杏鮑菇胞外多糖液體發(fā)酵條件優(yōu)化 2

1、杏鮑菇胞外多糖液體發(fā)酵條件優(yōu)化摘要 杏鮑菇是一種品質(zhì)優(yōu)良的名貴珍稀食用菌，有很高的營養(yǎng)和食用價值，其營養(yǎng)成分豐富，多糖含量在食用菌中位于前列。相關(guān)研究已經(jīng)證明杏鮑菇多糖具有降血脂等生物功能，因此通過液體發(fā)酵獲得較高的杏鮑菇胞外多糖產(chǎn)量具有實(shí)際意義。本研究以杏鮑菇菌絲體為實(shí)驗(yàn)對象，通過五個單因子實(shí)驗(yàn)確定杏鮑菇菌絲體發(fā)酵獲得胞外多糖產(chǎn)量最高的培養(yǎng)基組分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示最佳碳源、氮源、無機(jī)離子、pH值和培養(yǎng)時間，依次分別為半乳糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、6.0和9天。在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本文通過四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)得到杏鮑菇胞外多糖產(chǎn)率最高的培養(yǎng)基配方應(yīng)為半乳糖 30 g/L，蛋白胨 5 g/L，磷酸

2、二氫鉀 3 g/L且初始pH調(diào)節(jié)至6.0，按照上述條件可得到的杏鮑菇胞外多糖得率為 5.92±0.84 g/L。關(guān)鍵詞 杏鮑菇；胞外多糖；培養(yǎng)基優(yōu)化Abstract Pleurotus eryngii is a kind of rare and precious fungus which has high nutritional and edible value. Further more, it is rich in polysaccharide content, which has been proved recently to have lipid-lowering power

3、 in blood. Therefore, the study of fluid medium optimization of P. eryngii for the improvement of the production of extracellular polysaccharide is full of practical significance. In this study, we treat mycelium as experimental subject, and carry out five single factor experiments to find out the b

4、est medium components, which are galactose as the best carbon source, peptone as the best nitrogen source, potassium dihydrogen phosphate as the best inorganic ions, 6.0 as the most suitable pH value and 9 days as the incubation time. Based on the single factor experiments, we proceed to an orthogon

5、al experimental design which has four factors and three levels of each factor, and through this experiment we find out the optimal medium for the largest production of P. eryngii extracellular polysaccharide, which is galactose 30g/L, peptone 5g/L, potassium dihydrogen phosphate 3g/L and the initial

6、 pH value should be adjusted to 6.0. Under such conditions, the ratio of production of P. eryngii extracellular polysaccharide is 5.92±0.84g per liter of fermentation liquor.Keywords Pleurotus eryngii；extracellular polysaccharides；fluid medium optimization目錄1 引言12 材料與方法32.1 主要材料與試劑32.1.1 生物材料32

7、.1.2 試劑32.1.3 培養(yǎng)基32.2 主要設(shè)備32.3 試驗(yàn)方法32.3.1 菌種活化32.3.2 碳源單因子實(shí)驗(yàn)42.3.3 氮源單因子實(shí)驗(yàn)42.3.4 無機(jī)離子單因子實(shí)驗(yàn)42.3.5 pH值單因子實(shí)驗(yàn)42.3.6 培養(yǎng)時間單因子實(shí)驗(yàn)42.3.7 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)42.3.8 杏鮑菇菌絲體生物量測定42.3.9 杏鮑菇胞外多糖的提取及定量53 結(jié)果與討論63.1 單因子實(shí)驗(yàn)63.1.1 碳源單因子實(shí)驗(yàn)63.1.2 氮源單因子實(shí)驗(yàn)73.1.3 無機(jī)離子單因子實(shí)驗(yàn)93.1.4 pH值單因子實(shí)驗(yàn)103.1.5 培養(yǎng)時間單因子實(shí)驗(yàn)113.2 正交試驗(yàn)134 結(jié)論14致謝15附錄16畢業(yè)

8、論文相關(guān)外文文獻(xiàn)翻譯16參考文獻(xiàn)191 引言食用菌是一類可供食用的具有子實(shí)體的大型真菌，過去被稱為“山珍”，被譽(yù)為最理想的保健食品。其中絕大多數(shù)屬于擔(dān)子菌類，少數(shù)屬于子囊菌。全球可食用的真菌有2000多種。我國目前能進(jìn)行人工栽培的食用菌有80多種，其中可進(jìn)行商業(yè)化栽培的僅30余種1。本文所關(guān)注的杏鮑菇（學(xué)名：Pleurotus eryngii），又稱刺芹菇、刺芹側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina），層菌綱(Hymenomycetes)，無隔擔(dān)子菌亞綱(Homobasidiomycetidae)，傘菌目(Agaricales)，側(cè)耳科(Pleurotaceae)，側(cè)耳屬(Pl

