下呼吸道細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)范(討論稿)

1、下呼吸道細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)范（討論稿）鐘 橋蘇州市立醫(yī)院本部前 言 口咽部正常菌群 常見(jiàn)的肺部感染機(jī)制： 吸入性：定植菌吸入肺部 呼入性：呼吸機(jī)、氣溶膠等 血播性：見(jiàn)于靜脈吸毒或血透患者分析前下呼吸道標(biāo)本檢驗(yàn) 標(biāo)本采集咳痰誘導(dǎo)痰（高滲鹽水誘導(dǎo)3%NaCl 20-30ml）氣管和內(nèi)鏡吸出物（氣管插管24h，就有定植菌，僅有臨床癥狀時(shí)，否則切勿培養(yǎng)氣管吸出物）氣管鏡標(biāo)本（由肺科醫(yī)生或受訓(xùn)后醫(yī)生采集）支氣管肺泡灌洗液（BAL）支氣管灌洗液，保護(hù)性毛刷標(biāo)本（PSB），支氣管穿刺活檢標(biāo)本支氣管灌洗液-BAL-PSB-穿刺活檢標(biāo)本標(biāo)本運(yùn)送無(wú)菌杯條碼12h內(nèi)送檢 超時(shí)，苛養(yǎng)菌如肺炎鏈球菌減少，口咽部正常菌群將

2、過(guò)度生長(zhǎng)標(biāo)本拒收規(guī)則 不接受48h內(nèi)重復(fù)送檢培養(yǎng)的標(biāo)本 拒收以下標(biāo)本申請(qǐng)做下呼吸道感染診斷：u24h內(nèi)采集的痰標(biāo)本u口水u誘導(dǎo)痰u鼻沖洗液和分泌物或鼻孔拭子 標(biāo)本延遲2h且未冷藏，應(yīng)報(bào)告中注明標(biāo)本延誤送檢，可能對(duì)培養(yǎng)結(jié)果造成影響u咽部標(biāo)本u厭氧培養(yǎng)標(biāo)本u支氣管刷培養(yǎng)，只能用保護(hù)性毛刷u支氣管灌洗液，氣道分泌物。污染痰標(biāo)本和氣管內(nèi)標(biāo)本革蘭染色拒收條件的評(píng)價(jià)（痰涂片 2040/LP；氣管吸出物低倍鏡和油鏡下都要檢測(cè)） 不合格標(biāo)本有：不合格標(biāo)本有：痰標(biāo)本 = 10個(gè)上皮細(xì)胞/低倍視野 但如果WBC數(shù)是上皮細(xì)胞數(shù)的10倍，單一形態(tài)的細(xì)菌量達(dá)到3+至4+，可接受標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)成年人支氣管吸出物：10SEC

3、s/LPF或未見(jiàn)細(xì)菌患兒支氣管吸出物：未見(jiàn)細(xì)菌 如WBC 4+，并可見(jiàn)纖維細(xì)胞，但未見(jiàn)細(xì)菌，最好重新涂片做吖啶橙染色，用熒光顯微鏡觀察彈性纖維上是否有細(xì)菌，假單胞菌和嗜血桿菌可能會(huì)在這類(lèi)涂片中漏檢； 還可以見(jiàn)軍團(tuán)菌，此類(lèi)感染中常缺少白細(xì)胞。 門(mén)診接受到大量膿性標(biāo)本，應(yīng)立即接種，不必等待涂片結(jié)果。 拒收培養(yǎng)標(biāo)本報(bào)告方式拒收培養(yǎng)標(biāo)本報(bào)告方式： “涂片所見(jiàn)：每低倍鏡視野含10個(gè)扁平上皮細(xì)胞，提示標(biāo)本質(zhì)量差，不做培養(yǎng)；如果有臨床指征請(qǐng)重新采集標(biāo)本” “涂片檢查40個(gè)視野，未見(jiàn)細(xì)菌，不做培養(yǎng)；如果臨床指征請(qǐng)與實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系” 不能拒收標(biāo)本 送檢軍團(tuán)菌培養(yǎng)、抗酸染色痰標(biāo)本、氣管吸出物和來(lái)自囊性纖維化患者的痰標(biāo)

