動物細胞轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)知識大全

1、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程。轉(zhuǎn)染方法的分類對外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括:轉(zhuǎn)移效率高,不影響細胞正常生理活動,低毒性,容易使用,重復(fù)性好,易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子.根據(jù)轉(zhuǎn)染的機制不同可劃分為化學(xué)轉(zhuǎn)染法和物理轉(zhuǎn)染法兩大類.一、化學(xué)轉(zhuǎn)染法1.DEAE-葡聚糖法DEAE葡聚是最早應(yīng)用哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染試劑之一, DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物,它與帶負電的核酸結(jié)合后接近細胞膜而被攝取,用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染成功地用用于瞬時表達的研究,但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。2.磷酸鈣法磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法,因為試劑易取得,價格便宜而被廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)

2、定轉(zhuǎn)染的研究,先將DNA 和氯化鈣混合,然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀,最后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細胞上,通過細胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細胞內(nèi)的核酸酶活性而保護外源DNA 免受降解.3.人工脂質(zhì)體法人工脂質(zhì)體法采用陽離子脂質(zhì)體,具有較高的轉(zhuǎn)染效率,不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不易轉(zhuǎn)染的細胞系,而且還能轉(zhuǎn)染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA,以及RNA和蛋白質(zhì)。此外,脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時適用于瞬時表達和穩(wěn)定表達,與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA 和RNA 轉(zhuǎn)入動物和人的體內(nèi)用于基因治療。人工合成的陽離子脂質(zhì)體和帶負電荷的核酸結(jié)合后形成復(fù)合物

3、,當復(fù)合物接近細胞膜時被內(nèi)吞成為內(nèi)體進入細胞質(zhì),隨后DNA 復(fù)合物被釋放進入細胞核內(nèi),至于DNA 是如何穿過核膜的,其機理目前還不十分清楚。二、物理方法1.顯微注射顯微注射雖然費力,但是非常有效的將核酸導(dǎo)入細胞或細胞核的方法。2.電穿孔這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動物,但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細胞的研究。電穿孔法常用來轉(zhuǎn)染如植物園生智體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細胞。電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強度和持續(xù)時間有關(guān)系。3.基因槍法基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細胞內(nèi),這種方法適用于培養(yǎng)的細胞核在體內(nèi)的細胞。如何提高轉(zhuǎn)染實驗成功率【組織培養(yǎng)試劑】一般

4、提示:優(yōu)化您的細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑,并經(jīng)可能減少所用試劑的變更。基礎(chǔ)培養(yǎng)基目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如,RPMI 1640和DMEM。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸,葡萄糖,維生素,無機鹽和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定,因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產(chǎn)生問題。務(wù)必要使培養(yǎng)基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì),如HEPES,當暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。酚紅試劑可保護細胞免受一些HEPES降解所產(chǎn)生的毒性效應(yīng),但在使用未加酚紅試劑的培養(yǎng)基的應(yīng)用場合下,如熒光素酶的測定,細胞毒性則仍然是一個問題。胎牛血清血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長促進因子和生長

5、抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動物的年齡、營養(yǎng)水平、和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量。因此血清易受顯著生物學(xué)變異的影響。添加劑某些細胞的生長依賴于一些對生命力或細胞分裂必不可少的物質(zhì)(如,生長因子,微量元素,必需代謝物和蛋白等。CO2培養(yǎng)箱細胞生長所需環(huán)境為37、相對濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值。細胞生理對pH的變化非常敏感,因此多數(shù)細胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2濃度為5%來有效控制pH 值,而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對一下適當?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2

6、則會導(dǎo)致實驗結(jié)果的板間變異性。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì),或真菌/細胞的污染也都可能影響到細胞生理?！炯毎恳话闾崾?密切觀察您的細胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細胞之前,先制定一個適當?shù)姆N板方案,使細胞密度從轉(zhuǎn)染開始到結(jié)束都保持最佳狀態(tài)。增加成功幾率細胞是轉(zhuǎn)染過程中的一個關(guān)鍵元素,它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的最重要的變量。分裂細胞相比較非分裂細胞分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,細胞都在轉(zhuǎn)染當天或前一天種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于生長過度的狀態(tài)。由于FuGENE® 6和HD轉(zhuǎn)染試劑對于細胞作用溫和,可同時進行

