病原菌耐藥信號傳導(dǎo)機制及多抗原肽疫苗研究進展與發(fā)展趨勢.docx

1、第42卷第2期2013年浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)http:http:JOURNALOFZHEJIANGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES)DOI：10.3785/j.issn.1008-9292.2013.02.001病原菌耐藥信號傳導(dǎo)機制及多抗原肽疫苗研究進展與發(fā)展趨勢孫愛華I,方佳琪2,嚴杰(1.浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，浙江杭州310053；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，浙江杭州310058)摘要細菌耐藥性是當(dāng)前人類面臨的重大醫(yī)學(xué)問題之一。接種疫苗是預(yù)防各種傳染病最為經(jīng)濟和有效的措施，也是預(yù)防和控制耐藥性病原菌感染相關(guān)傳染病的有效途徑。文中介紹了病原菌耐藥相關(guān)信號傳導(dǎo)機制及

2、新型多抗原肽疫苗研究進展，并分析了其發(fā)展趨勢，以供相關(guān)領(lǐng)域研究者參考。關(guān)鍵詞大腸桿菌；沙門菌，甲型副傷寒；副結(jié)核分枝桿菌；細菌菌苗；肽類；抗藥性，細菌;藥物耐受性；病原菌；耐藥性；疫苗中圖分類號R378文獻標志碼A文章編號1008-9292(2013)02刃12526傳染病依然是當(dāng)前威脅人類健康和生命的主要疾病之一。例如,0139群霍亂、SARS、禽流感、豬鏈球菌病等新發(fā)傳染病(emerginginfectiousdiseases)不斷出現(xiàn),結(jié)核病、甲副傷寒、手足口病、H1N1流感等再現(xiàn)傳染病(re-emerginginfectiousdiseases)重新流行【戚。細菌性再發(fā)傳染病往往與病原

3、菌耐藥性增強密切相關(guān)。例如，目前我國臨床上分離的結(jié)核分枝桿菌對多種抗結(jié)核藥物的耐藥率高達50%-70%8,甲型副傷寒沙門菌對臨床常用抗生素的耐藥率高達60%以上，但其耐藥分子機制尚未完全明了。接種疫苗是預(yù)防各種傳染病最為經(jīng)濟和有效的措施，尤其在預(yù)防和控制耐藥性病原菌引起的傳染病更有實際價值?；蚬こ桃呙缡钱?dāng)前疫苗研發(fā)的主要方向，雖然存在產(chǎn)量較低及免疫保護性較弱等缺陷，但采用多抗原肽(multipleantigenicpeptide,MAP)疫苗研發(fā)策略有可能解決上述問題。因此，作者就近年來二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)與病原菌耐藥性關(guān)系、MAP疫苗研究進展及其發(fā)展趨勢進行簡要論述，供相關(guān)領(lǐng)域研究者參考。1細

4、菌耐藥相關(guān)信號傳導(dǎo)與調(diào)控1.1細菌耐藥主要機制目前已知細菌對抗生素耐藥的主要機制是:產(chǎn)生藥物鈍化酶;抗生素受體突變而與抗生素結(jié)合(親和)能力下降;下調(diào)藥物膜通道蛋白表達或降低膜通透性,使進入細菌的抗生素減少;通過細菌特定的分泌系統(tǒng)(藥物外排泵)將菌體內(nèi)的抗生素外排。以往對細菌耐藥機制研究大多局限于發(fā)現(xiàn)新型藥物鈍化酶、藥物膜通道蛋白和外排泵及耐藥相關(guān)抗生素受體突變新類型。近年來，細菌信號傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控藥物鈍化酶與藥物膜通道蛋白表達、藥物外排泵活化及其在細菌耐藥性形成過程的重要作用逐漸引起了人們的關(guān)注。12細菌二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)任何生物必然與其生存環(huán)境發(fā)生相互聯(lián)系和影響，實現(xiàn)這種相互聯(lián)系和影響的最主要