4、本分析中下呼吸道標(biāo)本檢驗(yàn)接種接種 II級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行盡快處理挑取最膿或血色最淺標(biāo)本支氣管鏡標(biāo)本，做細(xì)菌定量培養(yǎng)的BAL和或PSB標(biāo)本切勿離心。涂片，革蘭染色標(biāo)本接種血平板、巧克力平板和麥康凱（或中國(guó)藍(lán)/伊紅美蘭）以下步驟可選擇一項(xiàng)或多項(xiàng)： 在接種后的巧克力平板上貼桿菌肽紙片（10IU），用于抑制上呼吸道微生物菌群，提高流血嗜血桿菌檢出率 用金葡ATCC25923點(diǎn)種接種后的血平板，便于直接觀察嗜血桿菌的衛(wèi)星現(xiàn)象 血平板的第二個(gè)1/4區(qū)貼奧普托辛(OP)紙片，可在原始平板上直接檢測(cè)抑制肺炎鏈球菌的生長(zhǎng)。不推薦常規(guī)使用，如有大量社區(qū)感染肺炎患者標(biāo)本時(shí)可考慮使用培養(yǎng)3537、5%CO2條件培養(yǎng)4

5、8h，最好至72h；侵入性方法采集的肺標(biāo)本，培養(yǎng)延長(zhǎng)至4天直接試驗(yàn)革蘭染色 注明細(xì)胞、細(xì)菌量以及評(píng)價(jià)結(jié)果 見(jiàn)表3膽汁溶菌試驗(yàn) 革蘭陽(yáng)性雙球菌表3 痰涂片革蘭染色結(jié)果解釋指征解釋每個(gè)低倍鏡視野發(fā)現(xiàn)10個(gè)鱗狀上皮細(xì)胞標(biāo)本含有唾液和上呼吸道分泌物，報(bào)告“10個(gè)扁平上皮細(xì)胞/低倍視野，提示標(biāo)本被唾液污染，將不再進(jìn)行培養(yǎng)”每低倍鏡視野發(fā)現(xiàn)10個(gè)扁平上皮細(xì)胞，大量多形核白細(xì)胞，存在肺泡巨噬細(xì)胞和柱狀上皮細(xì)胞提示是一個(gè)良好的深部痰標(biāo)本大量多形核白細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)菌彈性蛋白或膠原纖維提示感染Curschmanns螺旋纖維提示感染淀粉樣小體壞死白細(xì)胞提示感染粉色絮狀物提示呼吸道疾病治療產(chǎn)生的霧狀高滲水Charcot-

6、Leyden結(jié)晶提示過(guò)敏性肺曲霉病大量多形核白細(xì)胞，主要見(jiàn)革蘭陽(yáng)性球菌成對(duì)或成短鏈排列可疑肺炎鏈球菌。電話通知臨床醫(yī)生指征解釋大量多形核白細(xì)胞，主要見(jiàn)革蘭陽(yáng)性球菌成堆排列可疑金黃色葡萄球菌。電話通知臨床醫(yī)生大量多形核白細(xì)胞，主要見(jiàn)革蘭陰性雙球菌可疑卡他莫拉局限性肺炎菌。電話通知臨床醫(yī)生大量多形核白細(xì)胞，主要見(jiàn)小的革蘭陰性球桿菌可疑流感嗜血桿菌。電話通知臨床醫(yī)生大量多形核白細(xì)胞，主要見(jiàn)大而胖的革蘭陰性桿菌可疑克雷伯菌或其他腸桿菌科菌引起的肺炎大量多形核白細(xì)胞，大量小的革蘭陰性桿菌，球桿菌，革蘭陽(yáng)性球菌成鏈排列以及其他不同形態(tài)的細(xì)菌提示吸入性肺炎。這需要在報(bào)告中特別提示，因?yàn)榕囵B(yǎng)結(jié)果會(huì)顯示正常菌叢

7、生長(zhǎng)。電話通知臨床醫(yī)生出芽酵母樣孢子和假菌絲通常提示鵝口瘡或上呼吸道酵母菌感染，不是肺炎，僅當(dāng)其為主要所見(jiàn)菌時(shí)報(bào)告其他異常結(jié)構(gòu)，如真菌，分枝的革蘭陽(yáng)性絲狀桿菌或奇特形狀的細(xì)菌（可能抗生素治療的結(jié)果）請(qǐng)高級(jí)醫(yī)師進(jìn)行確認(rèn)，可能需要補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)如改良的抗酸染色培養(yǎng)結(jié)果檢查觀察24h后平板繼續(xù)培養(yǎng)平板2448h，為檢出霉菌、慢生長(zhǎng)菌、苛養(yǎng)的革蘭陰性桿菌如博德特菌屬革蘭染色結(jié)果解釋培養(yǎng)結(jié)果l炎性細(xì)胞和細(xì)菌來(lái)決定對(duì)培養(yǎng)物下一步處理l如培養(yǎng)與涂片不符，重新讀片l按照表4報(bào)告l鑒定以下有臨床意義的可疑致病菌，排除正常菌群常見(jiàn)呼吸道重要致病菌鏈球菌苛養(yǎng)革蘭陰性菌革蘭陰性雙球菌革蘭陰性桿菌葡萄球菌革蘭陽(yáng)性桿菌鏈球菌鏈