7、貼壁細胞的種板和轉(zhuǎn)染。此外,還常用促有絲分裂刺激物(如,病毒轉(zhuǎn)化,生長因子,條件培養(yǎng)基,以及滋養(yǎng)細胞來活化原代培養(yǎng)細胞。貼壁細胞相比較懸浮細胞在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著。天生趨于懸浮的細胞(如HL 60,Jurkat非常難以轉(zhuǎn)染;相反,天生為貼壁的細胞(如HEK,CHO則可適應(yīng)懸浮生長的條件。那些天然懸浮的和那些適應(yīng)懸浮的細胞的漿膜是不一樣的。據(jù)推測轉(zhuǎn)染過程中的一個限制步驟就是通過內(nèi)吞作用攝取轉(zhuǎn)染分子(DNA 或RNA與轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物;然而,目前對此尚未有分子水平上的合理機制的解釋。細胞間膜結(jié)構(gòu)的差異可能是某些細胞類型天生難以轉(zhuǎn)染的部分原因。所以,尋找更有效轉(zhuǎn)染試劑的工作

8、目前還主要是經(jīng)驗性的,尤其對于那些天生為懸浮的細胞而言更是如此。這常常是在不含血清而含有抑制轉(zhuǎn)染的特殊添加劑的培養(yǎng)基中發(fā)生。經(jīng)小心處理后,這些細胞可適應(yīng)于在沒有添加劑的環(huán)境中懸浮生長。如果這些適應(yīng)于懸浮生長的貼壁細胞在沒有這些添加劑的環(huán)境中生長,那么它們就可以被轉(zhuǎn)染。分批方案在對培養(yǎng)細胞進行分批傳代培養(yǎng)之前,必須把貼壁細胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細胞功能受到嚴重損害。因此分批方案的不同(如,胰蛋白酶消化時間的延長,胰蛋白酶的失活,以及消化后直到轉(zhuǎn)染開始的時間都可能對轉(zhuǎn)染實驗有所影響。如果在轉(zhuǎn)染時細胞過于密集,那么種到培養(yǎng)板上的就會是細胞團塊而非單個細胞。對于某些細

9、胞/試劑組合而言,漿膜狀態(tài)被改變后有可能會影響到所用試劑和DNA的最佳配用量和配比。傳代次數(shù)傳代次數(shù)是指對一個細胞系進行分批傳代的頻度(通常在一個實驗室范圍內(nèi)。在某些情況下,自建立細胞系起的確切傳代次數(shù)無法得知。某些細胞系相比較其他細胞系而言較不穩(wěn)定,可能會隨著培養(yǎng)時間的延長而改變,視不同的細胞系和培養(yǎng)條件而定。培養(yǎng)條件的不同可引起克隆選擇。因此名稱相同的同一細胞系有關(guān)其生理學(xué)和形態(tài)學(xué)(以及轉(zhuǎn)染能力性質(zhì)可能會有很大的差異。一般而言,細胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。在不同細胞系之間轉(zhuǎn)染效率的變化很大。某些細胞系在傳代很大次后仍能保持穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率,而其他一些則傳代很

10、少次數(shù)就表現(xiàn)出轉(zhuǎn)染效率的差異。細胞數(shù)量(匯聚度只要培養(yǎng)基質(zhì)(組織培養(yǎng)皿尚有空間,細胞就會按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細胞而言,細胞生長的速度受細胞密度大小的抑制(接觸抑制,但癌細胞則不受此限制而會繼續(xù)生長并可互相疊加。營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細胞生長。細胞會因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報告基因的表達率與轉(zhuǎn)染開始時的細胞數(shù)量和細胞健康以及它們隨后直到細胞溶解之前的生長情況相關(guān)。培養(yǎng)物污染培養(yǎng)物可被細菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細胞種類所污染。各種污染都會導(dǎo)致產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。支原體污染支原體污染在所有培養(yǎng)細胞中的比例為5-35%,它可改變細胞生長特性,酶的作用途

