不同序貫的西妥昔單抗與化療藥物聯(lián)合對ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２細(xì)胞的增殖抑制作

1、不同序貫的西妥昔單抗與化療藥物聯(lián)合對和-細(xì)胞的增殖抑制作    【摘要】  觀察不同序貫的西妥昔單抗（）與化療藥物聯(lián)合對人肝癌細(xì)胞系和-的增殖抑制作用，并分析其意義。 【方法】濃度遞增的和表柔比星、奧沙利鉑、泰素、伊立替康四種化療藥物分別按照不同給藥序貫聯(lián)合作用于和-細(xì)胞，使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-檢測不同給藥序貫的藥物對和-細(xì)胞的增殖抑制作用，利用生物學(xué)軟件計算不同給藥序貫時和化療藥物的半數(shù)抑制濃度（）的變化，計算其作用的協(xié)同系數(shù)（）。 【結(jié)果】 和化療藥物聯(lián)用對和-細(xì)胞的增殖抑制作用受給藥序貫影響：先于化療藥物給藥，兩者的較單用時降低，但是值均大

2、于，兩者之間為拮抗效應(yīng)；后于化療藥物給藥，兩者的較單用時降低更為明顯，且值均小于，兩者之間具有較明顯的協(xié)同效應(yīng)。 【結(jié)論】與化療藥物聯(lián)用對肝癌細(xì)胞的增殖具有協(xié)同抑制作用，較佳的給藥序貫是化療藥物先于給藥，能獲得明顯的協(xié)同效應(yīng)，這有助于臨床用藥時降低藥物劑量，減少毒副作用。 【關(guān)鍵詞】  肝腫瘤 西妥昔單抗 聯(lián)合化療 表皮生長因子受體 ： 【】 - ， ， 【】 （ ） （ ）， （ ）， （ ） （ ） - ， - - ， 【】 - ， ， ， ， ， 【】 - ，   ： ； ； ； 原發(fā)性肝癌起病隱匿，出現(xiàn)癥狀后進(jìn)展迅速，患者就診時多已屆晚期失去手術(shù)根治機(jī)會，其總體年生

3、存率不足。對于局部進(jìn)展（肝內(nèi)播散或門靜脈癌栓）或合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期肝癌尚缺乏有效的治療手段。傳統(tǒng)的全身化療效果不理想，雖然所有上市的化療藥物都曾經(jīng)試用于肝癌的治療，但是客觀緩解率最多不超過。加之傳統(tǒng)的化療藥物往往具有選擇性差，毒性大等缺點，更限制了在肝癌患者中的應(yīng)用。隨著對各種細(xì)胞表面分子與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（ ，）在許多腫瘤細(xì)胞中，如肺癌、結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌等的細(xì)胞表面能檢測到異常的高表達(dá)，并常與惡性腫瘤的預(yù)后不良、早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、化療抗拒等直接相關(guān)-。西妥昔單抗（）是新近開發(fā)的靶向的單克隆抗體，在多種惡性腫瘤如頭頸部鱗癌、結(jié)直腸癌等的治療中，單用或

4、與傳統(tǒng)化療方案聯(lián)合，取得了令人鼓舞的效果-。已有研究提示肝癌組織和癌旁肝組織中存在的高表達(dá)，提示及其信號通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要的作用。目前國內(nèi)外對于靶向藥物與化療藥物聯(lián)合用于治療肝癌的報道極少，本研究通過觀察與化療藥物的不同給藥序貫對人肝癌細(xì)胞系和-的增殖抑制作用，探討其對肝癌細(xì)胞的化療增敏效果與給藥序貫的關(guān)系，為尋找優(yōu)化的治療序貫并進(jìn)一步運用于肝癌患者的臨床治療提供實驗依據(jù)。 材料與方法   藥品與試劑 西妥昔單抗（）購自德國默克公司，表柔比星（）購自美國輝瑞公司，奧沙利鉑（）購自法國賽諾菲安萬特公司，泰素（）購自美國施貴寶公司，伊立替康（）購自英國安萬特公司，-細(xì)胞計

5、數(shù)試劑盒（ -）購自日本同仁化學(xué)研究所， 培養(yǎng)液、新生小牛血清、含 青霉素和 鏈霉素的雙抗、胰酶溶液購自美國公司。為 的溶液，泰素為的溶液，表柔比星、奧沙利鉑、伊立替康為粉劑，以上藥物均使用為的溶液稀釋至目標(biāo)濃度。   細(xì)胞株及培養(yǎng)方法 人肝癌細(xì)胞株，-由中山大學(xué)腫瘤防治中心實驗研究部提供。細(xì)胞培養(yǎng)于含 新生小牛血清、青霉素和 鏈霉素的-培養(yǎng)液中，置于 、分壓為（體積百分?jǐn)?shù)）、濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 傳代次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。   體外-細(xì)胞增殖抑制實驗   細(xì)胞接種 取對數(shù)生長期的和-細(xì)胞，經(jīng) 胰酶溶液充分消化后分別使用含 新生小牛血清、 青霉素和

