高效液相色譜分析方法及注意事項

1、高效液相色譜分析方法及注意事項l（1）峰形前拖l主要有以下3種：l 第一種比較明顯一些，后兩種容易讓人懷第一種比較明顯一些，后兩種容易讓人懷疑是否分開疑是否分開l原因及解決辦法原因及解決辦法l1）、是否過載）、是否過載l 出現(xiàn)平頭峰，峰高超過去時出現(xiàn)平頭峰，峰高超過去時2000mAU或峰或峰很高同時前拖、后拖很高同時前拖、后拖可能過在載可能過在載l 還與化合的在某一波長處的有為收收強(qiáng)弱還與化合的在某一波長處的有為收收強(qiáng)弱有關(guān)；如果在該波長處的吸收弱，即使高濃度有關(guān)；如果在該波長處的吸收弱，即使高濃度下峰高不高，因此判斷是否過載應(yīng)該結(jié)合濃度、下峰高不高，因此判斷是否過載應(yīng)該結(jié)合濃度、進(jìn)樣體積和峰

2、形一起判斷，通常認(rèn)為峰高在進(jìn)樣體積和峰形一起判斷，通常認(rèn)為峰高在100mAU比較合適比較合適l2）是否流動相溶解）是否流動相溶解l 不用流動相溶解的相品易產(chǎn)生溶劑峰和前不用流動相溶解的相品易產(chǎn)生溶劑峰和前拖拖l 以姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品測定為例：以姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品測定為例：l 樣品溶劑為甲醇、流動相為乙腈：樣品溶劑為甲醇、流動相為乙腈： 4% 冰冰醋酸水溶液醋酸水溶液=48：52l 原因：進(jìn)針后在流動相推動下，樣品溶液原因：進(jìn)針后在流動相推動下，樣品溶液很快到達(dá)色譜柱，此時樣品溶液未被流動相很很快到達(dá)色譜柱，此時樣品溶液未被流動相很快稀釋，作為溶劑的甲醇局部濃度過大，由于快稀釋，作為溶劑的甲醇局部濃度過大，

3、由于甲醇洗脫能力比流動樣強(qiáng)，因此甲醇帶著部分甲醇洗脫能力比流動樣強(qiáng)，因此甲醇帶著部分樣品提前樣品提前l(fā)進(jìn)入到了填料里面，而另一部分樣品還沒有進(jìn)進(jìn)入到了填料里面，而另一部分樣品還沒有進(jìn)入醇填料周圍的環(huán)境就發(fā)生變化入醇填料周圍的環(huán)境就發(fā)生變化 由甲醇變由甲醇變成了流動相，所以一部分樣品提前被甲醇帶出成了流動相，所以一部分樣品提前被甲醇帶出來而別一部分沒有，導(dǎo)致濃度分布發(fā)生變化，來而別一部分沒有，導(dǎo)致濃度分布發(fā)生變化，濃度中心偏離了正常峰的位置。同時作為樣品濃度中心偏離了正常峰的位置。同時作為樣品溶劑的甲醇畢竟有限，只有幾十微升，只能帶溶劑的甲醇畢竟有限，只有幾十微升，只能帶著很少一部分樣品提前進(jìn)入

4、填料。著很少一部分樣品提前進(jìn)入填料。l 用流動相溶解樣品則不會產(chǎn)生這一現(xiàn)象用流動相溶解樣品則不會產(chǎn)生這一現(xiàn)象l解決辦法：解決辦法：l 用流動相將原樣品稀釋至原來濃度的確良用流動相將原樣品稀釋至原來濃度的確良1/4倍（體積比，原樣品溶液：流動相倍（體積比，原樣品溶液：流動相=1：3混混合）就可以達(dá)到和用流動相溶解相似的效果，合）就可以達(dá)到和用流動相溶解相似的效果，l 例子如下例子如下l 有時侯同樣是用強(qiáng)溶劑溶解，在有些色譜有時侯同樣是用強(qiáng)溶劑溶解，在有些色譜柱中產(chǎn)生前拖，而另一些色譜柱中沒有柱中產(chǎn)生前拖，而另一些色譜柱中沒有l(wèi) 原原 因因:填料沒有封尾，裸硅膠殘留了大填料沒有封尾，裸硅膠殘留了大