11、徑,細胞膜的組成,染色體結(jié)構(gòu),以及轉(zhuǎn)染效率。特別是,支原體對采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾,其結(jié)果致使轉(zhuǎn)染效率偏低或非典型。這些效應(yīng)會導(dǎo)致實驗結(jié)果的不可靠以及時間和珍貴細胞系的損失。和細菌及真菌不同,支原體污染無法通過視覺檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜;它們還對常用抗生素有抗藥性。所以必需進行支原體污染的常規(guī)篩查。交叉污染如果同一個實驗室同時培養(yǎng)不同種類的細胞,那就有可能發(fā)生交叉污染,即使遵循最嚴格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養(yǎng)細胞種,幾個月過后它們

12、就會完全取代目標培養(yǎng)物。這種變化是逐漸發(fā)生的;而您可能甚至還未發(fā)現(xiàn)。建立細胞系鑒定的檢測標準。例如,對于人類細胞系而言,STR (短串聯(lián)重復(fù)序列圖譜就是一種可靠的鑒定方法?；蛘吒唵蔚慕鉀Q方案就是,當懷疑有交叉污染時,如果有可能,就換用新鮮的,傳代次數(shù)少的細胞源?！据d體DNA】一般提示:對您純化所得的載體進行質(zhì)量檢查。確定支持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系。在對您細胞體系的參數(shù)進行測定時,一定要選用一種您已知具有功能的對照載體。載體的完整性種載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋中斷、核酸酶的降解,以及來自于儲存和處理過程

13、中的物理壓力的影響。載體制備物-各種載體是按照不同的方案在細菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl,內(nèi)毒素可能會影響轉(zhuǎn)染效率。載體構(gòu)造(啟動子/增強子/ORI轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強病毒調(diào)節(jié)元件(如,RSV,CMV,和SV40的對照載體進行優(yōu)化和比較。然而,病毒啟動子/增強子體系的相對有效性在不同細胞系間的差異可大到兩個數(shù)量級。例如,在某些細胞系中,由于自發(fā)的質(zhì)粒擴增,SV40體系可高效表達large T抗原(如,COS;而在其他許多細胞系中,則是CMV啟動子更為有效。除此之外,各種CMV載體的表達率也會有超過一個數(shù)量級的差異,這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的?！巨D(zhuǎn)染方案】一

14、般提示:建立一套適當?shù)霓D(zhuǎn)染方案;首先從一種標準方案開始,然后通過改變試劑/DNA的配比和形成復(fù)合物的數(shù)量進行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比,離子強度,緩沖液pH值,以及溫度等變量都會影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能。質(zhì)粒既可在無菌水又可在TE緩沖液中稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑,就應(yīng)當仔細閱讀該試劑所提供的使用說明。需要對試劑提供方給予一定的信賴;除非您有很好的理由支持您做出改變,否則就應(yīng)當嚴格按照他們所推薦的轉(zhuǎn)染方案。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物;如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清,它就會對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的最佳孵育時間是一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié),

15、對于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比(負載比所有的轉(zhuǎn)染試劑都會在某一個試劑/DNA配比時最為有效。有時候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對于每種實驗體系都必須進行優(yōu)化才能得到最佳配比。為了尋找這種最佳配比往往會花費大量的時間和金錢。除了配比的重要性之外,所加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物量的多少也非常關(guān)鍵。形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑對于多數(shù)試劑而言,很關(guān)鍵的一點是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基和鹽溶液中形成。復(fù)合物數(shù)量對轉(zhuǎn)染細胞所用的轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物的量也應(yīng)當進行優(yōu)化。如果用量太少,那么轉(zhuǎn)染DNA的表達就太弱;如果用量太多,則可能由于細胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表達。最佳用量