9、eurotus)。杏鮑菇屬于側(cè)耳屬的最大一個種。杏鮑菇的名字源于其菌肉肥厚、營養(yǎng)豐富，具有杏仁的香氣和鮑魚的口感，是一種品質(zhì)上佳的名貴珍稀食用菌2。杏鮑菇原產(chǎn)于歐洲地中海區(qū)域、中東和北非，但也在亞洲部分地區(qū)生長。1974年，Cailleux 用菌褶分離法獲得杏鮑菇菌株并試栽成功。三年后，F(xiàn)erri首先進(jìn)行了商業(yè)性栽培的嘗試。目前國內(nèi)栽培的杏鮑菇多是上世紀(jì)九十年代后從歐洲引進(jìn)的。杏鮑菇菌絲白色，初期纖細(xì)，逐漸濃密蔓延。子實(shí)體單生或簇生，菌蓋直徑213厘米，初圓形，后變平，菌蓋中央稍下凹，成熟時成漏斗狀，表面干燥，灰褐色，菌蓋邊緣稍內(nèi)卷，菌肉白色，具杏仁味，菌褶乳白色，延生，菌柄長515厘米，多偏

10、生或側(cè)生，也有中生，粗壯、先端細(xì)，中實(shí)，無菌環(huán)，孢子橢圓至紡錘形。杏鮑菇的營養(yǎng)價值極高。氨基酸種類齊全，必需氨基酸所占比例高，特別是普通膳食中缺乏的賴氨酸、精氨酸含量豐富，同時鈣、鎂、鉀、磷等無機(jī)元素含量也相當(dāng)豐富，而脂肪含量偏低，因寡糖含量豐富，與雙歧桿菌共用，具有整腸美容的效果，是一種理想的保健食品，早已受到國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。杏鮑菇是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向各國推薦的食用菌品種，被列為21世紀(jì)最具開發(fā)潛力的十種食用菌之一。本文對于胞外多糖的關(guān)注，順應(yīng)了多年來糖生物學(xué)的迅猛發(fā)展3。糖類是地球生物不可缺少的化學(xué)物質(zhì)，其最簡單的形式成為生物體賴以生存的主要能源，但其最主要的生物學(xué)功能則是以糖復(fù)合物或者

11、多糖的形式出現(xiàn)的4。1988年牛津大學(xué)德威克教授在當(dāng)年的生化年評雜志中撰寫了以“糖生物學(xué)”為題的綜述，這標(biāo)志了糖生物學(xué)這一新的分支學(xué)科的誕生。糖生物學(xué)是糖的化學(xué)和生物學(xué)研究相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興學(xué)科，主要研究糖綴合物糖鏈的結(jié)構(gòu)、生物合成和生物學(xué)功能，其研究領(lǐng)域包括糖化學(xué)、糖鏈生物合成、糖鏈在復(fù)雜生物系統(tǒng)中的功能和糖鏈操作技術(shù)等5。近幾十年來，隨著糖化學(xué)、糖生物學(xué)、糖工程學(xué)、分子生物學(xué)及現(xiàn)代分析技術(shù)的建立和發(fā)展，針對多糖的研究方法和技術(shù)有了長足的進(jìn)步。人們逐步認(rèn)識到多糖物質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能，涉及到有機(jī)體生命活動的整個時空序列，如：受精、著床、分化、發(fā)育、免疫、感染、癌變和衰老等6。20世紀(jì)9

12、0年代以來，多種新方法、新技術(shù)被應(yīng)用于多糖物質(zhì)的研究中，一些不同生理活性的多糖物質(zhì)被分離、純化和鑒定，部分研究成果所形成的產(chǎn)品已投放市場，并顯示出良好的經(jīng)濟(jì)效益2?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，杏鮑菇中所含的真菌多糖能增強(qiáng)肌體免疫功能7，具有抗病毒，降低機(jī)體膽固醇含量，防止動脈硬化等功能8。在杏鮑菇多糖的生物活性方面，也開展了較為深入的研究9, 10。楊立紅11等以杏鮑菇子實(shí)體為材料，分離純化了杏鮑菇多糖，并利用MDA(丙二醛)、GSHOPX(谷胱甘肽過氧化物酶)活力、血清GBT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)活力、GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)活力、GK(肌酸激酶)活力等指標(biāo)研究杏鮑菇多糖對力竭小鼠自由基代謝及心肌、肝臟、骨骼肌

13、損傷的影響，以觀察杏鮑菇多糖抗氧化、抗損傷功效12。張俊會13等研究報道了杏鮑菇發(fā)酵多糖對亞油酸、菜油氧化以及離體肝臟組織的脂質(zhì)過氧化均有一定抑制作用。本文所涉及的發(fā)酵技術(shù)為液體發(fā)酵14，液體發(fā)酵是食藥用菌液體培養(yǎng)的一種，它是將菌種培養(yǎng)在發(fā)酵罐或錐形瓶內(nèi)，通過不斷通氣攪拌或振蕩，使菌體在液體深層處繁育的方法15。通過液體深層培養(yǎng)即發(fā)酵的方式生產(chǎn)食用菌菌球，作為食用菌栽培的種子或作為有效成分提取分離及深加工的原料。液體發(fā)酵技術(shù)屬于現(xiàn)代生物技術(shù)之一，它比傳統(tǒng)的食(藥)用真菌栽培生產(chǎn)技術(shù)具有明顯的優(yōu)越性：周期短、成本低、產(chǎn)量大，且有工廠化生產(chǎn)前景16。本實(shí)驗(yàn)立足于杏鮑菇卓越的保健功效和正在不斷發(fā)現(xiàn)中