6、鏈霉素的-培養(yǎng)液稀釋成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為 × 個，-細(xì)胞密度為 × 個，接種于孔培養(yǎng)板，接種過程細(xì)胞懸液保持吹打和晃動使細(xì)胞分布盡量均勻。每孔加入細(xì)胞懸液 ，使每孔中細(xì)胞為個，-細(xì)胞為 個，空白對照孔加入 不含小牛血清的培養(yǎng)液，置于 、體積分?jǐn)?shù)的、濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ，使細(xì)胞貼壁生長后，更換新培養(yǎng)基。   藥物分組及加藥方法 實驗設(shè)空白對照組、細(xì)胞對照組、單藥處理組（、表柔比星、奧沙利鉑、泰素、伊立替康）；序貫處理組按照不同加藥序貫，又分為序貫處理組（化療藥物組）和序貫處理組（化療藥物組），每組中每一藥物濃度各設(shè)個復(fù)孔。 空白對照組在鋪孔時用 培養(yǎng)液代替細(xì)

7、胞懸液，細(xì)胞對照組和藥物處理組鋪孔時加入 的細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞貼壁后，更換新培養(yǎng)液。加藥時空白對照組加入 培養(yǎng)液；細(xì)胞對照組加入 培養(yǎng)液 的溶液（），單藥處理組加入 培養(yǎng)液、 藥物溶液，使每孔中液體終體積為 ；序貫處理組先加入 培養(yǎng)液和 的溶液，培養(yǎng) 后，小心倒出培養(yǎng)板內(nèi)液體，每孔內(nèi)加入 的溶液輕微振蕩洗去殘留于孔壁的藥物，重復(fù)次，加入 培養(yǎng)液和 的化療藥物，繼續(xù)培養(yǎng)；序貫處理組先加入 培養(yǎng)液和 的化療藥物培養(yǎng) ，照前法洗滌培養(yǎng)板去除殘留藥物后，加入 培養(yǎng)液和 的，繼續(xù)培養(yǎng) 。實驗藥物單用時選取個依次遞增的濃度處理細(xì)胞，濃度分別為（ ），表柔比星（ ）、奧沙利鉑（ ）、泰素（ ）、伊立替康（ ）

8、；序貫處理時，加入孔內(nèi)的兩藥濃度亦同時遞增，其濃度比例保持恒定。   實驗方法 單藥處理組經(jīng) 、化療藥物 作用后，序貫處理組按照不同序貫的 和化療藥物作用后，于培養(yǎng)板每孔內(nèi)加入 的-溶液， 下孵育 ，全自動酶標(biāo)儀以 和雙波長測定各孔吸光度（值），實驗重復(fù)進(jìn)行次，取次計算所得抑制率的均數(shù)輸入軟件計算結(jié)果。   計算方法  各組細(xì)胞存活率（）（該藥物處理組值空白對照組值）（細(xì)胞對照組值空白對照組值）×；細(xì)胞增殖抑制率（）該組細(xì)胞存活率；統(tǒng)計學(xué)處理根據(jù)等藥物協(xié)同作用中效原理，使用生物軟件計算作用 和化療藥物作用 對和-細(xì)胞的（ ，半數(shù)抑制濃度）及可信區(qū)間、不同

9、序貫聯(lián)用時和化療藥物的的變化、不同序貫聯(lián)用時實驗濃度的和化療藥物的（ ，協(xié)同系數(shù)）及可信區(qū)間以及和化療藥物在各自時的值。     結(jié) 果   單藥和化療藥物對和-細(xì)胞的作用 單獨應(yīng)用 和化療藥物 作用于和-細(xì)胞，計算得到各自的及其可信區(qū)間見表。   不同序貫的和化療藥物聯(lián)用對 和-細(xì)胞的和-細(xì)胞經(jīng)同樣的 和化療藥物作用，不同的給藥序貫，藥物的呈現(xiàn)不同的變化：序貫處理組內(nèi)各組藥物的較單用時有所降低（除聯(lián)用后對-的稍增大外）；序貫處理組內(nèi)各組藥物的均較單用時和序貫處理組明顯降低（表）。   不同序貫的和化療藥物對和-細(xì)胞的協(xié)同系