5、量硅羥基，其對水分子具有很強(qiáng)的吸附能力，量硅羥基，其對水分子具有很強(qiáng)的吸附能力，硅膠表面吸附的水對所進(jìn)樣品溶液產(chǎn)生了一種硅膠表面吸附的水對所進(jìn)樣品溶液產(chǎn)生了一種稀釋作用，使附帶樣品的甲醇失去了相對較強(qiáng)稀釋作用，使附帶樣品的甲醇失去了相對較強(qiáng)的洗脫能力，不再帶著部分樣品進(jìn)入填料，而的洗脫能力，不再帶著部分樣品進(jìn)入填料，而是均均的進(jìn)入到色譜是均均的進(jìn)入到色譜 填料中，樣品在色譜柱中填料中，樣品在色譜柱中的濃度分布未能產(chǎn)生偏移，因出來的是正常峰的濃度分布未能產(chǎn)生偏移，因出來的是正常峰 l3）增加流動相中緩沖鹽的濃度）增加流動相中緩沖鹽的濃度l 可減少因靜電的作用（可能存在于樣品分可減少因靜電的作用（

6、可能存在于樣品分子之間，或樣品他子與填料表面之間）引起前子之間，或樣品他子與填料表面之間）引起前拖。拖。l 例子如下：例子如下：l4）流動相中加適入適量的四氫呋喃）流動相中加適入適量的四氫呋喃l 加入少量的四氫呋喃可以改善峰形，增大加入少量的四氫呋喃可以改善峰形，增大分離度。通常加入量在分離度。通常加入量在5%以內(nèi)即可，需要時以內(nèi)即可，需要時可以加入更大的量。可以加入更大的量。l 機(jī)理：很少人提及機(jī)理：很少人提及l(fā)5）升高柱溫）升高柱溫l 升溫有助于增加流動相傳質(zhì)速率，減少因升溫有助于增加流動相傳質(zhì)速率，減少因靜電作用引起的前拖，但溫度不宜太高，否則靜電作用引起的前拖，但溫度不宜太高，否則容易

7、損傷色譜柱，特別是含有離子對試劑的時容易損傷色譜柱，特別是含有離子對試劑的時侯，最好不要超過硬侯，最好不要超過硬40l（2）峰形后拖l 常見拖尾如下：l 硅膠表面殘留的硅羥基對樣品的次保留效硅膠表面殘留的硅羥基對樣品的次保留效應(yīng)是導(dǎo)致峰形后拖的主要原因應(yīng)是導(dǎo)致峰形后拖的主要原因l C18長鏈?zhǔn)欠菢O性，其與樣品分子的相互長鏈?zhǔn)欠菢O性，其與樣品分子的相互作用力是范德華力作用力是范德華力作用力很微弱作用力很微弱l 硅羥基具有一定極性硅羥基具有一定極性Si-O -H + ，在一定，在一定條件下甚至還會發(fā)生電離形成條件下甚至還會發(fā)生電離形成Si-O-形式的離子形式的離子態(tài)，對極性化合物之間的作用力是靜電

8、作用態(tài)，對極性化合物之間的作用力是靜電作用力力作用力強(qiáng)作用力強(qiáng)l 由于空間位阻作為，樣品分子能接觸到殘由于空間位阻作為，樣品分子能接觸到殘余硅羥基的機(jī)會不多，只有少部分分子才能與余硅羥基的機(jī)會不多，只有少部分分子才能與殘余殘余l(xiāng)硅羥基產(chǎn)生作用。大多數(shù)分子如非極性分子一樣均勻硅羥基產(chǎn)生作用。大多數(shù)分子如非極性分子一樣均勻前移，而少量的樣品分子由于這種靜電作用力的存在前移，而少量的樣品分子由于這種靜電作用力的存在而被推遲洗脫出來，導(dǎo)致樣品分子的濃度分布發(fā)生變而被推遲洗脫出來，導(dǎo)致樣品分子的濃度分布發(fā)生變化，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴(yán)重的程度與樣品分子極性大小化，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴(yán)重的程度與樣品分子極性大小和殘