14、的各種生物學(xué)活性，著眼于杏鮑菇液體發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖產(chǎn)量，通過單因子實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)的組合，以期篩選出杏鮑菇液體發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量最高的碳氮源、無機(jī)離子和酸堿度的組合17。該試驗(yàn)的結(jié)果將對食用菌來源的抗氧化、降血脂等保健產(chǎn)品的生產(chǎn)、開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義，為杏鮑菇多糖衍生食品和藥物開發(fā)提供前期的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，令杏鮑菇及其多糖產(chǎn)品為人類的健康做出更大的貢獻(xiàn)，產(chǎn)生更多的經(jīng)濟(jì)效益。2 材料與方法2.1 主要材料與試劑2.1.1 生物材料杏鮑菇菌種：購自江蘇省農(nóng)科院。2.1.2 試劑2.1.2.1 供試碳源D-木糖，D-果糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，半乳糖，鼠李糖，乳糖，麥芽糖，蔗糖，D-

15、甘露醇，可溶性淀粉，D-山梨醇，糊精。2.1.2.2 供試氮源蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，硫酸銨，尿素，胰胨，醋酸銨。2.1.2.3 供試無機(jī)離子七水合硫酸，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，氯化鉀，氯化鈣。2.1.2.4 其他鹽酸，氫氧化鈉，無水乙醇。2.1.3 培養(yǎng)基2.1.3.1 菌種保藏培養(yǎng)基：PDA斜面培養(yǎng)基馬鈴薯 20%，葡萄糖 2%，瓊脂 2%，pH 自然。2.1.3.2 種子培養(yǎng)基：商品PDA培養(yǎng)基稱量出商品PDA培養(yǎng)基粉末46.0g（配方：馬鈴薯粉 6 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂20 g/L，pH 5.6±0.2），加入 1000ml 蒸餾水中，115高壓滅菌20分鐘

16、。2.1.3.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 30 g/L，酵母提取物 5 g/L，蛋白胨 2 g/L，磷酸二氫鉀 1 g/L，七水合硫酸鎂 1 g/L，pH 自然。2.2 主要設(shè)備HYG-A全溫?fù)u床柜，無菌操作臺，恒溫磁力攪拌器，立式蒸汽滅菌器，電子分析天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52，循環(huán)水真空泵，酸度計，冰箱，微波爐，超聲波清洗器，電子天平。2.3 試驗(yàn)方法2.3.1 菌種活化將保藏于斜面PDA培養(yǎng)基上的菌種轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基上，25培養(yǎng)9天或至長滿培養(yǎng)基。選擇菌絲生長最為旺盛的平板備用。2.3.2 碳源單因子實(shí)驗(yàn)分別用D-木糖，D-果糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，半乳糖，鼠李糖，乳糖，麥

17、芽糖，蔗糖，D-甘露醇，可溶性淀粉，D-山梨醇，糊精替代液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的等量碳源，其余成分保持不變，制成碳源單因子實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，每一配方有三次生物重復(fù)。每150 ml錐形瓶裝入50 ml培養(yǎng)基，接種量10%，于25 ，150 r/min培養(yǎng)九天，最后測其生物量和胞外多糖含量。2.3.3 氮源單因子實(shí)驗(yàn)分別用蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，硫酸銨，尿素，胰胨，醋酸銨替代液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的等量氮源，其余成分保持不變，制成氮源單因子實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，每一配方有三次生物重復(fù)。每150 ml錐形瓶裝入50 ml培養(yǎng)基，接種量10%，于25 ，150 r/min培養(yǎng)九天，最后測其生物量和胞外多糖含量。2.3.4 無

18、機(jī)離子單因子實(shí)驗(yàn)分別用七水合硫酸，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，氯化鉀，氯化鈣替代液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的等量無機(jī)離子，其余成分保持不變，制成無機(jī)離子單因子實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，每一配方有三次生物重復(fù)。每150 ml錐形瓶裝入50 ml培養(yǎng)基，接種量10%，于25 ，150 r/min培養(yǎng)九天，最后測其生物量和胞外多糖含量。2.3.5 pH值單因子實(shí)驗(yàn)采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，將pH值分別調(diào)至5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、7.0 ，誤差不超過0.1，制成pH值單因子實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，每一配方有三次生物重復(fù)。每150 ml錐形瓶裝入50 ml培養(yǎng)基，接種量10%，于25 ，150 r/min培養(yǎng)九天，最后測其生物量和胞

19、外多糖含量。2.3.6 培養(yǎng)時間單因子實(shí)驗(yàn)采用采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)時間依次設(shè)置為7、8、9、10、11、12天，制成培養(yǎng)時間單因子實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，每一配方有三次生物重復(fù)。每150 ml錐形瓶裝入50 ml培養(yǎng)基，接種量10%，于25 ，150 r/min培養(yǎng)九天，最后測其生物量和胞外多糖含量。2.3.7 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)利用單因子實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)碳源、氮源、無機(jī)離子和起始ph值四個因素，各取三個水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)時間為九天。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計見表2-1。表2-1 正交試驗(yàn)設(shè)計方案A：碳源B：氮源C:無機(jī)離子D：起始pH值水平125g/L5g/L1g/L5.5水平230g/L7g/L