16、通常都必須進行實驗來確定。所需要的轉(zhuǎn)染復(fù)合物用量與所用細胞的數(shù)量相關(guān)。轉(zhuǎn)染細胞越少,所需復(fù)合物就越少。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入有兩種替換方法可用來漿轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細胞:1. 將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基,或者 2. 將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋,然后進行培養(yǎng)基更換操作。第一種方法更簡便,而第二種方法則更因為避免了試劑在局部濃聚而產(chǎn)生毒性,所以會使結(jié)果的一致性更好。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染過程中所使用的培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染效率可能會有正面或負面的影響。甚至對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方而言也是如此,尤其是在培養(yǎng)基中加入牛血清的情況下。胎牛血清的存在會使多種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率降低。某些公司還提供可與轉(zhuǎn)染試劑配合使用的優(yōu)化無血清轉(zhuǎn)染培

17、養(yǎng)基。而由羅氏應(yīng)用科學(xué)部所提供的轉(zhuǎn)染試劑則無論是否存在血清都能有效轉(zhuǎn)染。FuGENE® H D是獨一無二的能夠轉(zhuǎn)染保存在100%血清中腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染試劑。如果有抗生素(如,青霉素、鏈霉素、或兩性霉素B存在的情況下培養(yǎng)細胞,則轉(zhuǎn)染有效性會降低至25%。因此,對于瞬時轉(zhuǎn)染,我們建議使用不加抗生素的培養(yǎng)基?！緯r間進度】一般提示:要確保最終結(jié)果的成功;建立一個合適的時間進度進行轉(zhuǎn)染實驗以保證您所需要的目標蛋白能得到最佳表達。轉(zhuǎn)染的開始在轉(zhuǎn)染前12小時,將細胞分種于培養(yǎng)板中。在轉(zhuǎn)染開始時,培養(yǎng)物應(yīng)當有約50-80%匯聚,這樣就可以使它們在實驗結(jié)束時達到接近100%的匯聚。如果在轉(zhuǎn)染中去掉血清,

18、細胞可能會暫時停止生長。細胞對轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時的時間內(nèi)完成。在這段時間后,就不會再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長。培養(yǎng)基更換某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須在沒有胎牛血清存在的條件下進行,那么這一步驟就必不可少。至于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉(zhuǎn)染試劑(如,FuGENE® 6 轉(zhuǎn)染試劑或FuGENE®HD 轉(zhuǎn)染試劑時,如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達階段,就可以省略這一步。如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在細胞中直到進行檢測,那么對有些細胞系而言轉(zhuǎn)染效率會有所提高,而另外一些細胞在轉(zhuǎn)染開始幾個小時之后其轉(zhuǎn)染效率就不會再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑/

19、DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除,但在此后的長期生長階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細胞需要生長3-7天,換培養(yǎng)基就尤其重要,這樣一來就使它們有時間達到最高的蛋白表達量?！居醒鍟r的轉(zhuǎn)染】血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率,但只要在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不含血清,在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。轉(zhuǎn)染過程在兩步中需要使用培養(yǎng)基做為稀釋液:在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物準備過程以及復(fù)合物同細胞接觸過程。在開始準備DNA和陽離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基,因為血清會影響復(fù)合物的形成。但在復(fù)合物形成后,在加入細胞中前可以加入血清。陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時會

20、有所不同,因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進行優(yōu)化。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細胞,可以使用OPTI-MEM培養(yǎng)基,一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞,建議使用LIPOFECTAMINE 2000。【培養(yǎng)基中的抗生素】抗生素,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。

21、這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。【細胞維護和培養(yǎng)的演變】可以通過常規(guī)的次培養(yǎng)步驟保持轉(zhuǎn)染鋪板前的細胞健康。每周傳代一到兩次,稀釋程度使得下次傳代前細胞幾乎融合。不要使細胞保持融合超過24小時。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種

22、變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如,新鮮融化的NIH 3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率。融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。或者,幾種來源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細胞亞系的細胞系現(xiàn)在有售?！炯毎伆迕芏取坑糜谵D(zhuǎn)染的最佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2×106-4×106細胞/ml時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板

23、細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。在三種不同密度進行細胞鋪板的比較表明鋪板密度最高的,CAT活性也最高。得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明,對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的最佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細胞密度而異?！締幼拥倪x擇】獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒相比,在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系,如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurka

24、t細胞中CMV啟動子,而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細胞中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7時會提高,因為大T抗原可以刺激染色體外的合成?！綝NA量】高質(zhì)量的DNA對于進行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。以前研究者使用CsCl梯度離心得到的DNA進行轉(zhuǎn)染,但是這種方法費時費力。其他的質(zhì)粒純化技術(shù)如Marligen的High Purity Plasmid Purification System使用獨特的陰離子交換樹脂純化DNA,可以得到用于轉(zhuǎn)染的高質(zhì)量DNA。另外, Marligen的純化系統(tǒng)實驗步驟很簡單,可以在2小時內(nèi)完成?！舅矔r和穩(wěn)定表達

25、】DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達可以在1-4天內(nèi)檢測到。僅有一部分轉(zhuǎn)入細胞的DNA被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細胞質(zhì)進行蛋白合成。幾天內(nèi),大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細胞分裂而稀釋;一周后就檢測不到其存在了。瞬時表達分析檢測未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達。因此,表達水平與位置無關(guān),不會受到周圍染色體元件的影響。瞬時表達分析所需的人力和時間比穩(wěn)定表達少,但因為DNA攝入效率和表達水平在不同實驗中差異較大,實驗必須很小心。為了進行穩(wěn)定表達,轉(zhuǎn)入的基因必須能和細胞同步復(fù)制。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時就會如此。在一小部分轉(zhuǎn)染的細胞中,加入的DNA通過重組整合到基因組上。包含

26、整合DNA的細胞很少,必須通過對藥物的抗性篩選進行擴增或通過表型變化進行鑒定。穩(wěn)定基因表達實驗需要數(shù)周,如果需要驗證蛋白產(chǎn)量,所需的時間更長。但得到的細胞系可以做為蛋白生產(chǎn)的穩(wěn)定來源或用于得到轉(zhuǎn)基因動物。【瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測】基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢允褂脠蟾婊騺泶_定優(yōu)化條件,其表達蛋白易檢測,在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT,綠色熒光蛋白(GFP,熒光素酶(Lux或Luc以及b- 半乳糖苷酶(b-gal?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染

27、效率和活性。pCMV-SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ 基因,轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟,可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法?！痉€(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的篩選】連同帶有藥物抗性的篩選標記基因一起轉(zhuǎn)染目的基因是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系最常用的方法。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(APH或neor可以合成APH酶,通過磷酸化使藥物失活,從而提供對GENETCIN選擇性抗生素(G418 Sulfate的抗性?？股乜剐曰蚩梢耘c目的基因在同一個質(zhì)粒上,也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個不同的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染,兩個質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染,

28、帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。陽離子脂質(zhì)體試劑提供了一種建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的高效方法。瞬時轉(zhuǎn)染效率的改進一般也會提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。比如,使用LIPOFECTAMINE PLUS試劑得到的NIH 3T3細胞GENETICIN抗生素抗性克隆的數(shù)目比單獨使用LIPOFECTAMINE增加了大約3倍。要進行穩(wěn)定的表達分析,在轉(zhuǎn)染后次培養(yǎng)細胞,低密度鋪板,給予生長空間,在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力。生長的細胞比不分裂的細胞更快的受到GENETICIN抗生素的影響。轉(zhuǎn)染后,在開始篩選前等待48-72小時,使細胞表達足夠量的抗性酶,保證在開始篩選時可

29、以自我保護。轉(zhuǎn)染后48-72小時倒掉培養(yǎng)基,加入含有GENETICIN抗生素的培養(yǎng)基,抗生素的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定,足夠殺死未轉(zhuǎn)染細胞。因為許多因子影響到篩選所需的GENETICIN抗生素的最佳濃度,包括細胞類型,培養(yǎng)基和血清濃度等,所以有必要對每種細胞作一個劑量反應(yīng)曲線,確定最佳濃度(參見第7章實驗步驟。篩選最多可能需要一周時間,因為在致死劑量的GENETICIN抗生素存在條件下,細胞會分裂1-2次。在次培養(yǎng)細胞時使用較低劑量的抗生素,一般是篩選劑量的一半。篩選后的細胞一般是離散的克隆,根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?可以分別純化(克隆,收集進行大量培養(yǎng)或染色并進行抗性克隆的計數(shù)?！镜鞍妆磉_和培養(yǎng)基的

