比色法與核磁共振法測(cè)定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖氧乙酰基含量的比較.docx

1、.論著比色法與核磁共振法測(cè)定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖氧乙酰基含量的比較袁菲，李阿妮，羅樹權(quán),孔素娟，馬缽，王晶，李燕婷，劉方蕾蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第-研究室甘肅省疫防工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730046摘要：目的比較Hestrin比色法(簡(jiǎn)禰比色法)和核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)法在檢測(cè)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖氧乙?；?O-Acetyl,OAc)含量的相關(guān)性和精密度。方法用比色法和NMR法測(cè)定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌英膜多糖及其多糖衍生物,Y、W135群英膜多糖水解物的OAc含fit,比較分析兩種方法的

2、相關(guān)性及精密度。結(jié)果兩種方法檢測(cè)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含量的決定系數(shù)分別為尸N0.954&N0.960、正N0.969、中no.972；比色法檢測(cè)3批C群腦膜炎球菌莢膜多糖(PSC)OAc含蛾的精密度，SO值分別為0.21,0.21,0.18,對(duì)應(yīng)CV值分別為9.03%,9.01%、8.70%(95%置信區(qū)間);NMR法檢測(cè)3批A群腦膜炎球菌莢膜多糖(PSA)OAc含量的精密度,SD值分別為0.66.0.78、0.83,對(duì)應(yīng)CV值分別為0.72%、0.85%、0.93%(95%置信區(qū)間)；結(jié)論比色法和NMR法在檢測(cè)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含

3、量方面相關(guān)性良好，精密度良好.核磁法較比色法精密度更高°關(guān)鍵詞：A、C、Y、W135群腦膜炎奈瑟曲;氧乙?；m;核磁共振法；比色法中圖分類號(hào)：R378文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1005-5673(2017)06-0013-09DOI：10.13309/ki.pmi.2017.06.003ComparisonofHestrincolorimetricandNMRmethodsinanalysisofO-acetylcontentofgroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalcapsularpolysaccharidesYUANFei,UA-ni,L

4、UOShu-quan,KONGSu-juan,MAYu,WANGJing,UYan-ting,LIUFang-leiFirstDepartmentofResearch,IxinzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,lid.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:LIUFang-lei,E-mail:lflei30Abstract:ObjectiveTocomparetheHestrincol

5、orimetricandNMR(nuclearmagneticresonance,NMR)methodsinanalysisoftheO-acetyl(OAc)contentfbrthegroupsA,C,YandW135Neisseriameningococcalcapsularpolysaccharides(PSC).MethodsTousetheHestrincolorimetricandNMRmethodsinanalyzingtheOAccontentofthegroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalPSCandtheir*sderivativ

6、esandOAccontentfromhydrolyzedPSCingroupsYandW135.Theconsistencyandprecisionwerecomparedbetweenthetwomethods.ResultsThecorrelationcoefficientR*N0.954,0.960,0.972,0.969wereobnUiinetlbyusingbothmethods.TheinternalSDwere0.21,0.21,0.18andCVwerc9.03%,9.01%,8.75%(95%Cl).respectively,indeterminationOAcconte

7、ntfrom3lotsPSCbyHestrincolorimetricmethod；andtheinternalSDwere0.66,0.78and0.83,andtheCVwere0.72%,0.85%and0.93%byNMRincorrespondence.ConclusionThegoodcorrelationandprecisionwereobtainedinanalyzinggroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalPSCbyusingofHestrincolorimetricandNMRmethods,andthelaterhadanbett

8、erprecision.Keywords：GroupsA,C,Y,W135Neisseriameningitides；O-Acetylcontent；Nuclearmagneticresonance(NMR)；Hestrincolorimetricmethod基金項(xiàng)目：國家科技重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)(20I3ZX09402-302-215)作者簡(jiǎn)介：袁菲(1982-),女，醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師，主要從事細(xì)菌性多糖蛋白結(jié)合疫苗的研發(fā)工作。通信作者：劉方蕾，研究員,E-mail：lflei30腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)(以下簡(jiǎn)稱腦膜炎球菌)是腦膜炎(meningitis)和腦

