熒光測定黃酮

1、基于熒光光譜法對銀杏黃酮糖苷的檢測研究溫宗壯 中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院生物工程11-2摘要：銀杏黃酮糖苷因具有多種生物活性而被制藥、食品、日用品等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。針對目前銀杏黃酮糖苷檢測操作繁瑣、成本高、耗時(shí)長的不足，建立了一種高精確性、低成本的快速測定方法。根據(jù)黃酮類化合物能與Al3+反應(yīng)形成熒光螯合物的原理，以蘆丁為標(biāo)樣探索測試條件，結(jié)果表明在激發(fā)波長ex=400 nm，發(fā)射波長em=520 nm，pH為3.6 的Al（NO3）3-（HAc-NaAc）反應(yīng)體系中反應(yīng)1500 s，螯合物熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定且達(dá)到最大值。求得蘆丁濃度與熒光值的線性回歸方程為y=29.92x+36.49（R2=0.9

2、86），線性范圍為1.8×10-63.2×10-5 mol/L。用這種方法檢測了銀杏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中黃酮糖苷的含量，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為101.3%。該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡單，具有良好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：熒光光譜法 銀杏 黃酮糖苷引言銀杏黃酮具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等諸多作用，是生物制藥、保健食品、功能性產(chǎn)品、化妝品和動(dòng)物飼料添加劑等諸多行業(yè)產(chǎn)品開發(fā)的主要原料1。紫外可見分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry, UV）、高效液相色譜法（ high performance liquid chromat

3、ography, HPLC）等方法是常用于檢測植物中黃酮類化合物的手段。其中UV法是最傳統(tǒng)、應(yīng)用最廣泛的方法。Zhu等利用紫外可見分光光度法對5種提取馬齒莧黃酮方法的結(jié)果進(jìn)行了檢測2。Wang等也在刺五加上用同樣的方法做過類似的研究3。但是該種方法用于測定植物中未經(jīng)純化的黃酮粗提物，結(jié)果會(huì)很大程度上受到雜質(zhì)的干擾，這已經(jīng)成為不爭的事實(shí)。其原因在于許多提取物中常見的雜質(zhì)如咖啡酸和鞣質(zhì)也具有鄰苯二羥基結(jié)構(gòu)，也能參與Al3+的顯色反應(yīng)，使得測定結(jié)果會(huì)比實(shí)際值偏高。HPLC法測定結(jié)果相對準(zhǔn)確，但設(shè)備昂貴、儀器維護(hù)成本高、使用費(fèi)時(shí)且測定各成分時(shí)需要標(biāo)準(zhǔn)品對照，使用成本也高，實(shí)力一般的科研機(jī)構(gòu)難以接受，通

4、常為了得到更為精確的組分信息，經(jīng)常與質(zhì)譜（mass spectrum, MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）等手段連用，進(jìn)行定性定量檢測。Qing等利用HPLC-MS結(jié)合13CNMR法從月季中鑒定了4個(gè)黃酮糖苷4。Anja5 、Zhao6 、Chang7等都從不同的生物樣本中分離鑒定了多種黃酮類化合物。毛細(xì)管電泳法在分析植物次生代謝物方面也有許多報(bào)道。在檢測銀杏黃酮組分中也已經(jīng)有了應(yīng)用。Zhang等用毛細(xì)管電泳法檢測了菊花黃酮，建立了濃度與電流響應(yīng)的線性關(guān)系8。Chi等利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離檢測了中國涼茶中幾種黃酮物質(zhì)，這種方法能高效分離、省時(shí)、所

5、需樣品少、重現(xiàn)性好9。但其具有HPLC法一樣的缺點(diǎn)。此外氣相色譜法在黃酮類化合物的分析中應(yīng)用很少，這主要是由于黃酮類化合物不耐受高溫，檢測前需利用衍生化試劑將其衍生化，增加了實(shí)驗(yàn)成本，操作復(fù)雜，不被廣泛采用。根據(jù)黃酮類化合物能與Al3+反應(yīng)形成熒光螯合物的原理，本文建立了以蘆丁為標(biāo)品的銀杏黃酮糖苷熒光光譜法（Fluoro-spectrophotometry method，F(xiàn)SM）的檢測手段。Serbia等曾研究了熒光分光光度法對人血清桑色素的檢測，以液相色譜法的檢測結(jié)果為對照，表明兩種方法的相對標(biāo)準(zhǔn)誤差在可接受范圍內(nèi)，熒光分光光度法是可靠的10。本試驗(yàn)中以銀杏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為樣品提取黃酮糖苷并測

6、定其含量，為植物藥的開發(fā)利用提供了有力保障。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1試驗(yàn)材料與試劑 銀杏細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)所得，烘干并碾成粉末，貯存于干燥器中暗處保存?zhèn)溆?。氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、蘆丁均為分析純及色譜級甲醇產(chǎn)自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。槲皮素、山萘素和異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）購于成都曼斯特生物科技有限公司，配制成0.05 mg/mL備用。去離子水。1.2儀器設(shè)備熒光分光光度計(jì)為日本Hitachi公司生產(chǎn)的FL-2700型號；高效液相色譜儀為戴安中國有限公司生產(chǎn)的Dionex P680型，反相C18柱250×4.6mm。1.3 標(biāo)樣及樣品的制備精確稱取蘆丁標(biāo)樣0.01 g，

7、色譜級甲醇溶解，定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4和5mL，各加入10%的Al(NO3)3及2.5 mL的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，用純甲醇定容至25 mL。精確稱取烘干的銀杏愈傷組織和樣品1 g，按固液比1:9加入甲醇，500 W超聲波輔助萃取50 min后濾紙過濾，取試樣加10%的Al(NO3)3溶液及2.5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，用甲醇定容。1.4測試條件熒光分光光度法測定中激發(fā)光譜通帶和發(fā)射光譜通帶均設(shè)定為5 nm，激發(fā)電壓700 V，此條件下,掃描最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長，考察鋁離子添加量、緩沖液pH、甲醇濃度、反應(yīng)時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響。并在

8、所得的最佳色譜條件下測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，建立回歸方程。在相同條件下測定懸浮培養(yǎng)細(xì)胞黃酮提取液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量。黃酮糖苷水解及HPLC法測試條件參照Chen等的方法11。1.5 數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用軟件Origin pro 8.0處理。2 結(jié)果與討論2.1 最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長的確定對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行激發(fā)波長和發(fā)射波長掃描，如圖1所示當(dāng)熒光強(qiáng)度最大時(shí)，激發(fā)波長ex=400 nm，發(fā)射波長em=520 nm，所以選擇激發(fā)波長ex=400nm，發(fā)射波長em=520nm檢測黃酮。 圖片1 激發(fā)波長和發(fā)射波長下的掃描2.2 Al(NO3)3的添加量考察了10% Al（NO3

9、）3添加量分別為0、1、2、3、4、5和6 mL與黃酮形成的螯合物熒光強(qiáng)度的影響。光譜圖如下2所示：(a)1mLAl3 + (b)2mLAl3+ (c)3mLAl3+ (d)4mLAl3+ (e)5mLAl3+ (f)6mLAl3+ (ck)未添加Al3+ 圖2 不同Al3+添加量下蘆丁熒光光譜圖結(jié)果表明，不添加Al3+的處理中，蘆丁未形成螯合物，所以熒光強(qiáng)度一直不穩(wěn)定。所有添加Al3+的處理中，在1500 s后基本呈穩(wěn)定趨勢，添加量小于4 mL的各處理其熒光強(qiáng)度在穩(wěn)定趨勢中還有小幅度波動(dòng)。綜合熒光強(qiáng)度和絡(luò)合物穩(wěn)定性兩方面因素考慮，選擇加入硝酸鋁的量為4 mL較適宜。2.3 甲醇濃度的影響黃酮

10、類化合物在甲醇中溶解度較好，難溶于水，選擇甲醇做為溶劑。分別以10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的甲醇溶解蘆丁，各處理下熒光強(qiáng)度見下圖。（a）10%甲醇 （b）20%甲醇 （c）30%甲醇 （d）40%甲醇 （e）50%甲醇 （f）60%甲醇 （g）70%甲醇 （h）80%甲醇 （i）90%甲醇 （j）100%甲醇圖片3 不同甲醇濃度下的蘆丁光譜圖根據(jù)各甲醇濃度與對應(yīng)的蘆丁螯合物最大熒光值繪制趨勢圖，發(fā)現(xiàn)甲醇濃度為100%時(shí)，熒光強(qiáng)度最大，且光譜曲線平滑，沒有波動(dòng)，說明此條件下所生成的螯合物熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。所以選擇100%的甲醇作為溶劑。圖片4 熒光

11、強(qiáng)度隨著甲醇濃度的變化 2.4 pH值的影響溶液的pH值對絡(luò)合物的形成和熒光強(qiáng)度的大小有一定的影響。向溶液中加入不同pH的緩沖液，對熒光強(qiáng)度的的大小進(jìn)行考察，見圖5，結(jié)果表明，加入pH=3.4-4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度相對比較大，且熒光值相對穩(wěn)定。pH=3.6時(shí)熒光值達(dá)到最大583.2。（a）pH3.6 （b）pH3.8 （c）pH4.0（d）pH4.2 （e）pH4.4 （f）pH4.6（g）pH4.8 （h）pH5.0 （i）pH5.2 （j）pH5.4 （k）pH5.6 （l）pH5.8 （ck）未加緩沖 圖片5 不同PH下蘆丁的光譜圖根據(jù)緩沖液各pH與對應(yīng)的蘆丁螯

12、合物最大熒光值繪制趨勢圖，隨著pH的加大，熒光強(qiáng)度在不斷減小，尤其是pH從4.0降至4.2時(shí)熒光值發(fā)生了急劇的下降。4.2-5.8范圍內(nèi)仍然是不斷下降趨勢，故試驗(yàn)選取pH 3.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液。 圖片6 熒光強(qiáng)度隨著PH的變化情況 2.5 反應(yīng)時(shí)間的影響Al3+與黃酮反應(yīng)時(shí)間不同，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度大小不一樣。添加Al3+后將溶液避光，測定溶液的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行時(shí)間掃描。見圖7，實(shí)驗(yàn)表明，隨時(shí)間推移，熒光強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)， 1500 s后趨于穩(wěn)定，為了檢驗(yàn)所產(chǎn)生的熒光化合物是否穩(wěn)定，將反應(yīng)時(shí)間延長至3500 s，但熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生明顯變化，說明1500 s時(shí)反應(yīng)已經(jīng)充分完成。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間15

13、00 s時(shí)測定熒光值。圖片7 熒光強(qiáng)度光譜圖隨反應(yīng)時(shí)間的變化2.6干擾實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了常見的幾種金屬離子對FMS法測定銀杏黃酮的干擾，結(jié)果表明Na+、K+、Ca2+3種金屬離子對測定干擾很小，可以忽略。2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)過對實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，對標(biāo)品蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同濃度的蘆丁，加pH 3.6 的HAc-NaAc緩沖液，添加10%硝酸鋁4mL反應(yīng)1500s，測定各濃度下絡(luò)合物熒光強(qiáng)度。用origin pro8.0擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出熒光強(qiáng)度與蘆丁濃度在1.8×10-6-3.2×10-5 mol/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，如圖8。 圖8 蘆丁濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線其回歸方程為：y=2

14、9.92x+36.49其中y為熒光強(qiáng)度，x為蘆丁濃度。2.8 實(shí)際樣品測定及加標(biāo)回收利用該方法對銀杏培養(yǎng)細(xì)胞黃酮糖苷含量進(jìn)行測定，并與HPLC法進(jìn)行了對比，各對樣品溶液分別進(jìn)行5次平行測定，結(jié)果見表1。表1 熒光分光光度法對銀杏懸浮細(xì)胞黃酮糖苷的測定試驗(yàn)編號黃酮糖苷含量/%FSMHPLC12.853.0222.933.0833.022.9442.902.8952.893.12平均2.9183.01在細(xì)胞提取液中加入蘆丁標(biāo)樣進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。表2 銀杏細(xì)胞黃酮提取物加標(biāo)回收率編號原含量/mg加入量/ mg測定值/ mg回收率/%平均回收率/%114.841.0015.8610

15、2.0101.45216.371.5017.88100.8313.622.0015.67102.4418.031.5019.54100.6由表2可知，熒光分光光度法測定銀杏愈傷組織中黃酮含量的平均回收率為 101.3%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該方法精確度高，可行性強(qiáng)。3 結(jié)論建立了一種準(zhǔn)確性高、成本低、快速測定銀杏黃酮的方法。結(jié)果表明在合適的pH范圍內(nèi)黃酮在乙醇-水提取體系中與Al3+反應(yīng)，所形成的復(fù)合物在體系穩(wěn)定、在ex400 nm、em520 nm測試條件下，其具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。利用這種方法檢測了銀杏懸浮細(xì)胞中黃酮的含量為2.918%，回收率為101.3%。FSM的開發(fā)對銀杏資源的開發(fā)利用有較大的

16、促進(jìn)作用，對其他藥用植物的黃酮測定有一定借鑒意義。 參考文獻(xiàn)1 Shibata S. Anti-tumorigenic chalconeJ. Stem Call, 1994, 12(1): 44.2Zhu H, Wang Y, Liu Y, Xia Y, et al. Food Analytical Methods, 2010, 3 (2): 90.3Wang Y, Chu H T. Advanced Materials Research, 2011, 236: 2630.4 Qing L S, Xue Y, Zhang J G, et al. Journal of Chromatography A, 2012, 1249 (6): 130.5Anjak,Markusg G. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2012, 70 (5): 553:556.6 Zhao X, Zhao Y L, Liu X M, et al. Journal of Seperation Science, 2012 ,35 (8) , 984:993. 7Chang C C, Lee SS.Chemistry and Natural Compounds, 2012, 48 (4):689:690. 8Zhang Y Y,