血清學(xué)診斷技術(shù)

1、血清學(xué)診斷技術(shù) 一一 原原 理理 許多病毒具有凝集動(dòng)物紅細(xì)胞的能力許多病毒具有凝集動(dòng)物紅細(xì)胞的能力, , 這種凝集能這種凝集能力可被相應(yīng)的抗體所抑制力可被相應(yīng)的抗體所抑制, , 故可用已知病毒檢測(cè)相應(yīng)的血凝故可用已知病毒檢測(cè)相應(yīng)的血凝抑制抗體抑制抗體 . . 也可以用已知標(biāo)準(zhǔn)抗體對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定也可以用已知標(biāo)準(zhǔn)抗體對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定. .紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn) 二二 使用范圍使用范圍 新城疫、新城疫、禽流感、禽流感、減蛋綜合征、減蛋綜合征、雞毒支原體、雞毒支原體、滑液囊支原體等病原微生物感染后的抗體檢測(cè)；或相應(yīng)病原分離后滑液囊支原體等病原微生物感染后的抗體檢測(cè)；或相應(yīng)病原分

2、離后的鑒定的鑒定 三三 器材器材1.1.血凝板、血凝板、2.2.微量移液器微量移液器3.3.標(biāo)準(zhǔn)抗原標(biāo)準(zhǔn)抗原 4.1%4.1%紅細(xì)胞懸浮液紅細(xì)胞懸浮液 5.5.被檢血清被檢血清 6.6.稀釋液稀釋液 四四 操作程序操作程序（一）（一）0.50.5紅細(xì)胞的準(zhǔn)備紅細(xì)胞的準(zhǔn)備 1. 1.阿氏液阿氏液( (抗凝劑抗凝劑) )的配制的配制 葡萄糖葡萄糖1.8661.866 檸檬酸鈉檸檬酸鈉0.80.8 檸檬酸檸檬酸0.0550.055 氯化鈉氯化鈉 0.418g 0.418g 蒸餾水蒸餾水 100ml 100ml 混勻放入混勻放入100 ml100 ml葡萄糖瓶內(nèi)，葡萄糖瓶內(nèi)，1010磅磅115115度

3、度1010分鐘分鐘 高壓滅菌。冷卻后高壓滅菌。冷卻后44保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?.2.采血采血 取健康雞翅靜脈或心臟采血，取健康雞翅靜脈或心臟采血，( (按阿氏液按阿氏液2 2份，血液份，血液1 1份）份）注意注意:(1). :(1). 兩只健康的雞血混合兩只健康的雞血混合; ; (2). (2). 阿氏液的量要夠阿氏液的量要夠3. 3. 紅細(xì)胞懸液的配制：紅細(xì)胞懸液的配制： 將血液注入離心管中，經(jīng)將血液注入離心管中，經(jīng)30003000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分鐘，離心分鐘，離心5-5-1010分鐘，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，分鐘，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將沉淀的細(xì)胞加稀釋液

4、（生理鹽水）洗滌，再用離心機(jī)將沉淀的細(xì)胞加稀釋液（生理鹽水）洗滌，再用離心機(jī)30003000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分鐘離心分鐘離心5-105-10分鐘，充去上清液，再加稀釋液分鐘，充去上清液，再加稀釋液洗滌，洗滌， 如此反復(fù)洗滌三次，將最后一次離心后的紅細(xì)如此反復(fù)洗滌三次，將最后一次離心后的紅細(xì)胞，按胞，按1%1%的稀釋度加入稀釋液（的稀釋度加入稀釋液（1 1毫升紅細(xì)胞泥加毫升紅細(xì)胞泥加9999毫毫升稀釋液）。升稀釋液）。( (二二) )被檢血清被檢血清 將被檢雞群編號(hào)登記，用消毒過的干燥注射器采血，注入將被檢雞群編號(hào)登記，用消毒過的干燥注射器采血，注入潔凈干燥試管內(nèi)（微量法可用孔經(jīng)潔凈干燥試管內(nèi)（微量法