30、選擇】哺乳動物細胞系合成可溶的,翻譯后修飾的蛋白,比細菌,真菌或昆蟲細胞中表達的蛋白更有可能有生物活性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以合成大量的重組蛋白,而瞬時轉(zhuǎn)染細胞可以快速表達,迅速地合成小量蛋白。常用的細胞系包括CHO,293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F,293-H, COS-7和CHO-S細胞,來源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細胞系。這些細胞也可用于無血清和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細胞中進行。這些細胞易于生長到高密度并合成更多蛋白。使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長。用于蛋白生產(chǎn)的細胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進行。但

31、更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達蛋白,因為血清蛋白會干擾下游表達蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對某一特定細胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養(yǎng)基低得多。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇最適合您應(yīng)用的一種。在含血清時轉(zhuǎn)染的細胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基,無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基。在部分情況下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S,對于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細胞,可以使用其培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染。其他一些無血清培養(yǎng)基包含抑制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)

32、染的成分。在這些情況下,有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEM等培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR試劑是陽離子脂質(zhì)體N-1-2,3-Dioleyoxy, Propyl-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物1:1(w/w。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高,優(yōu)于磷酸鈣法,比它高5100倍,能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞。用LR進行轉(zhuǎn)染時,首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,應(yīng)找

33、出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,對每批LR都要做:第一,先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間,DNA可從15g和孵育時間6小時開始,按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者最佳的劑量,確定出轉(zhuǎn)染時間(2 24小時。因LR對細胞有一定的毒性,轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為宜。細胞種類:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat 等任何一種細胞均可作為受體細胞。1、操作步驟方法一:(1:取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿,向每孔中加入2mL 含12×105個液,37CO2培養(yǎng)至40%60%匯合時(匯合過分,轉(zhuǎn)染后不

34、利篩選細胞。(2轉(zhuǎn)染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10g DNA,終量100L,B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50gLR,終量100L,輕輕混合A、B液,室溫中置10-15分鐘,稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致,應(yīng)酌情減量。(3轉(zhuǎn)染準備:用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入1mL 不含血清培養(yǎng)液。(4轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37溫箱置624小時,吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(5其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。注意:轉(zhuǎn)染時切勿加血清,血清對轉(zhuǎn)

35、染效率有很大影響。2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下方法二:(1以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24小時,使其達到5060%板底面積。(2在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下:在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。旋轉(zhuǎn)1秒鐘,再加入脂質(zhì)體懸液,旋轉(zhuǎn)。室溫下放置510分鐘,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。(3棄去細胞中的舊液,用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物,37培養(yǎng)35小時。(4再于每孔中加入20%FCS的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)1424小時,(5吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%

36、FCS的DMEM,2mL/孔,再培養(yǎng)2448小時。(6用細胞刮或消化法收集細胞,以備分析鑒定。穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下:(1接種細胞同前,細胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。(2DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前(2、(3步驟。(3在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37培養(yǎng)48小時。(4吸出DMEM,用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細胞,使細胞生長一定時間,篩選轉(zhuǎn)染克隆,方法參照細胞篩選法進行。轉(zhuǎn)染實驗要注意的一些事項DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達可以在1-4天內(nèi)檢測到僅有一部分轉(zhuǎn)入細胞的DNA被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細胞質(zhì)進行蛋白合成。幾天內(nèi),大部分外源DNA會被核酸酶降

37、解或隨細胞分裂而稀釋;一周后就檢測不到其存在了。因此轉(zhuǎn)染也可以分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染(transient transfection指的是轉(zhuǎn)染的核酸不整合到染色體上,結(jié)果是短暫的高水平表達,可在2496小時內(nèi)檢測表達效果,表達水平與位置無關(guān),不會受到周圍染色體元件的影響。瞬時表達分析所需的人力和時間比穩(wěn)定表達少,但因為DNA攝入效率和表達水平在不同實驗中差異較大,不長久也不穩(wěn)定。超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更傾向于瞬時表達。瞬時表達適合研究啟動子等調(diào)控元件不過,誘導(dǎo)型的啟動子除外。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,就是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上,或者相當于附加子(episome可持續(xù)存在,使得轉(zhuǎn)染的細胞可長期表達。外源