10、數(shù) 值是評價兩種藥物之間相互作用的指標(biāo)，特別是兩藥各自在時的值，是衡量其相互作用的性質(zhì)和強(qiáng)度的客觀指標(biāo)。結(jié)果表明：按照不同的給藥序貫聯(lián)合和化療藥物作用于和-細(xì)胞，無論是實驗選用的實際藥物濃度之間（圖），還是在各自的理論之間（表），序貫處理組中和化療藥物的值均大于，序貫處理組中和化療藥物的值均小于，說明先于化療藥物作用，雖然各自的均較單用時降低，但是值提示此時藥物之間是拮抗效應(yīng)；而化療藥物先于作用，則表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)。 討 論 是生長因子受體家族的重要成員之一，為原癌基因-（-）編碼的、含個氨基酸殘基、相對分子質(zhì)量 × 的跨膜受體蛋白。由膜外配體結(jié)合區(qū)域、跨膜轉(zhuǎn)換區(qū)域和具酪氨酸激酶

11、活性的胞內(nèi)效應(yīng)區(qū)域三部分組成，廣泛分布于多種人體正常細(xì)胞表面。在與其配體結(jié)合后可以參與細(xì)胞生長、增殖和凋亡等多種重要功能，在正常的細(xì)胞生理過程中發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用。在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞表面可以檢測到的異常高表達(dá)，并與腫瘤的多種惡性生物學(xué)特性：如預(yù)后不良、短期復(fù)發(fā)，特別是放化療抗拒等直接相關(guān)-。 是人鼠嵌合型的單克隆抗體，其主要的作用機(jī)制為：與配體競爭分子胞外部分的特殊結(jié)合位點，阻斷的激活，從而阻斷其下游一系列與細(xì)胞生長、增殖、抗凋亡相關(guān)的酶促級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。單用或與化療藥物組成聯(lián)合方案已在多種腫瘤如頭頸癌、肺癌、結(jié)腸癌的臨床治療中顯示了較好的療效，并成為第一個經(jīng)美國批準(zhǔn)用于已

12、發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期直腸癌患者治療的單克隆抗體藥物。 肝細(xì)胞肝癌對傳統(tǒng)的化療藥物不敏感，這使得晚期肝癌的治療成為臨床上的棘手問題。本研究中，我們選用作用機(jī)制不同的化療藥物（表柔比星、奧沙利鉑、泰素、伊立替康），按照不同的給藥序貫分別聯(lián)合作用于人肝癌細(xì)胞系和-。結(jié)果表明，序貫處理組中和化療藥物的值都較單用時降低，但是兩藥在各自時的值均大于；序貫處理組中的兩藥值較單用和序貫處理組更低，且兩藥在各自時的兩藥值均小于。根據(jù)等藥物量效原理（兩藥聯(lián)用時 為拮抗，為相加， 為協(xié)同，值越小，協(xié)同效應(yīng)越強(qiáng)），說明當(dāng)先于化療藥物給藥時，兩者之間為拮抗效應(yīng)，而同樣的兩藥聯(lián)合，給藥序貫變?yōu)榛熕幬锵扔诮o藥時，兩者產(chǎn)生了明顯

13、的協(xié)同效應(yīng)。由于本實驗選用的四種化療藥物作用機(jī)制不同且相互間無交叉，說明這一現(xiàn)象并非與特定種類的化療藥物聯(lián)用時出現(xiàn)，而是具有較為普遍的意義。 國外學(xué)者的實驗也有類似的結(jié)果，如等將和泰素、順鉑、卡鉑聯(lián)合作用于人食管鱗癌細(xì)胞；等，將和奧沙利鉑、伊立替康聯(lián)合作用人結(jié)腸癌細(xì)胞-和等。這些研究表明，靶向藥物與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合時，必須按照一定的序貫（即化療藥物先于靶向藥物給藥），才能取得較為明顯的協(xié)同效應(yīng)。分析這一現(xiàn)象的原因，可能是經(jīng)過靶向藥物作用后的腫瘤細(xì)胞，其增殖速度變慢，細(xì)胞周期停滯，從而對化療藥物的敏感性下降；而先經(jīng)過化療藥物作用后的腫瘤細(xì)胞，其受到不同程度的損傷，對隨后的靶向藥物阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生的細(xì)胞功能損害耐受力下降，細(xì)胞壞死或凋亡進(jìn)一步增加。 以上結(jié)果證實：與化療藥物聯(lián)用對肝癌細(xì)胞的增殖具有協(xié)同抑制作用，較佳的給藥序貫應(yīng)是化療藥物先于給藥，能獲得明顯的協(xié)同效應(yīng)，有助于臨床用藥時降低藥物劑量，減少毒副作用，這也為進(jìn)一步的肝癌動物模型和人體臨床實驗提供了新的思路和理論參考。 【參考文獻(xiàn)】  湯釗猷 肝癌診治現(xiàn)狀與前景 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志， ，（）： ， ， ， ： -， ，