8、球菌Beta-溶血、觸酶陰性呈鏈狀或成對(duì)排列的球菌l化膿鏈球菌（PYR+）任何數(shù)量都要報(bào)告l患兒標(biāo)本患兒標(biāo)本檢查有小溶血環(huán)并鑒定B群-溶血鏈球菌，任何數(shù)量都要報(bào)告l優(yōu)勢(shì)菌時(shí)，有意義數(shù)量的Beta-溶血鏈球菌l不要報(bào)告不要報(bào)告小菌落的beta-溶血鏈球菌或F群鏈球菌，因?yàn)檫@些菌是上呼吸道正常菌群鏈球菌鏈球菌Alpha-溶血鏈球菌lOptochin敏感實(shí)驗(yàn)l膽汁溶菌實(shí)驗(yàn)（聯(lián)合上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定）藥敏實(shí)驗(yàn)，貼OP紙片確認(rèn)純度以檢查藥敏結(jié)果是否有污染苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌流感嗜血桿菌，衛(wèi)星現(xiàn)象，ALA實(shí)驗(yàn)確認(rèn)鑒定并作beta-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)。百日咳博德特菌 觸酶和尿素酶陽(yáng)性，培養(yǎng)48h出現(xiàn)肉

9、眼可見(jiàn)菌落巴斯德菌 吲哚和氧化酶陽(yáng)性，動(dòng)物口腔正常菌群侵蝕艾肯菌 上呼吸道正常菌群，無(wú)需鑒定革蘭陰性雙球菌革蘭陰性雙球菌卡他莫拉菌 G-雙球菌，氧化酶陽(yáng)性，血平板上可推動(dòng)，丁酸鹽試驗(yàn)陽(yáng)性淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌？ 需檢驗(yàn)并報(bào)告，不需做藥敏試驗(yàn)u當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到有意義數(shù)量時(shí)，即使不是優(yōu)勢(shì)菌，當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到有意義數(shù)量時(shí)，即使不是優(yōu)勢(shì)菌，也報(bào)告也報(bào)告（表（表4 4）在麥康凱或伊紅美蘭平板生長(zhǎng)良好的革蘭陰性桿菌在麥康凱或伊紅美蘭平板生長(zhǎng)良好的革蘭陰性桿菌革蘭陰性桿菌 鑒定和藥敏試驗(yàn)對(duì)于住院患者，不管是否有其他病原菌，檢查有意義數(shù)量的銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌、博克霍爾德菌和嗜麥芽菌u囊性纖維化患者標(biāo)本有特殊要求囊性

10、纖維化患者標(biāo)本操作規(guī)范菌名鑒定特殊處理絲狀真菌任何數(shù)量鑒定到種水平腸桿菌科優(yōu)勢(shì)菌做藥敏實(shí)驗(yàn)金黃色葡萄球菌任何數(shù)量做藥敏實(shí)驗(yàn)，做苯唑西林篩選流感嗜血桿菌優(yōu)勢(shì)菌做beta-內(nèi)酰胺實(shí)驗(yàn)肺炎鏈球菌優(yōu)勢(shì)菌用苯唑西林紙片做青霉素耐藥篩選。若需要做青霉素E-test銅綠假單胞菌，洋蔥克雷伯，其他非發(fā)酵菌任何數(shù)量做藥敏實(shí)驗(yàn)快速生長(zhǎng)分枝桿菌任何數(shù)量鑒定到種水平葡萄球菌葡萄球菌痰涂片顯示有優(yōu)勢(shì)的呈堆球菌并與白細(xì)胞相關(guān)，沒(méi)有其他致病菌時(shí)，鑒定有意義菌量的金黃色葡萄球菌住院患者，鑒定并作苯唑西林耐藥僅當(dāng)菌量達(dá)到90%純培養(yǎng)時(shí)，鑒定凝固酶陰性葡萄球菌，無(wú)需鑒定到種水平，無(wú)需做藥敏腸球菌腸球菌不要報(bào)告腸球菌，除非達(dá)到90

11、%純培養(yǎng) 很多革蘭陽(yáng)性球菌都是呼吸道正常菌群革蘭陽(yáng)性桿菌革蘭陽(yáng)性桿菌排除任何數(shù)量來(lái)自免疫抑制患者的奴卡菌和馬紅球菌（粘液樣并尿素酶陽(yáng)性） 馬、豬等動(dòng)物致病菌，可條件致病，可以導(dǎo)致免疫抑制患者的肺炎大芽孢革蘭陽(yáng)性菌，則需排除炭疽芽孢桿菌和臘樣芽孢桿菌快速尿素酶陽(yáng)性（假白喉棒狀桿菌），或標(biāo)本來(lái)自ICU插管患者時(shí)，鑒定大量?jī)?yōu)勢(shì)的棒狀桿菌其他革蘭陽(yáng)性桿菌不會(huì)引起肺炎，無(wú)需鑒定其他革蘭陽(yáng)性桿菌不會(huì)引起肺炎，無(wú)需鑒定霉菌霉菌念珠菌不能引起肺炎，除非腫瘤患者、肺移植患者或新生兒。酵母菌是口腔正常菌群。如果如果涂片時(shí)見(jiàn)到細(xì)菌但培養(yǎng)不生長(zhǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)，可能存在軍團(tuán)菌、百日咳博德特菌和分枝桿菌。表4 下呼吸道培養(yǎng)致

