討論   AA對(duì)不同腫瘤細(xì)胞具有

17、不同的抗腫瘤機(jī)制9,10，低劑量時(shí)則可以保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗損傷5，7。本研究首次將AA應(yīng)用于中西藥聯(lián)合化療，通過AA和5Fu聯(lián)用，觀察體外聯(lián)合用藥的效果；AA和CTX聯(lián)用，觀察在體抗腫瘤的效果。結(jié)果表明，選擇合適的劑量，可以使AA在不影響抗腫瘤藥物作用的前提下，發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用。   之前有文獻(xiàn)報(bào)道：在CTX引起的肝毒性過程中，自由基和氧化應(yīng)激是兩個(gè)不可忽視的因素，兩者導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的劇烈進(jìn)行，胞內(nèi)抗氧化防御體系通過非酶促反應(yīng)清除自由基，GSH 迅速耗竭11。從Heps實(shí)體瘤模型結(jié)果可知， AA對(duì)抗CTX誘導(dǎo)的肝臟GSH活性的降低，提示AA對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，這與以前的研究

18、結(jié)果一致8。   AA單獨(dú)應(yīng)用沒有發(fā)揮理想的抑瘤作用，而影響藥物作用的因素很多，且由于實(shí)驗(yàn)中觀察到AA的水溶性不好，我們推測生物利用度不高可能是重要的影響因素之一。因此也許通過改變AA的劑型，使其在體內(nèi)能達(dá)到抗腫瘤的血藥濃度，可以進(jìn)一步研究AA的在體抗腫瘤效果，為AA 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Bukowski RM. The need for cytoprotection J. Eur J Cancer, 1996, 32A(4): S2-S4.2Fraiser LH, Kanekel S, Kehrer JP. Cyclophosphamide toxicity.Characterizing and avoiding the problem J. Drugs, 1991, 42(5): 781-795.3張海峰, 高靜, 林娜, 等. 環(huán)磷酰胺致肝損傷時(shí)肝細(xì)胞線粒體的變化J. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008, 18