9、膜炎球菌血癥(meningococcemia)等侵襲性細(xì)菌感染的主要致病菌。莢膜多糖是腦膜炎球菌一種重要的毒力因子，其生物組分不同，可分為13個(gè)血清型，A、B、C、W135、X和Y是主要的致病血清型。其中，A群腦膜炎球菌莢膜多糖的C-3位和C-4位;C群莢膜多糖的C-7位和C-8位;Y群莢膜多糖的C-7位和C-9位以及W135群莢膜多糖的C-7位和C-9位均存在氧乙?；揎棧姳?。氧乙?；∣-Acetyl,OAc）是腦膜炎球菌莢膜多糖上的重要功能基團(tuán)，但其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在結(jié)合物的制備過程中容易丟失。A群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc去除后導(dǎo)致多糖的免疫原性降低。OAc含量是腦膜炎球菌多搪疫苗和

10、多糖蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)過程中十分重要的質(zhì)控指標(biāo),WHO和歐洲藥典均對(duì)其提出了明確的質(zhì)控要求質(zhì)6】。表1腦膜炎球菌英膜多糖重復(fù)單位結(jié)構(gòu)Tab.1StructureoftherepeatunitsofCPSsfromthefourgroupsofmeningococcalpolysaccharidesfourmeningococcal莢膜多糖血清型結(jié)構(gòu)A*6)-a-D-ManpNAc-(1-PO4-*13,4OAcC-2-a-I)-NeupNAc-9-»|7,8OAcY-6)-a-Glcp-(1-*4)-a-NeupNAc-(2|7,9OAcW135-*6)-a-(>alp-(l-*

11、4)-a-NeupNAc-(2-#|7,9OAcllestrin比色法（簡(jiǎn)稱比色法）和核磁共振（rmbearmagneticresonance,NMR）法是目前運(yùn)用最廣泛的兩種測(cè)定OAc含量的方法。中華人民共和國藥典2015版（三部）（簡(jiǎn)稱中國藥典）推薦使用比色法，歐洲藥典等也仍沿用傳統(tǒng)的比色法計(jì)算OAc含量。近年來，NMR法的發(fā)展在鑒別細(xì)菌多糖結(jié)構(gòu)和純度、指導(dǎo)細(xì)菌多糖疫苗及多糖蛋白結(jié)合疫苗的質(zhì)量提升方面做出了極大的貢獻(xiàn),WHO相關(guān)指導(dǎo)原則要求各監(jiān)管機(jī)構(gòu)盡可能采用NMK法進(jìn)行多糖質(zhì)雖的分析質(zhì)控。重要的是，比色法只能計(jì)算OAc總含員，而NMR法卻能區(qū)分不同位置上的氧乙?；揎椙闆r。本研究采用比色

12、法和NMR法測(cè)定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌英膜多糖及其多糖衍生物,Y、W135群莢膜多糖水解物的OAc含量，進(jìn)行相關(guān)性分析，并對(duì)兩種方法的精密度等進(jìn)行了比較,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1材料與方法1.1樣品A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗一室提供；A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物，Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖水解物均由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室提供。具體批號(hào)見表2。1.2主要試劑及儀器氯化乙酰膽堿、鹽酸羥胺、鹽酸、酷酸鈉、三氯化鐵、氫氧化鈉，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。UV.2550紫外分光光度計(jì)購自日本島津公司；B

13、ruker600MHz核磁共振譜儀購自瑞士Bruker（布魯克）有限公司；ScientificVORTEXGENIE振蕩器購自美國SI公司。1.3溶液的配制2mol/L鹽酸羥胺溶液：稱取鹽酸羥胺13.9g,加水溶解并稀釋至100mL,28Y保存;3.5mol/L氫氧化鈉溶液:稱取氫氧化鈉14.0g,加水使溶解并稀釋至100mL；4mol/L鹽酸溶液:量取鹽酸33.3mL,加水稀釋至100mL；0.37mol/L三氯化鐵-鹽酸溶液：稱取三氯化鐵（FeCl3-6H,0）10.0g,加0.1mol/L鹽酸溶液溶解稀釋至100mL；堿性羥胺溶液：量取等體積的鹽酸羥胺溶液（2mol/L）和氫氧化鈉溶液（