5、方式是通過彼此之間收稿日期：2013-01-24修回日期：2013-02-18基金項目：浙江省H然科學(xué)基金資助項目(LY12H19002)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金資助項目(2011KYB006).作者簡介:孫愛華(1968-)，女，教授，主要從事病原曲致病與耐藥機制及實驗室診斷方法研究.通訊作者:嚴杰(1956-),男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博導(dǎo),主要從事病原菌致病機制及基因工程疫苗研究；E-mail：med_bp的信息交換及反應(yīng)，感受和應(yīng)答外界信號物質(zhì)基礎(chǔ)是信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。與哺乳類動物細胞比較，細菌信號傳導(dǎo)系統(tǒng)相對簡單,一般由兩類分工明確的蛋白組成，故稱之二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)（two-compone

6、ntsignalingsystem,TCSS）:跨膜傳感蛋白（sensorprotein,SP）:多為具有信號分子受體功能的組氨酸激酶,少數(shù)為絲氨酸/蘇氨酸激酶；胞漿內(nèi)應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（responseregulatorprotein,KRP），通常被跨膜傳感激酶磷酸化后激活,具有轉(zhuǎn)錄因子樣作用，通過調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)物表達水平對環(huán)境信號進行適應(yīng)性應(yīng)答nn。目前認為,每種細菌至少需要數(shù)十個不同的TCSS,才能具備感受各種環(huán)境信號并進行反應(yīng)的能力，并且在病原菌趨化、黏附與定植、分泌毒力因子、產(chǎn)生耐藥性等過程中發(fā)揮作用網(wǎng)；。13病原菌耐藥相關(guān)信號傳導(dǎo)及其調(diào)控作用1.3.1誘導(dǎo)藥物鈍化酶表達我們的實驗結(jié)果顯示

7、，在1/4最低抑菌濃度（MIC）的青霉素或頭胞嚏胯刺激下，大腸埃希菌&內(nèi)酰胺類鈍化酶基因（TEM、SHV、CTX-M）表達水平迅速，且升高顯著，在1/4MIC的鏈霉素作用下，大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌氨基糖甘類鈍化酶基因aac（6'）.Ib、aac（3）-U、aph（3，）和aac（6）-Ie.aph（2）.Ia表達水平也得到快速上調(diào)，但上述鈍化酶基因表達水平上調(diào)可被組氨酸激酶阻斷劑氯策碘柳胺所抑制，提示亞致死量抗生素可作為外源信號分子，通過TCSS上調(diào)藥物鈍化酶基因表達水平，從而表現(xiàn)為對抗生素的耐藥性皿。1.3.2抑制抗生素活化異煙豚和乙胺丁醇是常用抗結(jié)核藥物。

8、業(yè)已證明，異煙豚須經(jīng)結(jié)核分枝桿菌過氧化氫酶過氧化物酶氧化后才能形成具有抑制分枝菌酸合成活性的中間產(chǎn)物，結(jié)核分枝桿菌編碼過氧化氧酶-過氧化物酶的katG基因表達上調(diào)可使菌株對異煙麟高度敏感U;乙胺丁醇能選擇性地抑制結(jié)核分枝桿菌細胞壁組分阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯甘露聚糖的合成,若編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的embA/embB基因過度表達，可使結(jié)核分枝桿菌持續(xù)合成上述阿拉伯聚糖而表現(xiàn)為對乙胺丁醇的耐藥有線索顯示，結(jié)核分枝桿菌SenX3/RegX3和PknH/EmbR可能是分別調(diào)控katG和embA/embB基因的TCSS*17*191o1.3.3抑制抗生素受體表達肺炎鏈球菌臨床菌株有很高的耐藥率,但該菌不產(chǎn)