20、2g/L6水平335g/L9g/L3g/L6.52.3.8 杏鮑菇菌絲體生物量測定培養(yǎng)九天的發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾，并用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體，置于60攝氏度恒溫烘箱中烘干至恒重，稱重。生物量的計算依照如下公式：菌絲生物量（mg/L）=菌絲體干重（mg） / 發(fā)酵液體積（ml） * 10002.3.9 杏鮑菇胞外多糖的提取及定量本實(shí)驗(yàn)采用醇沉法提取杏鮑菇胞外多糖，具體的技術(shù)路線為：發(fā)酵液過濾菌絲體利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的20%緩慢加入無水乙醇至原體積，即終體積分?jǐn)?shù)為80%四攝氏度下冰箱冷藏過夜離心棄去上清液將沉淀置于烘箱內(nèi)干燥至恒重得到醇沉粗多糖。多糖提取率的計算依照如下公式：多糖提取率（mg/L

21、） = 粗多糖干重（mg） / 發(fā)酵液體積（ml） * 10003 結(jié)果與討論食用菌液體發(fā)酵的技術(shù)關(guān)鍵在于培養(yǎng)基的選取，不同的菌種對于培養(yǎng)基的需求均有差異。本文通過單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)，以期得到胞外多糖產(chǎn)量最高的杏鮑菇液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方。3.1 單因子實(shí)驗(yàn)3.1.1 碳源單因子實(shí)驗(yàn)碳源單因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-1，表中分別顯示了其生物量和多糖提取率。不同碳源對于菌絲體質(zhì)量和多糖產(chǎn)量的影響如條形圖3-1與3-2。在選取被試碳源時，我們考慮到了不同類別的糖類對于胞外多糖產(chǎn)量的影響。其中包含有單糖（D-木糖，D-果糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，半乳糖，鼠李糖），二糖（乳糖，麥芽糖，蔗

22、糖），多糖（可溶性淀粉，糊精）以及糖醇（D-甘露醇，D-山梨醇）。在單糖中，最適碳源是半乳糖。二糖中，多糖產(chǎn)量最高的碳源是乳糖。多糖明顯更利于真菌菌絲體的生長而不是產(chǎn)生胞外多糖。糖醇類則在菌絲體生長和產(chǎn)多糖兩方面都不具有明顯的優(yōu)勢。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)著眼于培養(yǎng)基各元素對于胞外多糖產(chǎn)量的影響，所以首要關(guān)注的是能提高胞外多糖產(chǎn)量的碳源。從碳源單因子實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看來，杏鮑菇胞外多糖得率最高的是半乳糖，其次是葡萄糖，再次是乳糖。以半乳糖作為碳源，多糖得率較葡萄糖高出12%，較乳糖高出17%。因此在后續(xù)試驗(yàn)中，半乳糖將作為最佳碳源加入培養(yǎng)基。表3-1. 不同碳源對于杏鮑菇菌絲體生物量及多糖得率的影響碳源菌絲生物量

23、 mg/L多糖得率 mg/L半乳糖7054±12.58 2466.67±15.28 D-葡萄糖7102±35.78 2200±17.32 乳糖7049±2.29 2100±10.00 鼠李糖6316±6.79 1900±35.36 D-山梨醇7832±54.31 1900±21.21 麥芽糖7025±21.99 1666.67±28.87 L-阿拉伯糖5899±11.50 1600±10.00 D-甘露糖6884±14.11 1533.33

24、77;5.77 D-木糖5339±3.41 1450±9.57 蔗糖8067±29.30 1333.33±5.77 D-果糖7777±21.91 1200±10.00 D-甘露醇7900±10.591000±12.50可溶性淀粉9867±123.39 200±23.40 圖3-1. 不同碳源對于杏鮑菇菌絲體質(zhì)量的影響圖3-2. 不同碳源對于杏鮑菇胞外多糖產(chǎn)量的影響3.1.2 氮源單因子實(shí)驗(yàn)氮源單因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-2，表中分別顯示了其生物量和多糖提取率。不同氮源對于菌絲體質(zhì)量和多糖產(chǎn)量的影響如

25、條形圖3-3與3-4。供試氮源有無機(jī)氮源（硫酸銨，醋酸銨）和復(fù)雜有機(jī)氮源（蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，尿素，胰胨）。結(jié)果顯示無機(jī)氮源無法促進(jìn)菌絲體良好地生長，有機(jī)氮源在菌絲體生長方面普遍效果顯著，尤其是酵母提取物和牛肉膏。但在胞外多糖的獲得率方面，有機(jī)氮源蛋白胨的效果顯然要更加理想，其多糖的得率顯然要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后面幾種備選的氮源。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，蛋白胨將作為最佳氮源加入培養(yǎng)基。表3-2. 不同氮源對于杏鮑菇菌絲體生物量及多糖得率的影響氮源菌絲生物量 mg/L多糖得率 mg/L蛋白胨6377±9.09 2243.5±8.11 牛肉膏11331±50.72 2100