5、可用孔經(jīng)2-32-3毫米塑料管由翅靜脈采毫米塑料管由翅靜脈采血），在室溫中靜置或離心，待血清析出后使用。血），在室溫中靜置或離心，待血清析出后使用。 注意注意: : 每只雞應(yīng)更換一個(gè)注射器，嚴(yán)禁交叉使用。每只雞應(yīng)更換一個(gè)注射器，嚴(yán)禁交叉使用。 ( (三）三） 血凝抗原效價(jià)測(cè)定血凝抗原效價(jià)測(cè)定 （操作量（操作量25ul25ul）(1)(1)抗原抗原 一般以雞新城疫一般以雞新城疫IIII系或系或LasotaLasota系作為已知抗原。系作為已知抗原。 來源來源: : 1). 1).購買購買: : 目前也有用聚乙二醇使目前也有用聚乙二醇使LasotaLasota系病毒液濃縮，作系病毒液濃縮，作 成穩(wěn)

6、定濃縮抗原，成穩(wěn)定濃縮抗原，HAHA效價(jià)達(dá)效價(jià)達(dá)1 1：50005000以上，以上，44半年半年 不變。不變。 2) 2) 自制自制: :A. A. 用雞新城疫用雞新城疫IIII系或者系或者LasotaLasota系疫苗接種雞胚制備抗原：系疫苗接種雞胚制備抗原：B. B. 疫苗用滅菌生理鹽水稀釋疫苗用滅菌生理鹽水稀釋1010倍，以倍，以0.10.1毫升接種于毫升接種于1010日齡的雞胚日齡的雞胚尿囊內(nèi)尿囊內(nèi); ;C. C. 凡接種后凡接種后72-12072-120小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，且病變顯著者，分別收獲小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，且病變顯著者，分別收獲雞胚尿囊液于消毒試管內(nèi)，如有血細(xì)胞應(yīng)離心（雞胚尿囊液

7、于消毒試管內(nèi)，如有血細(xì)胞應(yīng)離心（20002000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分鐘）分鐘）1515分鐘，取上清液分鐘，取上清液; ;D. D. 作作HAHA試驗(yàn)，其凝集價(jià)在試驗(yàn)，其凝集價(jià)在1 1：640640以上的雞胚雞，分裝于潔凈以上的雞胚雞，分裝于潔凈干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱備用。干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱備用。 2.2.抗原血凝價(jià)的測(cè)定抗原血凝價(jià)的測(cè)定每種抗原做兩排，結(jié)果取均值每種抗原做兩排，結(jié)果取均值 1). 1-12 1). 1-12孔加生理鹽水孔加生理鹽水25ul25ul 2). 2). 第第1 1孔加抗原孔加抗原25ul25ul，反復(fù)吹打，反復(fù)吹打1010次吸取次吸取25ul25ul到第到第2

8、 2孔，孔，依此類推倍比稀釋至第依此類推倍比稀釋至第1111孔孔 3). 3). 最后從第最后從第1111孔吸取孔吸取25ul25ul棄去棄去, ,第第1212孔做生理鹽水對(duì)照孔做生理鹽水對(duì)照 4). 4). 所有孔加所有孔加25ul 125ul 1紅細(xì)胞紅細(xì)胞 5). 5). 將血凝板振蕩將血凝板振蕩1 1分鐘分鐘 6 6 新城疫病毒室溫（新城疫病毒室溫（18221822）作用）作用 30 30分分; ; 禽流感病毒禽流感病毒3737作用作用3030分分. .夏季結(jié)果出現(xiàn)快，冬季較慢夏季結(jié)果出現(xiàn)快，冬季較慢 新城疫病毒時(shí)間長，溫度高易發(fā)生洗脫新城疫病毒時(shí)間長，溫度高易發(fā)生洗脫 7 7 結(jié)果判

9、定結(jié)果判定 1). 1).完全凝集孔為終點(diǎn)完全凝集孔為終點(diǎn) 2). 2).將血凝板成將血凝板成4545角豎立觀察角豎立觀察 3). 3).紅細(xì)胞呈淚滴狀沉淀為不凝集紅細(xì)胞呈淚滴狀沉淀為不凝集 4). 4).孔底沒有紅細(xì)胞沉淀孔底沒有紅細(xì)胞沉淀, ,紅細(xì)胞均勻平鋪于孔底為凝紅細(xì)胞均勻平鋪于孔底為凝集集, ,此孔稀釋倍數(shù)為此孔稀釋倍數(shù)為1 1個(gè)工作單位個(gè)工作單位孔孔 號(hào)號(hào)1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)5 5101020204040808016016032032064064012801280對(duì)照對(duì)照生理鹽水（毫升）生理鹽水（毫升）病毒液（毫升）病毒液（