14、3.5mol/L）混合,3h內(nèi)使用。1.4 供試品的制備14.1對(duì)照品溶液的制備稱取已干燥至恒亞的氯化乙酰膽堿22.7mg,置50mL容量瓶中，加0.001mol/L醋酸鈉溶液（pH4.5）溶解并稀釋至50mL,搖勻。1.4.2樣品溶液的制備取各樣品,用水稀釋成OAc濃度為0.52.5mmol/L的溶液，OAc含量的檢測(cè)1.5.1NMR法參照文獻(xiàn)7J檢測(cè)供試品OAc含量，檢測(cè)溫度為298K（25T）,選擇的脈沖程序?yàn)閦go具體參數(shù)設(shè)置如下:采樣點(diǎn)數(shù)為64k,圖譜寬度為8012Hz,采樣時(shí)間為4.089s,弛豫延遲時(shí)間（叫）為57、掃描次數(shù)（NS）N64。信號(hào)經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換后加入0.3Hz的窗口函

15、數(shù)，最后使用Topspin3.0軟件處理結(jié)果。0】值采用67倍的7；值,PSA的1）,值設(shè)定為18,PSC、PSY和PSW的0值為20,NS值設(shè)置為128次。1.5.2比色法參照中國藥典，進(jìn)行OAc含鼠的測(cè)定。1.6方法驗(yàn)證1.6.1比色法和NMR法相關(guān)性用比色法兩次檢測(cè)的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含量結(jié)果為X,NMR法兩次檢測(cè)的OAc結(jié)果為V,計(jì)算各樣本的均值（*和Yt）、樣本重復(fù)測(cè)定值間差值的絕對(duì)值和D,）及兩種方法測(cè)定結(jié)果均值間的差值（r-x.）。計(jì)算樣本重復(fù)測(cè)定值間差值（七,和DQ的平均數(shù)和兩種方法測(cè)定結(jié)果均值間差值（K-X）的平均數(shù)，超出上述平均數(shù)4倍時(shí)，為離群值

16、，應(yīng)予刪除。以匕對(duì)X,作散點(diǎn)圖，以（E-M）對(duì)R作偏差圖，得到每個(gè)結(jié)果的散點(diǎn)圖和偏差圖，同時(shí)計(jì)算兩種方法的線性回歸方程。估算各樣品的預(yù)期偏差、相對(duì)偏差和預(yù)期偏差95%的置信區(qū)間。當(dāng)估計(jì)誤差大于預(yù)期偏差置信區(qū)間的上限或小于預(yù)期偏差置信區(qū)間下限時(shí)，差異較大，偏差不能被接受；當(dāng)估計(jì)誤差位于預(yù)期偏差置信區(qū)間上限與下限之間時(shí)，差異相當(dāng)，偏差可以接受。1.6.2精密度對(duì)3批C群莢膜多糖HP20I505002.HP201505003.HP201505004用比色法重復(fù)檢測(cè)OAc7次，對(duì)3批A群莢膜多糖PSA試HP201506001、PSA-試HP201604001、PSA-試HP20101101用NMR法重

17、復(fù)檢測(cè)OAc12次,計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SO）及變異系數(shù)（CV）02結(jié)果2.1比色法和NMR法檢測(cè)OAc含量結(jié)果的相關(guān)性分析兩種方法檢測(cè)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含量:決定系數(shù)分別為R2N0.954、必no.960、足no.969、&2no.972,見表36和圖14。兩種方法在各型莢膜多糖檢測(cè)OAc含量時(shí)，估計(jì)誤差位于預(yù)期偏差置信區(qū)間上下限之間，偏差均可接受，見表7。2.2精密度2.2.1比色法的精密度3批PSCOAc含量的精密度檢測(cè),SD值分別為0.21A21.0.18,對(duì)應(yīng)的CV值分別為9.03%、9.01%、8.70%,3批批次CV值均<10