9、留硅羥的多少有著直接的關(guān)系。和殘留硅羥的多少有著直接的關(guān)系。l 硅羥基的硅羥基的pKa約為，有一定酸性。根據(jù)電離規(guī)約為，有一定酸性。根據(jù)電離規(guī)律，流動相的律，流動相的pH pKa2即即pH 時，時，99%以上的硅以上的硅羥基呈離子態(tài)，即羥基呈離子態(tài)，即Si-O- ，而，而 pKa pH 2即即pH時，時，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99%以上的硅羥基呈以上的硅羥基呈分子態(tài)，即分子態(tài)，即Si-O-H，但其極性仍然存在，即，但其極性仍然存在，即Si-O -H +l原因及解決辦法原因及解決辦法l1）、樣品是否過載（見前拖）、樣品是否過載（見前拖）l 如果發(fā)現(xiàn)過載，需降低進(jìn)

10、樣量（包括進(jìn)樣如果發(fā)現(xiàn)過載，需降低進(jìn)樣量（包括進(jìn)樣體積和濃度），一般而言，進(jìn)樣量越小，峰形體積和濃度），一般而言，進(jìn)樣量越小，峰形越好越好。l2）、往流動相中加入酸、堿）、往流動相中加入酸、堿l 酸性化合物：往流動相加入酸，將流動相酸性化合物：往流動相加入酸，將流動相pH調(diào)節(jié)至以下，有助于改善對帶羧基化合物調(diào)節(jié)至以下，有助于改善對帶羧基化合物的拖尾。的拖尾。l 如二甲基苯氧乙酸的測定。如二甲基苯氧乙酸的測定。 加入酸調(diào)節(jié)加入酸調(diào)節(jié)pH至，至，一方面抑制了硅羥基的離子化，另一方面也抑制了有一方面抑制了硅羥基的離子化，另一方面也抑制了有機(jī)酸的離子化，因而消弱了機(jī)酸的離子化，因而消弱了-COO 與與

11、Si-O -H +的相互的相互作用，減小脫尾。作用，減小脫尾。l 堿性化合物堿性化合物:容易發(fā)生拖尾的化合物中通容易發(fā)生拖尾的化合物中通常包含常包含-NH2、-NHR、-NR2，即伯、仲、叔三，即伯、仲、叔三種電荷的極性基團(tuán)，即伯、仲、叔三種富含電種電荷的極性基團(tuán)，即伯、仲、叔三種富含電荷的極性基團(tuán)，堿性強(qiáng)弱為荷的極性基團(tuán)，堿性強(qiáng)弱為-NH2 -NHR-NR2 ，其堿性強(qiáng)弱與，其堿性強(qiáng)弱與N原子直接連接的基團(tuán)原子直接連接的基團(tuán)有關(guān)：有關(guān)：l 吸電子基團(tuán)削弱堿性吸電子基團(tuán)削弱堿性l 供電子基團(tuán)（如烷基）增強(qiáng)堿性供電子基團(tuán)（如烷基）增強(qiáng)堿性 l 伯安中甲胺的堿性最弱，伯安中甲胺的堿性最弱，pKa為

12、為l pH，99%呈離子狀態(tài)呈離子狀態(tài)l 特別量，氨基化合物、硅羥基均以離子狀特別量，氨基化合物、硅羥基均以離子狀態(tài)態(tài)NH3+和和Si-O-存在，相互吸引的靜電作用導(dǎo)存在，相互吸引的靜電作用導(dǎo)致拖尾致拖尾 l 很多堿性化合物在的條件下容易產(chǎn)生拖尾。很多堿性化合物在的條件下容易產(chǎn)生拖尾。l 阿米替林阿米替林含含N（CH3）2），堿性比），堿性比-NH2強(qiáng)強(qiáng)，在條件下的拖尾情況評價色譜柱的優(yōu)劣，在條件下的拖尾情況評價色譜柱的優(yōu)劣，峰形越好，說明封尾越好。峰形越好，說明封尾越好。l 而而pH條件下，也仍后拖，因為條件下，也仍后拖，因為-NH3足足夠強(qiáng)，即使硅羥基以分子狀態(tài)存在仍能與夠強(qiáng)，即使硅羥基以

13、分子狀態(tài)存在仍能與Si-O -H +中氧原子產(chǎn)生吸引作用，導(dǎo)致峰形拖尾。中氧原子產(chǎn)生吸引作用，導(dǎo)致峰形拖尾。l 當(dāng)當(dāng)pH，99%甲胺以分子狀態(tài)存在，不會甲胺以分子狀態(tài)存在，不會引起拖尾。因此分析有些堿性化合物，流動相引起拖尾。因此分析有些堿性化合物，流動相的的pH需要調(diào)致強(qiáng)堿性條件下峰形才會變好。需要調(diào)致強(qiáng)堿性條件下峰形才會變好。l3 3）、增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度）、增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度l 加入緩沖鹽，可增強(qiáng)流動相的離子強(qiáng)度，在加入緩沖鹽，可增強(qiáng)流動相的離子強(qiáng)度，在NHNH3 3+ +和和Si-OSi-O- -之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與之間存在著許多離子的干擾，減