10、毫升）4 4* *1 125252525252525252525252525252525252525252525252525252525252525252525(25)(25)棄去棄去生理鹽水（毫升）生理鹽水（毫升）25252525252525252525252525252525252525250.5%0.5%紅細(xì)胞液紅細(xì)胞液（毫升）（毫升）2525252525252525252525252525252525252525作用溫度與時(shí)間作用溫度與時(shí)間混合均勻置混合均勻置18221822作用作用45604560分鐘，對(duì)照管出現(xiàn)結(jié)果時(shí)判定分鐘，對(duì)照管出現(xiàn)結(jié)果時(shí)判定結(jié)果（舉例）結(jié)果（舉例）+ +- -

11、 -雞新城疫紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（雞新城疫紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HAHA試驗(yàn)）試驗(yàn)） ( (過程圖過程圖) )注意注意 能使雞紅細(xì)胞完能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒液全凝集的病毒液的最高稀釋倍數(shù)，的最高稀釋倍數(shù)，稱為該病毒液的稱為該病毒液的紅細(xì)胞凝集效價(jià)。紅細(xì)胞凝集效價(jià)。如上例，病毒病如上例，病毒病的的HAHA效價(jià)為效價(jià)為1 1：320320。 （四（四) ) 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn) 1. 抗原準(zhǔn)備（工作濃度的準(zhǔn)備 ） 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HIHI試驗(yàn)）時(shí)，病毒抗原液試驗(yàn)）時(shí)，病毒抗原液2525ul內(nèi)需含內(nèi)需含4 4個(gè)凝集單位，所以，應(yīng)將原菌抗原毒作成個(gè)凝集單位，所以，應(yīng)將原

12、菌抗原毒作成320/4=80320/4=80倍稀釋。倍稀釋。 2 2 操作步驟操作步驟 (1) (1) 每孔加每孔加25ul25ul的稀釋液的稀釋液: :(2)(2) 第第1 1孔加孔加25ul25ul待檢血清，反復(fù)吸吹待檢血清，反復(fù)吸吹1010次次; ; 吸取吸取25ul25ul于第于第(3)(3) 2 2孔，以此類推倍比稀釋至第孔，以此類推倍比稀釋至第1111孔孔; ; 最后從第最后從第1111孔取孔取2 2 (4)(4) 5ul 5ul棄去棄去, ,第第1212孔為抗原對(duì)照孔為抗原對(duì)照; ;(3) (3) 每孔加每孔加4 4單位抗原單位抗原; ;室溫下室溫下( 18-22)( 18-22

13、)作用作用3030分分(4) (4) 取取1 1紅細(xì)胞紅細(xì)胞25ul25ul加于各孔中加于各孔中(5) (5) 將血凝板振蕩將血凝板振蕩1 1分鐘分鐘(6) (6) 室溫作用室溫作用30-4530-45分鐘（禽流感分鐘（禽流感 37 37）觀察結(jié)果）觀察結(jié)果(7) (7) 結(jié)果判定結(jié)果判定 將血凝板呈將血凝板呈4545豎起觀察豎起觀察 完全抑制孔紅細(xì)胞呈淚滴樣下沉完全抑制孔紅細(xì)胞呈淚滴樣下沉, ,此孔為抑制終點(diǎn)此孔為抑制終點(diǎn). .雞新城疫紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（雞新城疫紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（H試驗(yàn)）試驗(yàn)） (過程圖過程圖)孔孔 號(hào)號(hào)1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010稀釋倍

14、數(shù)稀釋倍數(shù)對(duì)照對(duì)照生理鹽水生理鹽水待檢血清待檢血清25252525252525252525252525252525252525252525252525252525252525252525(25)(25)棄去棄去4 4單位抗原單位抗原25252525252525252525252525252525252525250.5%0.5%紅細(xì)胞紅細(xì)胞液（毫升）液（毫升）2525252525252525252525252525252525252525作用溫度與作用溫度與時(shí)間時(shí)間混合均勻置混合均勻置18-2218-22作用作用45-6045-60分鐘，對(duì)照管出現(xiàn)結(jié)果時(shí)判定分鐘，對(duì)照管出現(xiàn)結(jié)果時(shí)判定結(jié)果結(jié)果放室