26、±21.68 酵母提取物11573±20.86 1710±16.55 胰胨4188±11.88 1412.67±34.55 尿素5269±3.90 771±6.05 醋酸銨2817±6.89 734.5±7.55 硫酸銨5355±7.92 760±46.16 圖3-3. 不同氮源對于杏鮑菇菌絲體質(zhì)量的影響圖3-4. 不同氮源對于杏鮑菇胞外多糖產(chǎn)量的影響3.1.3 無機(jī)離子單因子實(shí)驗(yàn)無機(jī)離子單因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-3，表中分別顯示了其生物量和多糖提取率。不同無機(jī)離子對于菌絲體質(zhì)量和多糖產(chǎn)

27、量的影響如條形圖3-5與3-6。在無機(jī)離子的單因子實(shí)驗(yàn)中我們主要考慮了大量元素，而痕量元素因?yàn)樵谝后w藥瓶中一般不添加而不在考慮范圍之內(nèi)。大量元素中，我們挑選了鎂離子、鉀離子和鈣離子所謂主要的被試離子，其中鉀離子考慮了其三種主要出現(xiàn)在培養(yǎng)基中的形式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鈣離子顯然最有利于菌絲體的生長，這與在大多數(shù)的真菌生長過程中鈣離子都與菌絲體延長的生理過程有關(guān)。但在多糖產(chǎn)率方面，鉀離子的效果明顯好于其他兩個被試離子。其中又以KH2PO3的效果最為卓著，其多糖得率較次佳無機(jī)離子K2HPO3高16.3%，比鎂離子和鈣離子分別高172.5%和203.3%。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，KH2PO3將作為最佳無機(jī)離子

28、加入培養(yǎng)基。表3-3. 不同無機(jī)離子對于杏鮑菇菌絲體生物量及多糖得率的影響無機(jī)離子菌絲生物量 g/L多糖得率 mg/LMgSO4·7H2O3794±39.88 2099.00 ±29.20 K2HPO34077±5.77 4918.67 ±17.83 KH2PO33264±13.69 5720.67 ±8.89 CaCl24678±17.68 1886.00 ±14.99 KCl3551±7.30 940.67 ±15.81 Control3813±10.55 558.67

29、±5.09 圖3-5. 不同無機(jī)離子對于杏鮑菇菌絲體質(zhì)量的影響圖3-1. 不同無機(jī)離子對于杏鮑菇胞外多糖產(chǎn)量的影響3.1.4 pH值單因子實(shí)驗(yàn)pH值單因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-4，表中分別顯示了其生物量和多糖提取率。不同pH值對于菌絲體質(zhì)量和多糖產(chǎn)量的影響如條形圖3-7與3-8?？梢钥闯鲂吁U菇的菌絲體基本上對于pH值并不十分敏感，生物量和多糖得率在不同pH條件下相差并不顯著，但是仍可以清晰地看出pH為6.0時，菌絲體生長地更好，且多糖得率也是最高的。因此，在正交試驗(yàn)中，我們將以pH6.0為基準(zhǔn)，看這一條件與其他條件是否能契合。表3-4. 不同pH值對于杏鮑菇菌絲體生物量及多糖得率的影響p

30、H值菌絲生物量 g/L多糖得率 mg/L5.0 7791±12.06 3800±10.00 5.5 7315±13.29 4066.67±11.55 6.0 9079±54.09 4400±0.00 6.5 8138±29.83 4000±25.82 7.0 8920±48.32 3333.33±102.14 圖3-6. 不同pH值對于杏鮑菇菌絲體質(zhì)量的影響圖3-7. 不同pH值對于杏鮑菇胞外多糖產(chǎn)量的影響3.1.5 培養(yǎng)時間單因子實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時間單因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-5，表中分別顯示了其生物量和

31、多糖提取率。不同培養(yǎng)時間對于菌絲體質(zhì)量和多糖產(chǎn)量的影響如條形圖3-9與3-10。有條形圖可以明顯的看出，對于菌絲體生長而言，11天是最合適的長度，過長的時間可能導(dǎo)致菌絲體快速老化，果斷的時間菌絲體還有繼續(xù)生長的潛力和空間。但對于多糖得率而言則并不盡然，第七天就已經(jīng)出現(xiàn)的高峰可以解釋為原來培養(yǎng)基中的糖尚未得到完全的消耗，因此糖含量非常高。而在第八點(diǎn)的拐點(diǎn)之后，我們看到9、10兩天的多糖產(chǎn)量相近且均高于之前與之后的時間。因此，從節(jié)約發(fā)酵時間的角度出發(fā)，在第九天與第十天多糖產(chǎn)量相差不大的情況下，我們認(rèn)為最優(yōu)的培養(yǎng)時間是九天。表3-5. 不同培養(yǎng)時間對于杏鮑菇菌絲體生物量及多糖得率的影響培養(yǎng)時間菌絲生

32、物量 g/L多糖得率 mg/L73809±11.37 2400±24.86 84351±12.33 2196.67±4.21 94039±21.68 2317.33±8.69 105709±22.59 2322.67±20.45 116398±43.98 1925.33±29.26 122893±31.90 1800±20.00 圖3-8. 不同培養(yǎng)時間對于杏鮑菇菌絲體質(zhì)量的影響圖3-9. 不同培養(yǎng)時間對于杏鮑菇胞外多糖產(chǎn)量的影響3.2 正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)(Orthogonal