9、生內(nèi)酰胺酶】。青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）突變被認為是肺炎鏈球菌對&內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要機制，但有證據(jù)顯示,CiaH/CiaRTCSS中的CiaH失活或跨膜真核型絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶StkP發(fā)生突變，細菌可產(chǎn)生與PBPs突變無關(guān)的對青霉素耐藥性2b23o我們的實驗結(jié)果顯示，CiaR可與PBPs編碼基因啟動子結(jié)合并顯著下調(diào)基因表達水平，肺炎鏈球菌StkP胞外區(qū)具有PBPs功能結(jié)構(gòu)域，StkP編碼基因被敲除后,PBPs表達水平極顯著下降且對青霉素和頭抱唆腭耐藥性顯著增強，提示StkP可作為B-內(nèi)酰胺類抗生素傳感激酶并通過CiaR調(diào)控PBPs表達，從而呈現(xiàn)為對階內(nèi)酰胺類抗生

10、素的高耐藥性。1.3.4下調(diào)細菌膜通透性細菌對氨基糖昔類抗生素耐藥機制依次為藥物攝取的減少、藥物主動外排、鈍化酶作用及核糖體結(jié)合位點改變。PhoQ/PhoP是一種多功能的TCSS,但可下調(diào)鼠傷寒沙門菌膜通透性，減少細菌對氨基糖昔類抗生素攝取量，導(dǎo)致細菌對此類抗生素耐藥我們以往研究證實，PhoQ/PhoP介導(dǎo)了銅綠假單胞菌對氨基糖甘類抗生素的耐藥性.敲除組氨酸激酶PhoQ編碼基因可使細菌對氨基糖甘類抗生素鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星和妥布霉素的敏感性提高5122048倍，其機制與該TCSS下調(diào)氨基糖昔類抗生素膜通道蛋白OprH表達水平有直接關(guān)系曰。135促進藥物外排細菌1型分泌系統(tǒng)（T1SS）是由

11、三種蛋白亞單位組成的輸出復(fù)合物:結(jié)合于內(nèi)膜的ATP結(jié)合裝置（ABC）、在外膜中形成通道的外膜蛋白（OMP）、位于周漿間隙連接ABC和通道0MP的蛋白（MFP）。除分泌溶血素等細菌毒性蛋白外，進入菌體的多種抗菌藥物主要通過T1SS外排。有研究顯示，大腸埃希菌EvgA/EvgSTCSS可調(diào)控膜通道OMP和MFP表達并激活A(yù)BC,從而促進抗菌藥物外排,其分子作用機制尚有待于進一步證實叫。.、.2疫苗研究現(xiàn)狀與多抗原肽疫苗2.1疫苗種類及其優(yōu)缺點目前實際使用的疫苗有全菌死疫苗、減毒活疫苗、組分疫苗(如莢膜多糖)和基因工程疫苗。全菌死疫苗安全性好，但免疫保護性較弱、毒副作用較大;減毒活疫苗免疫效果雖好，

12、但毒副作用較大且存在生物安全問題;組分疫苗安全有效，但不是所有病原菌均可產(chǎn)生能用于制備組分疫苗的抗原C目前的基因工程疫苗主要是以單一重組蛋白為抗原的疫苗，抗原成分明確且無明顯的毒副作用，但免疫效果不甚理想。病毒表面蛋白抗原種類很少,故單一重組蛋白為抗原的基因工程疫苗預(yù)防病毒感染效果較好(如乙型肝炎表面抗原HBsAg疫苗)。細菌抗原構(gòu)造復(fù)雜多樣，往往需要多靶點攻擊才能奏效,故單一抗原的基因工程疫苗預(yù)防細菌感染效果較差。采用多種細菌蛋白抗原的多價基因工程疫苗是提高免疫效果的有效途徑,但各基因獨立表達無疑將使疫苗成本成倍增加。用柔性肽作為連接序列，可構(gòu)建含多個抗原編碼基因的人工融合基因，但目前的原核