15、溫作用分鐘單位：l 3. 3.結(jié)果報(bào)告結(jié)果報(bào)告(1).(1).雞的免疫臨界水平。雞的免疫臨界水平。(2).(2).雞群的雞群的HIHI抗體水平是以抽檢樣品的抗體水平是以抽檢樣品的HIHI抗體效價(jià)（抗體效價(jià)（log2log2） 的平均值表示的。的平均值表示的。(3).(3).檢樣中檢樣中HIHI抗體效價(jià)的最高值與最低值相差太大時(shí)，?？贵w效價(jià)的最高值與最低值相差太大時(shí)，。(4).(4).大型養(yǎng)雞場，每次進(jìn)行抽測(cè)時(shí)，抽樣率一般不低于大型養(yǎng)雞場，每次進(jìn)行抽測(cè)時(shí)，抽樣率一般不低于 0.1%-0.5% 0.1%-0.5%，小型雞群，抽樣率應(yīng)有所增加，一般認(rèn)為，小型雞群，抽樣率應(yīng)有所增加，一般認(rèn)為 理想的抽

16、樣率應(yīng)為理想的抽樣率應(yīng)為2%2%。(5(5）. .雞群接種新城疫疫苗后，經(jīng)雞群接種新城疫疫苗后，經(jīng)2-32-3周測(cè)血清中的周測(cè)血清中的HIHI抗體效抗體效 價(jià)若提高價(jià)若提高2 2個(gè)滴度以上，表示免疫應(yīng)答良好，疫苗接種個(gè)滴度以上，表示免疫應(yīng)答良好，疫苗接種 成功；若成功；若HIHI抗體效價(jià)無明顯提高，表示免疫失敗。抗體效價(jià)無明顯提高，表示免疫失敗。瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGPAGP） 一一 原理原理 抗原、抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中抗原、抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中, ,可以向四周擴(kuò)可以向四周擴(kuò)散散, ,當(dāng)抗原抗體擴(kuò)散到適當(dāng)比列處相結(jié)合當(dāng)抗原抗體擴(kuò)散到適當(dāng)比列處相結(jié)合, ,出現(xiàn)肉

17、眼可見的出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線沉淀線. . 常用已知抗原檢測(cè)相應(yīng)的抗體常用已知抗原檢測(cè)相應(yīng)的抗體二二 適用范圍適用范圍( ( 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)適用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)適用) )禽流感、禽流感、傳染性支氣管炎傳染性支氣管炎傳染性法氏囊病、傳染性法氏囊病、傳染性喉氣管炎傳染性喉氣管炎雞痘、雞痘、馬立克氏病、馬立克氏病、傳染性腦脊髓炎傳染性腦脊髓炎網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒性關(guān)節(jié)炎多殺性巴氏桿菌病的抗體檢測(cè)。多殺性巴氏桿菌病的抗體檢測(cè)。三三 器材器材瓊脂擴(kuò)散板（平皿）瓊脂擴(kuò)散板（平皿）; ;打孔器、打孔器、 移液器移液器;0.01M PH 7.2 ;0.01M PH 7.2 的的磷酸

18、緩沖液磷酸緩沖液; ;瓊脂粉（糖）瓊脂粉（糖） 四四 操作程序操作程序（一）瓊脂板制備（一）瓊脂板制備1瓊脂粉1g磷酸鹽緩沖液100ml2加熱煮沸，搖動(dòng)燒瓶使瓊脂粉溶解3加入8g氯化鈉振蕩燒瓶，使氯化鈉溶解，4待瓊脂稍涼不燙手，倒板厚度為2.53mm5瓊脂凝固后，將其倒置濕盒內(nèi)，4保存?zhèn)溆茫ǘǘ?打孔打孔 1用打孔器按7孔梅花圖案打孔孔徑為3mm-4mm,孔距為3mm大平皿可打六組梅花孔2打孔后用7#針頭挑出孔內(nèi)瓊脂3最后在酒精燈上燒烤封底（三）（三） 加樣加樣 1 中間孔加抗原中間孔加抗原 2 外周孔加血清外周孔加血清 1、4 孔加陽性血清孔加陽性血清; 其他其他 孔加待檢血清孔加待檢