33、 experiment)是研究多因素多水平的又一種設(shè)計方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)。正交試驗(yàn)是分析因式設(shè)計的主要方，是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法18。正交試驗(yàn)的設(shè)計主要依據(jù)正交表。所謂正交表，也就是一套經(jīng)過周密計算得出的現(xiàn)成的實(shí)驗(yàn)方案，這套方案的總實(shí)驗(yàn)次數(shù)是遠(yuǎn)小于每種情況都考慮后的實(shí)驗(yàn)次數(shù)的。比如3水平4因素表就只有9行，即需要九次實(shí)驗(yàn)，遠(yuǎn)小于遍歷試驗(yàn)的81次；同理可推算出因素水平越多，試驗(yàn)的精簡程度會越高。本實(shí)驗(yàn)采取了四因素三水平的正交試驗(yàn)方案，四因素分別設(shè)置為碳源、氮源、無機(jī)離子和pH值。其中，

34、前三者分別采用之前的單因子實(shí)驗(yàn)所得到的最優(yōu)碳源、氮源和無機(jī)離子，依次為半乳糖、蛋白胨和磷酸二氫鉀，而pH值則依據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，分別加減0.5設(shè)置水平。正交試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)分析如下表所示：表3-6. 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析表序號半乳糖 g/L蛋白胨 g/L磷酸二氫鉀 g/LpH胞外多糖質(zhì)量 g/LA25515.5 0.81 ± 0.17B25726.0 1.15 ± 0.30C25936.5 1.14 ± 0.03D30526.5 1.69 ± 0.22E30735.5 1.67 ± 0.45F30916.0 0.96 ± 0.29G

35、35536.0 5.92 ± 0.84H35716.5 2.45 ± 0.46I35925.5 4.04 ± 0.33K13.10 ± 0.50 8.42 ± 1.234.22 ± 0.926.52 ± 0.95 K24.32 ± 0.96 5.27 ± 1.216.88 ± 0.858.03 ± 1.43 K312.41 ± 1.63 6.14 ± 0.658.73 ± 1.325.28 ± 0.71 k11.03 ± 0.172.8

36、1 ± 0.411.41 ± 0.312.17 ± 0.32 k21.44 ± 0.32 1.76 ± 0.402.29 ± 0.282.68 ± 0.48 k34.14 ± 0.54 2.05 ± 0.222.91 ± 0.441.76 ± 0.24 R3.11 ± 0.371.05 ± 0.011.50 ± 0.130.92 ± 0.24最佳水平35536.0 上表中，K1，K2，K3分別為所在元素在三個水平上得到的多糖得率之和，k1，k2，

37、k3則為所在列元素的多糖得率的平均值，R值為平均值的極差。依據(jù)該正交試驗(yàn)結(jié)果表，由R值的變化可知四個因素的影響從大到小依次為A（碳源，半乳糖）>C（無機(jī)離子，磷酸二氫鉀）>B（氮源，蛋白胨）>pH。依據(jù)三個平均值的變化，可以得到最佳的條件組合為A3B1C3D2，也即在半乳糖濃度為30g/L，蛋白胨濃度為5g/L，磷酸二氫鉀濃度為3g/L且初始pH調(diào)節(jié)至6.0時，杏鮑菇胞外多糖的產(chǎn)量最大，得率最高。4 結(jié)論本文以杏鮑菇菌絲體為實(shí)驗(yàn)對象，通過單因子實(shí)驗(yàn)確定杏鮑菇菌絲體發(fā)酵獲得胞外多糖產(chǎn)量最高的碳源、氮源、無機(jī)離子、pH值和培養(yǎng)時間，分別為半乳糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、6.0和9天。

38、在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本文通過正交實(shí)驗(yàn)得到杏鮑菇胞外多糖產(chǎn)率最高的培養(yǎng)基配方應(yīng)為半乳糖 30 g/L，蛋白胨 5 g/L，磷酸二氫鉀 3 g/L且初始pH調(diào)節(jié)至6.0，按照上述條件可得到的杏鮑菇胞外多糖得率為 5.92±0.84 g/L。附錄畢業(yè)論文相關(guān)外文文獻(xiàn)翻譯碳源、氮源和無機(jī)離子對于Psathyerella atroumbonata(Pegler)，一種尼日利亞食用真菌，生長的影響17摘要：我們研究了簡單有機(jī)物、無機(jī)物和復(fù)雜組分對于Psathyerella atroumbonata(Pegler)，一種尼日利亞食用真菌，生長的影響。我們使用了多種碳源，其中葡萄糖對于菌體的生長有

39、最佳的刺激作用，其余依次是甘露糖、纖維素和甘露糖醇。山梨糖和肌醇對于生長的效力最小。在所檢測的氮源中，酵母提取物是最有效的，緊接著是麥芽提取物和L-色氨酸，硝酸鈉和硫酸銨則是效果最差的。最佳的碳氮比是2:3，最差的碳氮比是5:1。最佳的大量元素是鈣離子和鎂離子，最佳的微量元素則是銅和鋅。1.簡介Psathyerella atroumbonata(Pegler)是一種可食用真菌，屬于擔(dān)子菌門傘菌目鬼傘科(Alexopolous, Mims & Blackwell, 1996; Makinen, 1977; Zoberi, 1972)。這種真菌在自然界中廣泛分布。在熱帶和亞熱帶地區(qū)的森林落