38、基因整合的幾率很小,要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株,通常需要有篩選標記(比如抗性基因共同轉(zhuǎn)染,通過選擇壓力維持表達的穩(wěn)定不行的統(tǒng)統(tǒng)槍斃了。質(zhì)粒整合到染色體上本來就是件稀罕事兒,平均萬分之一的幾率,如果是線性化DNA轉(zhuǎn)染,那整合的幾率就高多了。不過怎么整合也就是一個或者有限的幾個拷貝,所以表達量往往比較不高的。但是,“壓倒一切的是'穩(wěn)定'”,很多時候,轉(zhuǎn)染后往往要進行穩(wěn)定表達的篩選。成功轉(zhuǎn)染第一步:細胞培養(yǎng)注意事項細胞系的選擇通常不是我們說了算的。有時是實驗的需要,有時是實驗室條件的限制。如果有選擇的余地當然挑個容易做的。越是接近體內(nèi)的真實情況的原代細胞,通常越是難于伺候。反之亦然。此外

39、細胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時需要根據(jù)細胞系來選擇合適的轉(zhuǎn)染方法;而有時一些啟動子在不同的細胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設(shè)計實驗時需要考慮的因素,姑且不論。不過因為受限于特定的細胞,如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了。因為不同的細胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實驗室已經(jīng)建立了全套方法,照做可也。如果是個新來的細胞株,最好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細胞株列表和文獻,看看其中是否有你的新對手這個FuGENE 6 比較有優(yōu)勢,已有750多種細胞系成功轉(zhuǎn)染的資料可供參考。當實驗進行到轉(zhuǎn)染這一步時需要注意的因素有哪些呢?一、健康而茁壯成長的細

40、胞轉(zhuǎn)染前細胞最好經(jīng)過12次傳代,以保證細胞生長旺盛,容易轉(zhuǎn)染。注意,貼壁細胞生長到幾乎匯片時就要趕快進行下一次傳代,千萬不要使細胞保持融合超過24小時。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如,新鮮融化的NIH 3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率(融化細胞的進一步傳代不會馬上降低轉(zhuǎn)染效率。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。二、恰到好處的鋪板密度轉(zhuǎn)染時的細胞密度對轉(zhuǎn)

41、染效率影響非常顯著。不同的轉(zhuǎn)染試劑,要求轉(zhuǎn)染時的最適細胞密度各不相同,即使同一種試劑,也會因不同的細胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時過高或者過低的細胞密度會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低,乃至表達水平偏低。因此如果選用新的細胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑,最好能夠進行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法,包括適當?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。一般轉(zhuǎn)染時貼壁細胞密度為40%-80%,但這個需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書陽離子脂質(zhì)體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數(shù),有的要求細胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%80%之間,總之是盡量在細胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染,以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。不同的

42、實驗?zāi)康囊矔绊戅D(zhuǎn)染時的鋪板密度,比如研究細胞周期相關(guān)基因等表達周期長的基因,就需要較低的鋪板密度,所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉(zhuǎn)染的試劑。需要特別注意。三、溫暖舒適的培養(yǎng)基健康的細胞培養(yǎng)是一切成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同的細胞類型有不同的特性,需要特定的培養(yǎng)基、血清、補充添加劑等等。血清血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率,老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染,對于某些對血清要求敏感的細胞來說是個難題。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天,對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說,血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率,甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率,比如FuGENE6、Effectene和GeneJu

43、ice等。對于多數(shù)可以在有血清條件下工作的轉(zhuǎn)染試劑來說,血清的存在會影響DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時用無血清培養(yǎng)基來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了,在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。這些方便好用、可在有血清條件下轉(zhuǎn)染的試劑包括前面介紹的Lipofectamine2000, FuGENE 6,GeneJuice,Effectene,Polyfect等等。最厲害的是Qiagen的2個產(chǎn)品,Polyfect和Effectene,全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作,包括稀釋步驟,不用擔心培養(yǎng)基的變化對細胞生長有什么不良影響了。這樣,就不再需要在轉(zhuǎn)染前多次洗細胞,