14、少了樣品分子與硅羥基之間的互相作用，有助于削弱極性基團(tuán)與硅羥硅羥基之間的互相作用，有助于削弱極性基團(tuán)與硅羥基之間的相互作用，改善峰形?；g的相互作用，改善峰形。l 適合于堿性較弱（氨基的適合于堿性較弱（氨基的N N原子與強(qiáng)吸電子基相原子與強(qiáng)吸電子基相連），或堿性很強(qiáng)，但在剛性結(jié)構(gòu)中，比較難以接近連），或堿性很強(qiáng)，但在剛性結(jié)構(gòu)中，比較難以接近被被C18C18長鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基。長鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基。l 如高烏甲素的測定：如高烏甲素的測定：l 雖然加入了三乙胺，但雖然加入了三乙胺，但 200ml200ml僅加入僅加入75ul75ul，量非常少，起不到屏蔽硅羥基的作用。因此峰量非常少

15、，起不到屏蔽硅羥基的作用。因此峰形的改變，主要是緩沖鹽的加入形的改變，主要是緩沖鹽的加入l4）、流動相中加入三乙胺）、流動相中加入三乙胺l 三乙胺能屏蔽硅羥基，減少堿性化合物和三乙胺能屏蔽硅羥基，減少堿性化合物和硅羥基的相互接觸機(jī)會，失去了導(dǎo)致拖尾的作硅羥基的相互接觸機(jī)會，失去了導(dǎo)致拖尾的作用位點用位點l 三乙胺的三乙胺的pKa為，在為，在pH的條件下，以離的條件下，以離子狀態(tài)子狀態(tài)N+H（NCH2CH3）3的形式存在，在的形式存在，在pH在硅羥基呈在硅羥基呈Si-OSi-O- -離子態(tài)的情況下，兩者容易離子態(tài)的情況下，兩者容易形成相對較強(qiáng)的靜電吸引力，平衡柱子的過程形成相對較強(qiáng)的靜電吸引力，

16、平衡柱子的過程中已經(jīng)優(yōu)先占據(jù)了硅羥基的作用位點，而帶氨中已經(jīng)優(yōu)先占據(jù)了硅羥基的作用位點，而帶氨基的樣品分子雖然在該條件下也呈基的樣品分子雖然在該條件下也呈l離子狀態(tài)離子狀態(tài)-N+H3、-N+H2R、-N+HR2，也能與，也能與Si-OSi-O- -形成較強(qiáng)的靜電引力，但三乙胺有先占形成較強(qiáng)的靜電引力，但三乙胺有先占住位的優(yōu)勢，使樣品與硅羥基的作用大大減弱，住位的優(yōu)勢，使樣品與硅羥基的作用大大減弱，緩解了拖尾的產(chǎn)生；同時緩解了拖尾的產(chǎn)生；同時N+H（NCH2CH3）3與樣品分子中的極性基團(tuán)與硅羥基的相與樣品分子中的極性基團(tuán)與硅羥基的相 互產(chǎn)生互產(chǎn)生競爭，更進(jìn)一步削弱了樣品分子與硅羥基的接競爭，更進(jìn)一步削弱了樣品分子與硅羥基的接觸機(jī)會，改善峰形。觸機(jī)會，改善峰形。l 如頭孢噻肟鈉的測定。如頭孢噻肟鈉的測定。l 通常加入通常加入2%的三乙胺有顯著的改善效果的三乙胺有顯著的改善效果 ，如有需要可適當(dāng)增大用量。如有需要可適當(dāng)增大用量。l 注意事項：注意事項：l 三乙胺堿性很強(qiáng)，防止加入后流動相的三乙胺堿性很強(qiáng)，防止加入后流動相的pH超出色譜柱的使用范圍；同時也會導(dǎo)致出超出色譜柱的使用范圍；同時也會導(dǎo)致出峰時間的顯著變化，建議加入三乙胺后回調(diào)至峰時間的顯著變化，建議加入三乙胺后回調(diào)至示加入前的示加入前的pH，但保留時間仍會有