13、表達系統(tǒng)表達大片段基因的效率低下。2.2病原菌血清群型與多價疫苗幾乎所有病原菌均存在抗原性并有一定差異的血清群或血清型。為了有效預(yù)防某種病原菌感染，往往根據(jù)當(dāng)?shù)貎?yōu)勢流行的血清群或血清型來制備多價疫苗。例如，我國目前使用的鉤端螺旋體疫苗即為57個血清群組成的多價全菌死疫苗3】。然而，不同血清群或血清型的病原菌往往存在共同的蛋白抗原，因此叮用于制備通用性基因工程疫苗功。2.3疫苗增強性疾病一些病原微生物疫苗接種后再感染相應(yīng)病原微生物時，其致病作用明顯增強的現(xiàn)象稱為疫苗增強性疾病(Vaccineenhanceddisease,VED)oVED雖非普遍現(xiàn)象,但仍可見于不少病原微生物疫苗中，如人呼吸道合

14、胞病毒、SARS冠狀病毒、肺炎支原體、沙眼衣原體死疫苗或亞單位疫苗。究其原因，是這些病原微生物致病主要機制為引發(fā)病理性免疫反應(yīng)，疫苗接種使機體處于致敏狀態(tài),感染相應(yīng)病原微生物后引發(fā)病理性超敏反應(yīng)而使疾病明顯加重。G蛋白、S蛋白、主要外膜蛋白(MOMP)和熱休克蛋白60(HSP60)分別是呼吸道合胞病毒、SARS冠狀病毒、肺炎支原體和沙眼衣原體引起VED的主要因子3小。因此,VED是此類病原微生物至今尚無疫苗的主要原因。24MAP疫苗定義與特點病原微生物蛋白抗原分了中抗原表位(antigenicepitope)與高分子核心載體人工交聯(lián)的多價組合式疫苗稱為MAP疫苗。該疫苗具有能同時提呈多種多個抗

15、原表位、抗原提呈作用強、可通過各抗原肽分枝之間相苴作用以非共價結(jié)合形成構(gòu)成表位(conformationalepitopes)而提高免疫效果、個別氨基酸突變不影響抗原提呈及后繼免疫反應(yīng)、不同表位可組合式裝配等特點，因此成為當(dāng)前新型疫苗研發(fā)前沿。2.4.1抗原表位是抗原分子中能誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答的短肽片段，與抗原決定簇(antigendeterininant)的含義基本相似，但抗原表位一般含有與MHC分子和B細胞表位結(jié)合位點?？乖砦豢煞譃門細胞和B細胞表位，分別引發(fā)細胞和體液免疫應(yīng)答。在實際研究中，通常先采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測蛋白抗原分子中的B細胞表位(hltp：/mobyle.pasteur.

16、fr/cgi-bin/portal,bp?#forms:antigenic)和T細胞表位(http：/www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dl1/EpitopePrediclion.htm)，此類表位稱為預(yù)測表位，其功能有待于實驗證明。盡管預(yù)防性疫苗主要是通過誘生抗體達到保護作用，但T表位可激活T細胞應(yīng)答而有利于提高抗體水平，故目前傾向于采用T和B聯(lián)合表位(TB)肽制備MAP疫苗切。通常采用噬菌體展示系統(tǒng)表達含T-B聯(lián)合預(yù)測表位的重組PIII蛋白，然后采用該蛋白抗原重組表達產(chǎn)物及全菌抗血清進行WesternBlot反應(yīng)，根據(jù)雜交信號有無或強弱,分為無效表位、有

17、效表位和優(yōu)勢表位。優(yōu)勢表位體現(xiàn)該蛋白分子主要抗原性，可用于制備MAP疫苗*氣2.4.2核心載體為人工合成的寡聚或多聚高分子抗原表位肽通過分子交聯(lián)法連接于核心載體'，形成以核心載體為中心、外展多種抗原表位樹狀臂(dendriticarms)的交聯(lián)體，也即MAP疫苗?？乖砦慌c核心載體交聯(lián)后成為完全抗原，其免疫原性顯著增強。核心載體需具備如下基本條件:無毒性;有較多表面基團用于交聯(lián)抗原表位肽;分子大小可控;能生物降解，2.5MAP疫苗應(yīng)用前景上述MAP疫苗的優(yōu)點和特點,決定了該疫苗有廣泛的應(yīng)用前景。2.5.1克服現(xiàn)有表達系統(tǒng)效率的限制以300個氨基酸組成的抗原分子為例，一個T-B聯(lián)合抗原表