40、葉、土壤和倒木上都有發(fā)現(xiàn) (Pegler, 1977; Nicholson, 1996)。對于Yoruba人和尼日利亞很多其他部落來說，Psathyerella atroumbonata都是一種極好的食物來源(Makinen, 1977; Oso, 1977a; Alofe, Odu & Illoh, 1998 )。然而，由于它的擔(dān)子果不那么引人注目(Zoberi, 1972)，人們常常會忽略它。而在它廣泛生長的地方，那些知道它的價值的人則常常為了它起爭執(zhí)。尼日利亞人通常是靠它季節(jié)性的出現(xiàn)而食用之，而這并不是很規(guī)律的。盡管一些尼日利亞蘑菇的食用和潛在藥用價值得到了一定的關(guān)注(Oso,

41、1977b)，但是它們的培養(yǎng)和商業(yè)化生產(chǎn)則沒有得到足夠的重視。所以，本研究旨在提供能夠有助于Psathyerella atroumbonata培養(yǎng)技術(shù)的實(shí)用性強(qiáng)的初步信息。2.材料與方法Psathyerella atroumbonata的子實(shí)體采集自伊巴丹大學(xué)植物園的科特迪瓦欖仁的朽木之上。菌絲體純培養(yǎng)則是用加入了0.5%酵母提取物的土豆葡聚糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）分離純化的得到的。這種真菌的營養(yǎng)需求是通過菌絲體干重法(Fasidi & Jonathan, 1994)得到的?；A(chǔ)培養(yǎng)基是錐形瓶中1L去離子水中加入各種營養(yǎng)物的產(chǎn)物。培養(yǎng)基中額外添加了50 mg硫酸鏈霉素以抑制細(xì)菌生長，pH

42、值調(diào)節(jié)到6.5。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基分裝入250立方厘米的容器中，并用鋁箔封口，121攝氏度下滅菌15分鐘，并確保每種處理都有三個生物重復(fù)。每個瓶內(nèi)接種0.7厘米直徑的Psathyerella atroumbonata。在30±2攝氏度下連續(xù)培養(yǎng)7天之后，菌絲體成熟，55攝氏度下烘干18小時并最終稱重。2.1. 碳源單因子實(shí)驗(yàn)所使用的液體培養(yǎng)基含有酵母提取物2.5g，磷酸二氫鉀0.05g，七水合硫酸鎂0.05g，硫酸亞鐵0.01g，硝酸鉀1.55g及一升去離子水。液體培養(yǎng)基中含有1%不同種類的碳源，復(fù)雜碳源每一升加入十克。對照組選用沒有加入任何碳源的培養(yǎng)基(Kadiri & Fasi

43、di, 1994; Chandra & Pur -kayastha, 1977)。2.2. 氮源單因子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有磷酸二氫鉀0.05g，七水合硫酸鎂0.05g，葡萄糖10g，鹽酸硫胺0.5mg及一升去離子水。各種復(fù)雜氮源（蛋白胨，尿素，酵母提取物，麥芽提取物和酪蛋白水解物）分別以每升兩克的比例加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。對照組選用沒有加入任何氮源的培養(yǎng)基。2.3. 碳氮比單因子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基與氮源單因子實(shí)驗(yàn)中的相同，但不含葡萄糖。取用之前兩個實(shí)驗(yàn)中最佳的碳源和氮源，即葡萄糖和酵母提取物，各0.1克進(jìn)入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，打造1:1的碳氮比(Fasidi & Olorunmaiye, 1

44、994)。2.4. 大量元素單因子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有葡萄糖10g，硝酸鈉2g，七水合硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.3g，鹽酸硫胺0.5mg及一升去離子水。每種被測試的大量元素都用其共軛銨替代（例如硝酸鈉用硝酸銨替代，硫酸鎂用硫酸銨替代）。本實(shí)驗(yàn)使用了兩種對照，一組含有所有大量元素，一組不含有任何大量元素。2.5. 痕量元素單因子實(shí)驗(yàn)五種痕量元素（銅，鐵，錳，鈷和鋅）的硫酸鹽被分別加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，濃度均為10毫克每升。本實(shí)驗(yàn)使用了兩種對照，一組含有所有痕量元素，一組不含有任何痕量元素。2.6. 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)都依據(jù)Duncan的多范圍檢測 進(jìn)行了差異分析和重要性分析。3.結(jié)果與討論碳源的單因子

45、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葡萄糖是最佳的碳源（表1）。緊隨其后的是甘露糖和纖維素。大型食用真菌對于葡萄糖的利用已經(jīng)為前人所報道(Fasidi & Olorunmaiye,1994; Fasidi & Jonathan, 1994; Hong, 1978; Chandra &Purkayastha, 1977; Oso, 1977a)。這種對葡萄糖的喜愛可能是因?yàn)檫@種糖更容易通過代謝產(chǎn)生細(xì)胞能量(Garraway & Evans, 1984; Jandaik & Kapoor, 1976)。甘露糖，次佳碳源，是一種葡萄糖的異構(gòu)體，可以在代謝過程中轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?Morri

