免疫組化原理和步驟

1、免疫組化原理及步驟免疫組化操作規(guī)程 一、試驗(yàn)原理與意義 免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性奇妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。 二、試驗(yàn)器材 微波爐、吹風(fēng)機(jī)、組化筆、濕盒、烤箱、振蕩器、染缸、光學(xué)顯微鏡、純木漿衛(wèi)生紙、計(jì)時(shí)器和通風(fēng)櫥等。 三、試劑配制 1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaC

2、l + 50 ml 0.2 M PB 加雙蒸水至 1000 ml；1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 雙蒸水或190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。 2. Citrate Buffered Sali

3、ne（0.01 M 檸檬酸緩沖液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（檸檬酸）：10.5 g 加雙蒸水至 1000 ml；B.Citrate sodium（檸檬酸鈉）：29.41 g 加雙蒸水至 1000 ml）。 3. 細(xì)胞通透液：由終濃度分別為 0.3%雙氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加熱的 36 ml PBS，再接著加 120 ul TritonX-100,并加熱一兒，冷卻至臨用前加 0.4 ml 30H 2 O 2 。 4. 5羊血清或封閉血清，用 PBS 稀釋。 5.

4、 含 0.03H 2 O 2 的 0.05DAB（避光）：用 20×DAB（1，10 mg/ml）5 ul0.1 ul 30% H 2 O 2 95 ul PBS。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀釋。 7. Xylene、梯度 Ethanol（100×2、95、80、70、50）、雙蒸水、中性樹(shù)膠（封裱劑）。 8. 蘇木精染液： 四、操作步驟 1 、脫蠟、水化 1) 60 ×20 minXylene 2 ×10 minutes； 2) 100% absolute ethanol：2 ×5 minutes； 3) 95% ethanol 2 m

5、inutes； 4) 80% ethanol 2 minutes； 5) 70% ethanol 2 minutes； 6) distilled water:5 min； 7) PBS 洗 3 次×3 min。 2、細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 8) 用封閉通透液浸潤(rùn)切片 30 min（RT 避光）。配法是用預(yù)熱 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加熱幾分鐘后，臨用前加 400 ul 30H 2 O 2 。 9) PBS 溶液洗 3 次×3 min。 3、抗原修復(fù)暴露抗原打算族 10) 切片放入 0.01 M 檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在

6、微波爐里高火 4 min 至沸騰后，再加熱約 6 min×4 次，每次間隔補(bǔ)足液體，防止干片。 4、封閉非特異性蛋白 11) PBS 溶液洗 3 次×3 min； 12) 將切片取出,四周水分用濾紙吸干,用組化筆在組織四周畫(huà)上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入 5%羊血清（與二抗來(lái)源全都）后放入濕盒中,室溫 30（1030）min； 5、一抗孵育 13) 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織四周殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1：250、500、1000）后，放入濕盒中室溫 1 小時(shí)，然后 4 度過(guò)夜，從冰箱中取出需37 復(fù)溫 45 min。 6、二抗孵育 14) 將一抗倒掉并用 PBS

7、洗 5 min×5 次； 15) 用濾紙將圓圈四周的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入 37 恒溫烤箱中 30 min（回收）。 16) 用 PBS 洗 5 次×5 min； 7、SP 反應(yīng) 17) 加入 SP 后放入 37 度烤箱中 30 min。 18) 用 PBS 洗 5 次×5 min； 8、顯色 19) 加入 DAB（快速滴入，觀看染色狀況，倒掉染液），顯色時(shí)間把握在約 5 min（310 min），由鏡下觀看顏色把握時(shí)間。0.05DAB（避光）（1:20 儲(chǔ)備液）：5 ul 20×DAB0.1 ul 30% H 2 O 2 95 ul PBS。1

8、%DAB 儲(chǔ)備液的制:50mgDAB+5ml 0.05 mol/L PBS 充分溶解，-20 保存。 9、復(fù)染、脫水、透亮、封片 20) 用 PBS 3 次×3min 后，用雙蒸水洗 5 min； 21) 加一大滴蘇木素染液，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染 20 s 后自來(lái)水沖洗，雙蒸水洗 5 min，再用 PBS 返藍(lán) 5 min。 22) 脫水： 50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min；

9、100% absolute ethanol: (1-2) min。 23) 透亮：Xylene 1×(1-2) minXylene 2×(1-2) min 24) 封片：中性樹(shù)膠。 五、留意事項(xiàng) 1. 蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索，尤其陽(yáng)性染色也在細(xì)胞核上。 2. DAB 顯色時(shí)間需要達(dá)到最優(yōu)化，鏡下觀看達(dá)到陽(yáng)性染色明顯但背景不太深。 3. 抗體孵育時(shí)間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育最好在 4 度過(guò)夜。 4. 切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時(shí)要掩蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫(huà)圈時(shí)盡量畫(huà)大一點(diǎn)，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。 5. 片子著色不均勻的

10、緣由如下： 脫蠟不充分。可以 60 烤 20 min，馬上放入新穎的 xylene1； 水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新穎的梯度乙醇； 抗體沒(méi)混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑； 抗體孵育時(shí)，切片放傾斜； 抗體孵育后 PBS 沖洗不充分。 制片厚薄不均勻等問(wèn)題。染片盒不平，切片傾斜。 6. 一抗從 4 拿出后，為什么有人說(shuō)要 37 度復(fù)溫，目的是什么？ 一方面，防止切片從 4 直接放入 PBS 易脫片； 另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 和 37 度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。 7.切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？ 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)把握； 一抗用多克隆抗體易消滅非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看； 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背