MTT法檢測細胞存活及生長

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上【分享】MTT法檢測細胞存活及生長什么是MTT?MTT全稱為-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。什么是MTT法?又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定

2、其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。 缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。 MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 避光保存即可。在

3、配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對

4、菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4定容1LMTT法實驗步驟（一）貼壁細胞1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.、5%CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，

5、次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況3.、5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、

6、二甲基亞砜）（二）懸浮細胞：1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)⒀a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 lmg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10ul；細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100m(儲存液100 1640）。2、置37，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用

7、WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。5、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復孔。MTT法檢測細胞存活和生長作者：佚名 文章來源： 點擊數(shù)：3520 更新時間：2009-9-29 8:10:36     

8、 MTT全稱為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。什么是MTT法?又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT

9、結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。 缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。 MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。需要注意的是，MT

10、T法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟

11、時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4定容1LMTT法實驗步驟貼壁細胞：1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.、5%CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)

12、3-5個復孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況3.、5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細胞：1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞

13、懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)⒀a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10ul；細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ml 1640）。2、置37，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測

14、儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。5、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復孔。MTT 法檢測細胞存活率或抑制率 基本原理: 基本原理 MTT 分析法以活細胞代謝物還原劑 3-(4,5)-dimethyl thiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide

15、, MTT 噻唑藍為基礎(chǔ)。MTT 為黃色化合物，是一種接受氫離子的染 料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和 細胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環(huán)開裂，生成藍色的 formazan 結(jié)晶，formazan 結(jié)晶的生成量僅與活細胞數(shù)目成 正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原）。還 原生成的 formazan 結(jié)晶可用 DMSO（分析純）來溶解。利用 酶標儀測定 490 nm 處的光密度 OD 值， 以反映出活細胞數(shù)目。試劑配制： 試劑配制： MTT 溶液： pH=7.4 的 PBS 配制成 5mg/ml 濃度的溶液， 用 避光保存) MTT 法檢測細胞

16、存活率或抑制率詳細步驟 1 接種細胞：用含 10胎/小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細 胞懸液，以每孔 10 -10 個細胞接種到 96 孔板，每孔體積 100-200l. 2:培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng) 1-2 天（原代細胞不 同，可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間，神經(jīng)元 7-10 35天，心肌細胞 8-14 天） 。 3 吸去原培養(yǎng)基， 每孔加入以無血清培養(yǎng)基配制的不同濃 度藥物（原代細胞例外） 。 4 培養(yǎng) 24 或 48h 后， 每孔加 MTT 溶液 （5mg/ml， pH=7.4 用 的 PBS 配制，避光保存)10-20l.（每孔培養(yǎng)基為 100 l，加 10l，每孔培養(yǎng)基為 200l，則加 20l） 。 5 37繼續(xù)孵育 4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清 液（對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液） 。 6 每孔加 150ul DMSO，振蕩 10min，使結(jié)晶物充分融解。 7 比色：選擇 490nm 波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔 光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐 標繪制曲線。 注意事項： 注意事項： （1）MTT 粉末和溶液保存時都需要避