18、.00%，見表8。2.2.2NMR的精密度3批PSAOAc含量的精密度檢測(cè),SD值分別為0.66、0.78.0.83,對(duì)應(yīng)的CV值分別為0.72%、0.85%、0.93%,3批批次CV值均<1.00%，見表9。表2A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、衍生物及水解物批號(hào)Tab.2Thelotofcapsularpolysacharide,itsderivativesandhydrolysedproductfromGroupA,C,Y,W135Neisseriameningitidis血清型樣品批號(hào)A群多糖PSA-200807005；PSA-201011001；PSA-20130500

19、3；PSA-201506001；PSA-201604001；PSA-201609002；PSA-201612001多糖衍生物PSA-DAB201603001；PSA-DAB201603002；PSA-DAB201605003；PSA-DAB201605004；PSA-DAB201609014-201609018；PSA-DAB20170300I；PSA-DAB201703002C群多糖PSC-201604001；PSC-2016U001多慵衍生物PSC-DAB201509005,4FF純化；PSC-DAB201603001；PSC-DAB201603001,4FF純化；PSC-DAB20160

20、3002-006；PSC-DAB201605007；PSC-DAB201605007.還原后；PSC-DAB201703001W135群多糖PSW-精20100504；PSW-201602001多糖衍生物PSW-DAB201508006；PSW-DAB201603001；PSW-DAB201603001,4FF純化；PSW-DAB201603002-201603002005；PSW-DAB201604005,4FF純化；PSW-DAB201604006Y群多糖水解物PSW-hydro201603005-201604008多糖Y-試P201602001多糖衍生物Y-DAB-試HD-2016030

21、01-HD-201603009；Y-DAB-試HD-201603001,4FF純化；Y-DAB-試HD-201604010；Y-DAB-試HD-201604010,4FF純化；Y-DAB-試HD-201604010,4FF再純化多糖水解物Y-hydrolysate試HH201604008；Y-hydrolysate-試HH201604009表3用兩種方法分別檢測(cè)A群莢膜多糖及其衍生物的OAc含量Tab.3ThedetectedcontentofOAcforcapsularpolysaccharidesanditsderivativefrommeningococcalgroupAbycolori

22、metricandNMRmethodsA群多糖批號(hào)比色法檢測(cè)OAc(mmol/g)NMR法檢測(cè)0Ac(mol/mol)匕匕2YX,XPSA-2008070052.382.3990.1591.070.010.9288.23PSA-2010110012.012.0384.6084.670.020.0782.62PSA-2013050032.622.8693.7594.000.240.2591.14PSA-2015060012.552.8292.7092.970.270.2790.15PSA-2016040012.302.3988.9589.400.090.4586.83PSA-2016090022

23、.162.3486.8586.960.180.1184.66PSA-2016120012.222.3487.7587.870.120.1285.53PSA-DAB2016030012.372.6590.0090.010.280.0187.50PSA-DAB2016030022.612.8693.6093.720.250.1290.93PSA-DAB2016050032.242.4088.0588.520.160.4785.97PSA-DAB2016050042.152.3686.7087.380.210.6884.79PSA-DAB2016090142.382.5690.1590.660.18

24、0.5187.94PSA-DAB20I6090152.242.4788.0588.400.230.3585.87PSA-DAB2016090162.202.2287.4587.550.020.185.29PSA-DAB2016090172.232.3287.9088.340.090.4485.85PSA-DAB2016090182.412.6090.6091.150.190.5588.37PSA-DAB2017030012.482.7891.6592.270.300.6289.33PSA-DAB2017030022.332.4389.4090.390.100.9987.52908812.448

25、x+59.566/r=0.954841.92.12.3比色法測(cè)定OAc含罐(mmol/g)圖1用兩種方法檢測(cè)A群莢膜多糖相關(guān)性Fig.1CorrelationanalysisofcapsularpolysaccharidesfromGroupAbycolorimetricandNMRmethods表4用兩種方法分別檢測(cè)C群莢膜多糖及其衍生物的OAc含量Tab.4ThedetectedcontentofcapsularpolysaccharidesanditsderivativefrommeningococcalgroupCbycolorimetricandNMRmethods比色法檢測(cè)OAc(