12、病菌報(bào)告指南表6 常見(jiàn)可疑菌落形態(tài)及快速經(jīng)典方法初步鑒定檢測(cè)病原菌檢驗(yàn)并報(bào)告化膿鏈球菌B群beta-溶血鏈球菌（兒童）博德特菌屬，特別是支氣管博德特菌奴卡菌新型隱球菌淋病奈瑟菌弗朗西斯吐拉菌（高致病菌）鼠疫耶爾森菌（高致病菌）炭疽芽孢桿菌（高致病菌）霉菌，排除腐生菌污染當(dāng)培養(yǎng)少量，涂片也見(jiàn)到時(shí)報(bào)告肺炎鏈球菌，報(bào)告藥敏流感嗜血桿菌，報(bào)告beta-內(nèi)酰胺酶當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到有意義數(shù)量時(shí)，即使不是優(yōu)勢(shì)菌，也報(bào)告卡他莫拉菌腦膜炎奈瑟菌只對(duì)住院患者報(bào)告：銅綠假單胞菌，報(bào)告藥敏嗜麥芽窄食單胞菌不動(dòng)桿菌，報(bào)告藥敏伯克霍德菌，報(bào)告藥敏檢測(cè)病原菌當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到有意義數(shù)量，并且是優(yōu)勢(shì)菌，特別是涂片提示多形核白細(xì)胞與培養(yǎng)一致，

13、報(bào)告金黃色葡萄球菌，報(bào)告藥敏B群beta-溶血鏈球菌（成人），C、G群?jiǎn)我恍螒B(tài)革蘭陰性桿菌（肺克）報(bào)告藥敏苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌，報(bào)告beta-內(nèi)酰胺酶尿素陽(yáng)性棒狀桿菌或來(lái)自ICU來(lái)自免疫抑制患者，馬紅球菌報(bào)告“腸道革蘭陰性桿菌”在麥康凱平板上生長(zhǎng)1種以上革蘭陰性桿菌，氧化酶陰性，吲哚陽(yáng)性，乳糖陽(yáng)性或蔓延生長(zhǎng)報(bào)告“非發(fā)酵革蘭陰性桿菌”在麥康凱平板上生長(zhǎng)1種以上革蘭陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，三糖鐵上不發(fā)酵葡萄糖報(bào)告“分離到上呼吸道細(xì)菌”，注如果只存在腸球菌和凝固酶陰性葡萄球菌（有或沒(méi)有酵母菌），報(bào)告“混合有革蘭陽(yáng)性微生物細(xì)菌，或如果90%是培養(yǎng)物，則做少量鑒定列出”草鏈和或非致病的奈瑟菌，類(lèi)白喉菌、凝固酶

14、陰性葡萄球菌、Rothia羅思氏菌、F群鏈球菌，厭氧菌，嗜血桿菌屬（非流感），艾肯菌，放線桿菌嗜二氧化碳菌，莫拉菌，腸球菌，酵母菌和有意義數(shù)量的金黃色葡萄球菌，革蘭陰性桿菌和腦膜炎奈瑟菌分析后下呼吸道標(biāo)本報(bào)告分析后報(bào)告結(jié)果l革蘭染色不要報(bào)告涂片中所見(jiàn)的少量菌（1/20視野）；如果未分離到涂片中所見(jiàn)細(xì)菌，在報(bào)告中注明。l如果任何平板上都沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，報(bào)告“無(wú)致病菌生長(zhǎng)或正常上呼吸道微生物”，注意抗生素抑制生長(zhǎng)l陽(yáng)性報(bào)告參照表4指南報(bào)告結(jié)果和藥敏；藥敏結(jié)果依據(jù)CLSIl結(jié)果解釋陽(yáng)性注意假陽(yáng)性（攜帶菌）；陰性不能排除感染局限性l常規(guī)培養(yǎng)方法不生長(zhǎng)l假陰性培養(yǎng)可能由正常菌群污染或事先使用了抗生素l假陽(yáng)性結(jié)果可能會(huì)對(duì)培養(yǎng)結(jié)果過(guò)度解釋參考文獻(xiàn) Susan E.Sharp, Ann Robinson and Michael Saubolle, etc.2004. Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbi