生物化學(xué)基因工程與分子生物學(xué)常用技術(shù)

1、幻燈片1第十五章 基因工程與 分子生物學(xué)常用技術(shù)Genetic Engineering and The Popular Technology In Molecular Biology() 分子生物學(xué)技術(shù)現(xiàn)已廣泛滲透到生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科中，尤其推動(dòng)了基因工程的發(fā)展。 對疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷及藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域取得了令人矚目的成就，對醫(yī)學(xué)的發(fā)展起著巨大的推動(dòng)作用?；脽羝?第一節(jié) 基因工程與基因重組(Genetic Engineering and Genetic recombination) 一、基因工程的基本概念 不同來源的DNA分子可以通過磷酸二酯鍵連接形成重新組合的DNA分子，稱為DNA重組

2、。 將基因進(jìn)行克隆，并表達(dá)制備特定的產(chǎn)物，或定向改造細(xì)胞乃至生物個(gè)體的特性所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程?；脽羝?(一)工具酶1.限制性核酸內(nèi)切酶 (1) 能夠切割DNA中磷酸二酯鍵的酶稱核酸酶，其中有選擇地切割DNA分子特異序列的核酸酶，稱為限制性核酸內(nèi)切酶，簡稱限制性內(nèi)切酶。 (2)命名Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶(3)識(shí)別特征5GAATTC33CTTAAG5 限制性內(nèi)切酶識(shí)別的DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征。幻燈片4(4)切割位點(diǎn) 不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割的特異性不同，結(jié)果有3種不同的情況：產(chǎn)生3 突出粘性末

3、端：以EcoR為例：5GAATTC3 5G AATTC33CTTAAG5 3CTTAA G5 產(chǎn)生5 突出粘性末端：以Pst為例：5CTGCAG3 5CTGCA G33GACGTC5 3 G ACGTC5 產(chǎn)生平末端：Nru為例：5TCGCGA3 5TCG CGA3 3AGCGCT5 3AGC GCT5幻燈片52.DNA聚合酶(1)基因工程主要應(yīng)用E.coli DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶等。(2)主要用途： 利用5/3/聚合活性，合成DNA第二條鏈； 對DNA的3/端進(jìn)行填補(bǔ)或末端標(biāo)記； E.coli DNA-pol用于缺口平移，制作探針； T4 DNA聚合酶可用于

4、DNA序列測定； Taq DNA聚合酶用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。3.DNA連接酶 使單鏈切口形成磷酸二酯鍵，共價(jià)地連接。幻燈片64.逆轉(zhuǎn)錄酶(1)用于真核mRNA逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫。(2)用于進(jìn)行3/端填補(bǔ)和標(biāo)記，制備DNA探針。(3)用于DNA序列測定。 5.多核苷酸激酶 (1)用于放射性標(biāo)記DNA鏈的5/端。 (2)用于缺少5/-磷酸基的DNA磷酸化。6.堿性磷酸酶 此酶防止載體的自身連接。7.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 能催化單核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA的3/-端羥基上?；脽羝?(二)載體1. 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子，稱為載體。能自主復(fù)制。易

5、進(jìn)入宿主細(xì)胞。具有多克隆位點(diǎn)。易從宿主細(xì)胞中分離純化。有易被識(shí)別和篩選的標(biāo)志。2. 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒噬菌體粘粒病毒3.常用載體幻燈片8(1)質(zhì)粒(plasmid)質(zhì)粒是細(xì)菌中獨(dú)立于染色質(zhì)以外的、能自主復(fù)制的、并與細(xì)菌或細(xì)胞共存的遺傳成分，可賦予宿主細(xì)胞某些遺傳性狀。通常質(zhì)粒的大小為2300kb。一般只能容納10kb的外源DNA片斷?；脽羝?(2)噬菌體(bacteriophage，phage)噬菌體是感染細(xì)菌的一類病毒，因其寄生在細(xì)菌中并能溶解細(xì)菌細(xì)胞，故稱為噬菌體。噬菌體由頭和尾構(gòu)成，感染時(shí)尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。具有溶菌性和溶原性兩種不同的繁殖方式。 幻

6、燈片10(3)粘粒(cosmid)粘粒是將噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒組合的裝配型載體。粘粒本身約4 6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因組文庫的載體。(4)病毒 病毒載體更多地用于真核表達(dá)系統(tǒng)，如腺病毒、痘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和猴空泡病毒?；脽羝?1二、重組DNA技術(shù)的基本原理和過程 基因工程中最主要是分子克隆，克隆是指由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖后所形成的子代群體。進(jìn)行分子克隆所采用的技術(shù)即重組DNA技術(shù)，故又稱為分子克隆技術(shù)或基因工程技術(shù)。 制備目的基因和相關(guān)載體； 將目的基因和載體進(jìn)行連接； 將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞； DNA重組體的篩選和鑒定； DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)。 基本步驟幻燈片

7、12(一)目的基因的制備1. 制備基因組DNA文庫 (genomic library) 將基因組DNA酶切成片段，再與載體分子拼接成重組DNA，將其引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，所得分子克隆混合體稱基因組文庫。2. 制備cDNA文庫 (cDNA library) 將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ，再與載體連接成重組DNA，將其引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，所得分子克隆的混合體稱為cDNA文庫。幻燈片133.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 如已知目的基因序列，則可采用PCR從基因組DNA中獲得目的基因，也可以采用逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR) 直接從mRNA獲得特定基因的cDNA。4化學(xué)合成 如已知肽鏈的氨基酸順序，

8、則可按對應(yīng)密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列，然后合成該段DNA序列?；脽羝?4(二)目的基因與載體的連接 將目的基因插入載體，用DNA連接酶連接雙鏈DNA粘性末端序列，在體外重新連接成人工重組體。方法主要有以下四種：1粘性末端連接2同聚物加尾連接3平末端連接4人工接頭連接幻燈片15(三)將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞常用的方法有以下兩種：1.轉(zhuǎn)化(transformation) 轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。2.感染(infection) 感染是指以噬菌體進(jìn)入宿主菌或病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖的過程?；脽羝?6(四)目的基因的篩選和鑒定1.遺傳學(xué)方法 針對

9、載體攜帶有某些標(biāo)志基因如抗藥性標(biāo)志基因(ampr、tetr 、kanr等)和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法。2.分子雜交方法 利用32P標(biāo)記的探針與重組DNA或克隆DNA片段進(jìn)行分子雜交，直接篩選并鑒定目的基因。3.免疫學(xué)方法 利用特異性抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異結(jié)合的方法篩選?；脽羝?7(五)克隆基因的表達(dá) 利用重組DNA技術(shù)所獲得目的基因或DNA序列，可實(shí)現(xiàn)在受體細(xì)胞中的表達(dá)，即產(chǎn)生mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。(六)重組DNA技術(shù)操作過程總結(jié)歸納 分切接轉(zhuǎn)篩分離目的基因 限制酶切目的基因與載體拼接重組體 轉(zhuǎn)入受體菌 篩選重組體 幻燈片18三、基因診斷和基因治療(一)基因診斷(gene diagnosi

10、s) 1.基因診斷是指利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。2. 特點(diǎn) 針對性強(qiáng)、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適應(yīng)性強(qiáng)。遺傳性疾病腫瘤感染性疾病遺傳易感性疾病器官移植配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定3. 應(yīng)用幻燈片19(二)基因治療(gene therapy)1. 基因治療是指以正?；虺C正、替代缺陷基因，或從基因水平調(diào)控細(xì)胞中缺陷基因表達(dá)的一種治療疾病的方法。2. 狹義的基因治療是指將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，與宿主細(xì)胞的基因整合后表達(dá)以達(dá)到治療疾病的方法。 3. 廣義的基因治療是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用以達(dá)到治療疾病的方法。

11、幻燈片20基因增補(bǔ)基因置換基因矯正基因失活基因疫苗4.基因治療的基本策略5.基因治療的基本程序(1)選擇和制備目的基因：治療性基因。(2)選擇基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體：通常選擇病毒載體。(3)選擇靶細(xì)胞：體細(xì)胞、生殖細(xì)胞。(4)轉(zhuǎn)移基因：將治療基因?qū)氩⒈磉_(dá)?；脽羝?1第二節(jié) 分子生物學(xué) 技術(shù)及其應(yīng)用(The Technology and Application in Molecular Biology)一、核酸分子雜交技術(shù) 核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 是指利用DNA復(fù)性原理，把不同來源的DNA單鏈或DNA與RNA混合，如單鏈分子間有堿基配對關(guān)系，則可形成雜化

12、雙鏈的過程?；脽羝?2(一)探針(probe)1. 探針是一段與被測的核苷酸序列(靶基因序列)互補(bǔ)的帶有標(biāo)記的核苷酸片段。2.理想探針的特點(diǎn) (1) 帶有標(biāo)記的示蹤物，便于檢測、鑒定； (2) 應(yīng)是單鏈； (3) 具有高度特異性； (4) 探針長度一般為數(shù)十至數(shù)千個(gè)堿基; (5) 具有高靈敏度和穩(wěn)定性，標(biāo)記方法簡便安全?；脽羝?3(二)核酸分子雜交的基本方法l Southern印跡雜交 l (1) 指將經(jīng)酶切和電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)印到固相支持物上，然后與標(biāo)記的DNA探針雜交。l (2) 可用于分子克隆、遺傳病診斷、法醫(yī)鑒定、腫瘤研究和器官移植等方面。2. Northern印跡雜交 (1)

13、 指將經(jīng)電泳分離后的待測RNA片段轉(zhuǎn)印到固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。 (2) 主要用于檢測各種基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，主要是mRNA ?；脽羝?4幻燈片253.斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交 (1) 指將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再與探針雜交，稱為斑點(diǎn)印跡。若采用狹縫點(diǎn)樣器加樣后雜交，其印跡為線狀，稱為狹縫印跡雜交。 (2) 主要用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究。4.原位雜交 (1) 指將標(biāo)記的核酸探針與經(jīng)適當(dāng)方法處理的細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。 (2) 該方法不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，有很高的靈敏度，并可保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映

14、出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)?；脽羝?6二、聚合酶鏈反應(yīng)(一)PCR的基本原理DNA的變性 DNA與引物的退火(復(fù)性)引物的延伸。 1. PCR有三個(gè)反應(yīng)步驟幻燈片27n個(gè)循環(huán)加熱變性模板DNA退火DNA延伸P25 35 35 3 3P15 2.變性復(fù)性延伸這三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)的產(chǎn)物作為下個(gè)循環(huán)的模板，如此循環(huán)多次， 則DNA成指數(shù)擴(kuò)增?；脽羝?8(二)PCR的基本反應(yīng)PCR反應(yīng)體系： 1. 引物 是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。 2. 酶濃度酶催化的PCR反應(yīng)的Taq DNA聚合酶量約需2.5U。 3. dNTP的質(zhì)量dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效

15、率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)，易變性失去生物學(xué)活性。 4. 模板核酸模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一?；脽羝?9(三)PCR的應(yīng)用1可分析基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；構(gòu)建cDNA文庫；克隆特異cDNA；合成cDNA探針。2可判斷突變的基因片段，如癌基因和抑癌基因中點(diǎn)突變的檢測和鑒定。3用于病原微生物的微量檢測及鑒別菌株；突變基因的篩選；法醫(yī)學(xué)鑒定；DNA序列分析；器官移植配型等。4應(yīng)用于遺傳性疾病的診斷如地中海貧血、苯丙酮酸尿癥等；感染性疾病如肝炎、結(jié)核等診斷。5根據(jù)已知致癌基因順序設(shè)計(jì)特異的模板和引物，用于篩選特異的抗腫瘤化合物。幻燈片30三、核酸的序列分析(一)DNA

16、鏈末端合成終止法(Sanger法) 幻燈片31(二)DNA自動(dòng)測序采用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子發(fā)出不同波長熒光，采集熒光信號，確定DNA堿基的排列順序。 DNA自動(dòng)測序結(jié)果舉例幻燈片32四、基因文庫基因文庫是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。包括基因組DNA文庫和cDNA文庫。五、生物芯片技術(shù)(一)基因芯片(gene chip) 是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上 。包括DNA芯片(DNA chip) 和cDNA芯片 (cDNA chip) ?；脽羝?3(二)蛋白質(zhì)芯片(protein chip)是將蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，可特異性與待測樣品中的靶蛋白反應(yīng)，再