26、mmol/g)NMR法檢測(cè)OAc(mol/mol)C群多糖批號(hào)0、Dfx.x2Y,Y2PSC-2016040012.342.3780.7981.680.030.8978.88PSC-2016110012.572.8984.2484.560.320.3281.67PSC-DAB201509005,4FF純化2.642.9085.2985.830.260.5482.79PSC-DAB2O16O3OO12.832.9388.1488.980.100.8485.68PSC-DAB201603001,4FF純化3.083.3991.8991.910.310.0288.67PSC-DAB201603002

27、2.332.5480.6481.220.210.5878.50PSC-DAB2016030032.302.3480.1980.330.040.1477.94PSC-DAB2016040042.362.4181.0982.050.050.9679.19PSC-DAB2016040052.042.2576.2977.070.210.7874.54PSC-DAB2016040062.462.5082.5982.860.040.2780.25PSC-DAB2016050072.302.5980.1980.960.290.7778.13PSC-DAB201605007，還原后2.392.6881.548

28、1.920.290.3879.20PSC-DAB2017030012.292.4080.0480.720.110.6878.049590(一ouvlolussz(一ouvlolussz502.2y=13.408X+4B.7UR?=0.9602.42.62.8比色法測(cè)定OAc含ft(mmol/g)3.03.23.4圖2用兩種方法檢測(cè)C群莢膜多糖相關(guān)性Fig.2CorrelationanalysisofcapsularpolysaccharidesfromGroupCbycolorimetricandNMRmethods表6用兩種方法分別檢測(cè)Y群英膜多糖及其衍生物，水解物的OAc含量Tab.6Th

29、edetectedcontentsforcapsularpolysaccharides,O-acetyl,anditsderivativefrommeningococcalGroupYbycolorimetricandNMRmethodsY群多糖批號(hào)比色法檢測(cè)OAc(mmol/g)NMR法檢測(cè)0Ac(mol/mol)匕y20,D,YEY-試HP2016020010.790.9031.9032.210.120.3131.21Y-hydrolysate試HH2OI6O4OO80.700.7830.5530.770.090.2229.92Y-hydrolysate-試HH20I6040090.690

30、.8730.4730.590.180.1229.75Y-DAB-試HD-2O16O3OO10.770.8431.6131.740.070.1330.87Y-DAB-試HD-201603001,4FF純化0.760.9331.5431.930.170.3930.89Y-DAB-試HD-2O16O3OO20.780.8831.8832.310.010.4331.26Y-DAB-試HD-2O16O3OO30.770.8831.6131.730.110.1230.85Y-DAB-試HD-2016030040.600.7429.0629.100.140.0428.41Y-DAB-試HD-20160300

31、50.590.7328.9729.290.140.3228.47Y-DAB-試HD-2016030061.051.0835.8736.J20.030.2534.93Y-DAB-試HD-2016030071.011.1235.2735.430.110.1634.29Y-DAB-試HD-2016030090.910.9933.8034.240.080.4433.07Y-DAB-試HD-2016040100.670.7530.2030.450.080.2529.61Y-DAB-試HD-201604010,4FF純化0.600.6629.1229.260.060.1428.56Y-DAB-試HD-20

32、1604010,4FF再純化0.600.6129.1229.370.010.2528.6437y=15.129x+19395/?2=0.97235333129271.01.01.20.40.60.8比色法測(cè)定OAc含tt(mmol/g)圖4用兩種方法檢測(cè)Y群多糖相關(guān)性Fig.4CorrelationofO-acetylcontentincapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupYbycolorimetricandNMRmethods表7A、C、W135、Y群莢膜多糖OAc含量檢測(cè)結(jié)果偏差分析Tab.7VarianceanalysisofO-acetyl

33、contentincapsularpolysaccharidefromthefourmeninicocalgroups英膜多糖血清型預(yù)期值預(yù)期偏差相對(duì)偏差（%）A89.200.670.70C80.200.600.74W13526.500.291.10Y28.500.702.30表8比色法檢測(cè)3批C群莢膜多糖OAc含量的精密度Tab.8TheprecisionfordetectedO-acetylcontentincapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupCbycolorimetricmethod測(cè)定次數(shù)3批PSCOAc含量的精密度（mmol/g）PSC