46、son and Boyd, 1992)。Griffin(1994)曾在文章中指出甘露糖和果糖往往是僅次于葡萄糖的最優(yōu)碳源。肌醇是實(shí)驗(yàn)中效果最差的碳源，對于菌種生長沒有已知的重要作用；而效果如此之差可能是由于這種菌體沒有可以代謝該種糖醇的酶。在測試的所有氮源中，最佳的氮源是酵母提取物（表2）。緊隨其后的是麥芽提取物和L-色氨酸。這一結(jié)果與Fasidi and Olorunmaiye (1994)在Pleurotus tuber-regium的實(shí)驗(yàn)上和Alberghina (1973)在Neurospora crassa的實(shí)驗(yàn)上結(jié)果是相近的。這兩種組分對于Psathyerella atroumbo

47、nata生長的相似促進(jìn)作用可能源于他們的碳水化合物和蛋白質(zhì)組分 (Alberghina, 1973; Bolton & Blair, 1982)。氨基酸基本都會促進(jìn)這種大型真菌的生長，其中L-色氨酸的效果尤其突出，其次是L-天冬氨酸和DL-苯丙氨酸。Madunagu (1988)在Pleurotus squarrosulus的研究中曾得到類似的結(jié)果。除了硝酸鈣和硝酸銨分別促進(jìn)菌絲生長，分別至70mg/cm3和63mg/cm3；其余的無機(jī)氮源都沒有明顯的促進(jìn)菌絲的生長。硫酸銨和硝酸鈉的培養(yǎng)基內(nèi)菌絲體生長到36.7mg/cm3，這一結(jié)果甚至低于對照組。硝酸根離子對于某些擔(dān)子菌的生長具有抑制

48、作用 (Griffin, 1994)。硫酸根離子是一個大基團(tuán)，在過膜過程中可能有一定的困難，所以難以支持其生長(Garraway & Evans, 1984)。本研究中所用的各種碳氮比都有效促進(jìn)了菌絲的生長（表3）（P=0.01）。最佳碳氮比為2:3，其次為3:4，最差的則是5:1。此結(jié)果與Chandra and Purkayastha (1977; for Agaricus campe stris)和Fasidi and Olorunmaiye (1994; for Pleurotus tuber-regium)得到的并不相同，這表明了Psathyerella atroumbonat

49、a有獨(dú)特的營養(yǎng)需求。這種真菌在可忍受的范圍內(nèi)均可以使用碳氮源(Jandaik & Kapoor,1976)。含有所有大量元素的完全培養(yǎng)基可以極大地促進(jìn)Psathyerella atroumbonata的生長（P=0.01）。這說明所有的大量元素在菌體生長中都是需要的，盡管依賴程度并不相同（表4）。不含鈉的完全培養(yǎng)基可以促進(jìn)菌絲的最佳生長，緊隨其后的是不含鉀、鈣、鎂的培養(yǎng)基。Fasidi and Jonathan (1994)在對Volvariella esculenta的研究中也得到了類似的結(jié)論。Griffin (1994)曾研究鈣對于菌絲生長的重要性以及鎂對于ATP代謝的重要性。鈉離

50、子所致的生長最差支持了Sykes an d Porter (1973)所提出的只有在海洋中生長的真菌才在生長與代謝中需要鈉離子的結(jié)論。在所有的痕量元素實(shí)驗(yàn)中，雙失培養(yǎng)基得到的菌絲生長最好，其次是缺少錳、鐵、鋅和銅的培養(yǎng)基（表5）。這說明Psathyerella atroumbonata的生長并不顯著需要鈷和錳。此種真菌不能利用這兩種痕量元素可能是因?yàn)樗鼈儗τ谡婢?xì)胞的普遍毒性。類似的毒性報告見于Humfeld and Sugihara (1952; forAgaricus campestris)和Chandraand Purkayastha (1977; for Volvariella vol

51、vacea)。缺乏銅和鋅離子的培養(yǎng)基效果最差，說明他們在真菌生長過程中是必須的。盡管這兩種元素的含量不同，但是它們在統(tǒng)計學(xué)上的差異并不大（P=0.01）。真菌酶活性同時需要銅和鋅，但是鋅是中間代謝所需要的(Griffin, 1994)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長非常差（負(fù)對照），意味著Psathyerella atroumbonata在生長過程中需要一些痕量元素(Griffin, 1994; Garraway & Evans, 1984)。上述研究表明葡萄糖和酵母提取物以2:3的比例并入培養(yǎng)基中時可以極大地促進(jìn)Psathyerella atroumbonata的生長。鈣、鎂、鉀也可以很好的促

52、進(jìn)其生長，銅和鋅（在很低的濃度上）對于菌絲體的繁殖也是必須的。所有這些都可以促進(jìn)菌絲的生長，并生產(chǎn)出極好的可食用真菌。參考文獻(xiàn)1 孟思; 劉曉宇; 李信輝; 吳謀成. 杏鮑菇水溶性多糖提取工藝研究 J. 食品科學(xué), 2007, 28, 141-144.2 潘曉恒. 杏鮑菇液體發(fā)酵多糖的提取及抗氧化研究. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.3 Gabius, H. J.; Siebert, H. C.; André, S.; JiménezBarbero, J.; Rüdiger, H. Chemical biology of the sugar code. ChemBioChem, 200