18、位（通常為30個氨基酸的短肽）若有完整抗原分子50%免疫原性,10個表位效果相當(dāng)于完整分子5倍,但長度相似。因此，可利用基因工程技術(shù)構(gòu)建含特定蛋白酶（如腸激酶）酶切位點的重復(fù)串聯(lián)T-B聯(lián)合抗原表位序列，然后再經(jīng)過常規(guī)重組表達、通過蛋白酶酶切及分離獲得大址目的表位，從而克服現(xiàn)有表達系統(tǒng)效率的限制而提高產(chǎn)量。2.5.2制備有VED現(xiàn)象的病原微生物疫苗業(yè)已發(fā)現(xiàn)，同一蛋白抗原中可分別存在誘導(dǎo)正常抗感染免疫力或病理性免疫應(yīng)答的不同抗原表位，通過抗原表位篩選和免疫學(xué)鑒定，可分辨誘導(dǎo)正?？垢腥久庖邞?yīng)答或病理性免疫應(yīng)答的抗原表位例如，沙眼衣原體誘導(dǎo)的Thl型細胞免疫應(yīng)答有免疫保護作用，Th2型細胞因于IL-1

19、0則介導(dǎo)病理性免疫反應(yīng)。因此，首先確定有VED現(xiàn)象的病原微生物主要蛋白抗原,從中篩選出能誘導(dǎo)正?？垢腥久庖吡Φ目乖砦唬缓笾苽銶AP疫苗。2.5.3制備通用性病原菌基因工程疫苗如前所述，細菌是原核細胞,抗原構(gòu)造復(fù)雜多樣，多價基因工程疫苗才能有較好的免疫保護效果盡管病原菌常有不同血清群或血清型，但往往存在數(shù)種共同蛋白抗原】。因此為了提高基因工程疫苗效果、避免多次表達而降低生產(chǎn)成本，采用MAP疫苗研發(fā)策略是制備通用性病原菌基因工程疫苗的有效途徑。3展望耐藥性是一些細菌感染性疾病再次流行的主要原因，接種疫苗是預(yù)防傳染病最有效的措施。因此深入探討細菌耐藥新機制、研發(fā)更為有效的細菌新型疫苗具有重要醫(yī)學(xué)

20、意義。感染是病原微生物與宿主相互作用過程，這個觀念已被普遍接受，但耐藥也是細菌針對環(huán)境中抗生素殺菌或抑菌作用的反應(yīng)性抵抗行為。因此，闡明細菌感受抗生素分子信號的受體、抗生素信號菌體內(nèi)傳遞途徑、調(diào)控耐藥相關(guān)基因(藥物鈍化酶、抗生素受體、藥物活化酶、藥物膜通道蛋白及外排系統(tǒng))表達的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(RRP)及其工作機制，將是今后細菌耐藥性研究的新領(lǐng)域，其研究成果將為研發(fā)以干擾細菌耐藥相關(guān)信號通路為原理的新型抗耐藥細菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。同時，適用范圍廣、高效無毒、多價組合式新型病原菌基因工程疫苗也將是今后疫苗研發(fā)的主攻方向，這不僅需要研發(fā)出更為便利高效的基因表達新系統(tǒng)及相關(guān)生物工程新技術(shù)，同時也要求人們

21、對病原菌對抗宿主免疫力機制以及宿主抗感染免疫機制本質(zhì)有更為深入的認識與了解。References:1 SHAKHNOVICHEA,STURTEVANTI),MEKALANOSJJ.Molecularmechanismsofvirstatinresistancebynon-Ol/non-0139strainsofVibriocholeraeJ.MolMicrobiol,2007,66(6):1331-1341.2 KANB,WANGM,JINGH；etal.Molecularevolutionanalysisandgeographicinvestigationofsevereacuterespi

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