44、也就減少操作的復(fù)雜程度,更重要的是不必再讓細胞處于無血清的“悲慘環(huán)境”中轉(zhuǎn)染,不必擔心對血清缺乏很敏感的細胞受到不必要的麻煩了。嬌貴的細胞們,你們有福了。不過要特別注意:對于RNA轉(zhuǎn)染,如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關(guān)注的。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細胞轉(zhuǎn)染很有幫助?？股刂гw、細菌、真菌污染,無論對于細胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都可能會嚴重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果,細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染。但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素,就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這可

45、能間接導(dǎo)致細胞死亡,造成轉(zhuǎn)染效率低。所以,對于選擇Lipofectamine2000系列轉(zhuǎn)染試劑的實驗,要特別注意在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。這里又要表揚Qiagen的2個產(chǎn)品,Polyfect 和Effectene,因為全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作,很方便的。對于篩選穩(wěn)定表達株,要預(yù)留足夠的時間讓

46、抗性基因表達后再添加篩選壓力。其他添加物如抗生素,EDTA,檸檬酸鹽,磷酸鹽,RPMI,硫酸軟骨素,透明質(zhì)酸,硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖這些物質(zhì)的存在可能會干擾DNA和轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物的過程,要盡量避免。一、質(zhì)粒的構(gòu)建:啟動子的選擇啟動子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無甚影響,但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。啟動子可分為2大類:誘導(dǎo)型啟動子是比較精明的,平時歇著,一旦接到誘導(dǎo)信號指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動子比較老實的,就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種比如我們很熟悉的CMV啟動子,SV40,pMC1,PGK 啟動子等等。獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子

47、依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。在BHK-21中,CMV啟動子活性比其他啟動子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒啟動子在T 細胞來源的細胞系,如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子,而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細胞中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有T抗原(存在于COS-1和COS-7時會提高,因為T抗原可以刺激染色體外的合成。一個強悍的高表達組成型啟動子是我們做表達所求之不得的,但是對于轉(zhuǎn)染本身來說卻不一定好因為任何持續(xù)過高表達外源基因都

48、可能帶來某種程度的細胞毒性,影響細胞生長如果外源基因本身對細胞生長有毒,那更完蛋了,你很可能篩不到轉(zhuǎn)染成功的細胞株,更別提穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了因為過量表達本身可能已經(jīng)害死了那個轉(zhuǎn)染了的細胞,沒轉(zhuǎn)染的細胞又死于篩選壓力。這種時候一個不那么“能干”的啟動子可能更適合一些。如果你曾經(jīng)遇到原因不明的轉(zhuǎn)染失敗案例,會不會是這個原因呢?過猶不及就是這個道理咯。誘導(dǎo)型啟動子對于轉(zhuǎn)染來說,特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達可以受到我們的調(diào)控轉(zhuǎn)染的時候不表達,篩選穩(wěn)定表達株后再誘導(dǎo)表達,使得表達有毒性的基因或者精確分析表達產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)成為可能。多數(shù)誘導(dǎo)型啟動子在接受某種信號后“打開開關(guān)”開始工作,也有的相反,在缺失某種信號后打開開關(guān)。Clontech還有個誘導(dǎo)系統(tǒng)是“劑量依賴的”,就是說不單表達開關(guān)可控,表達量多少也可以通過誘導(dǎo)劑的量來調(diào)控。還有一種特殊的啟動子很好玩具有時序性或者組織特異性(空間特異性,會受到特定的元件調(diào)控,在一定的時間或者特定組織細胞中表達的,比如那個轉(zhuǎn)基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細胞中表達的啟動子有人說這是組成型的,我覺得應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,只不過誘導(dǎo)的因素我們不知道罷了,這類啟動子在不同的細胞中會有不同的表現(xiàn),需要注意。誘導(dǎo)系