34、試HP201505003PSC試HP201505002PSC試HP20150500411.932.311.7922.252.121.9232.152.062.2742.291.992.1452.232.561.8762.522.462.2672.592.442.00均值2.282.282.04SD0.210.210.18CV(%)9.039.018.70表9NMR法檢測(cè)3批A群莢膜多糖OAc含量的精密度Tab.9TheprecisionofdetectedO-acetylcontentfromcapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupAbyNMR測(cè)定次

35、數(shù)3批PSAOAc含量的精密度（mmol/mol）PSA試HP201506001PSA-試HP201604001PSA-試HP20101101192.0292.0186.88291.8291.9289.38390.9491.0189.35491.3990.3788.86590.7592.7287.91691.4990.5489.21792.6790.6688.89892.2091.8188.37992.1492.7988.321092.6990.9689.161192.0191.4188.521293.0091.1386.93均值91.9391.4488.48SD0.660.780.83CV(

36、%)0.720.850.933討論比色法作為檢測(cè)細(xì)菌莢膜多糖OAc含髭的經(jīng)典方法，經(jīng)過廣泛的運(yùn)用，其檢測(cè)限、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性等均得到廣泛的驗(yàn)證，但此方法只能計(jì)算OAc總含量，而不能區(qū)分不同位置上的氧乙?；揎椙闆r。隨著疫苗可控性不斷提升，需要提供多糖結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息,NMR檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用是一種發(fā)展趨勢(shì)，同時(shí)WHO已認(rèn)可NMR檢測(cè)方法，并推薦其應(yīng)用于多糖或多糖蛋白結(jié)合疫苗的生產(chǎn)和質(zhì)量控制中。從研究結(jié)果來看，在嚴(yán)格控制各種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，比色法和NMR法在檢測(cè)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含量方面均有良好的相關(guān)性，估計(jì)誤差位于預(yù)期偏差置信區(qū)間的上下限之間，偏

37、差均可接受。比色法檢測(cè)PSCOAc含最的精密度，S。值分別為0.21、0.21.0.18,對(duì)應(yīng)CV值分別為9.03%、9.01%、8.70%；NMR法檢測(cè)PSAOAc含量的精密度,SZ)值分別為0.66、0.79、0.83,對(duì)應(yīng)CV值分別為0.72%、0.85%.0.93%；表明使用兩種方法檢測(cè)OAc含量的精密度均為良好。NMR檢測(cè)OAc含量隸屬定量核磁共振(quantitativenuclearmagneticresonance,qNMR)中相對(duì)含量檢測(cè)范疇。它的檢測(cè)條件參數(shù)設(shè)置非常嚴(yán)格，如D,就是其中最重要的參數(shù)之一,qNMR檢測(cè)時(shí)必須5烏才能保證99.3%-99.9%的激發(fā)態(tài)的原子核回到

38、平衡態(tài)，只有這樣才能確保積分面積與質(zhì)子數(shù)成正比，從而保證定量的準(zhǔn)確性;不同的化合物T.值是不同的，且其值受環(huán)境溫度、樣品濃度、離子強(qiáng)度等因素的影響;另一個(gè)重要參數(shù)是NS,它和Di值不同，直接對(duì)qNMR的精密度產(chǎn)生影響。除以上所列的參數(shù)外，還有其他一些重要參數(shù)也值得關(guān)注，如采樣時(shí)間、脈沖序列、激發(fā)角度、窗口函數(shù)選擇等，它們也都對(duì)定量的準(zhǔn)確性和精密度有一定程度的影響。最重要的是，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)NMR檢測(cè)結(jié)果所采取的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差異較大。因此，迫切需要對(duì)NMR法進(jìn)行方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化并進(jìn)行廣泛驗(yàn)證，使其檢測(cè)結(jié)果具有可比性。比色法測(cè)定OAc的標(biāo)線范圍是0.02.5mmol/g,最準(zhǔn)確的樣品測(cè)定范圍僅是1.01.5mmol/g,而NMR定量測(cè)定時(shí)信噪比達(dá)到500:1,信號(hào)和噪音可完全區(qū)分