19、血清; 加樣至滿孔為止加樣至滿孔為止; 3 室溫下放置室溫下放置1020分鐘分鐘 使孔內(nèi)液體擴(kuò)散完畢或液面下降使孔內(nèi)液體擴(kuò)散完畢或液面下降 4 將瓊脂板倒置于濕盒內(nèi)將瓊脂板倒置于濕盒內(nèi) 37溫箱內(nèi)作用溫箱內(nèi)作用24-72小時(shí)觀察結(jié)果小時(shí)觀察結(jié)果 五五 結(jié)果判定結(jié)果判定 （ 一 ）（ 一 ） 當(dāng) 陽 性 血 清 與 抗 原 孔 之 間 出 現(xiàn) 清 晰 沉 淀 線當(dāng) 陽 性 血 清 與 抗 原 孔 之 間 出 現(xiàn) 清 晰 沉 淀 線 證明實(shí)驗(yàn)成立證明實(shí)驗(yàn)成立 （二）（二） 如果被檢血清與抗原孔之間出現(xiàn)沉淀線如果被檢血清與抗原孔之間出現(xiàn)沉淀線 或陽或陽 性性血清的沉淀線向鄰近被檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎者，被

20、檢血清判為陽性血清的沉淀線向鄰近被檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎者，被檢血清判為陽性 （三）（三） 如果被檢血清孔與抗原孔之間沒有沉淀線如果被檢血清孔與抗原孔之間沒有沉淀線; ;而且陽性血而且陽性血清孔沉淀線直向被檢血清孔則被檢血清判為陰性清孔沉淀線直向被檢血清孔則被檢血清判為陰性血血 清清 平平 板板 凝凝 集集 試試 驗(yàn)驗(yàn) 一一 原理原理 細(xì)菌性顆?？乖c相應(yīng)的抗體結(jié)合細(xì)菌性顆?？乖c相應(yīng)的抗體結(jié)合, ,在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)參與下參與下, , 經(jīng)過一段時(shí)間抗原顆粒相互凝集成肉眼可見團(tuán)經(jīng)過一段時(shí)間抗原顆粒相互凝集成肉眼可見團(tuán)快快. . 常用已知細(xì)菌性抗原檢測(cè)相應(yīng)的凝集抗體常用已知細(xì)菌性抗原檢測(cè)相應(yīng)

21、的凝集抗體 凝集試驗(yàn)包括：試管凝集反應(yīng)凝集試驗(yàn)包括：試管凝集反應(yīng) 、平板凝集反應(yīng)全血平、平板凝集反應(yīng)全血平板凝集反應(yīng)、血清平板凝集反應(yīng)）板凝集反應(yīng)、血清平板凝集反應(yīng)）. .二二 適用范圍適用范圍雞白痢、雞傷寒雞毒支原體、滑液囊支原體雞副嗜血桿菌?。u傳染性鼻炎） 三三 器材器材 凝集抗原、陽性、陰性血清凝集抗原、陽性、陰性血清 被檢血清，移液器（被檢血清，移液器（550ul） 載玻片，載玻片，25燈箱燈箱 四四 操作程序操作程序 （一）（一）準(zhǔn)備準(zhǔn)備 試驗(yàn)前試驗(yàn)前20分鐘自分鐘自4冰箱取出抗原冰箱取出抗原; 陰、陽性血清和被檢血清陰、陽性血清和被檢血清; 使其達(dá)到室溫，并將抗原液振蕩均勻使其達(dá)

22、到室溫，并將抗原液振蕩均勻 （二）試驗(yàn)過程（二）試驗(yàn)過程 1. 取抗原液取抗原液25ul滴于載玻片上滴于載玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被檢血清迅速在抗原液上滴加等量的被檢血清 3. 快速用牙簽將血清與抗原混勻快速用牙簽將血清與抗原混勻 4. 并涂布成并涂布成 2cm大小的片狀大小的片狀 5. 在燈箱附近不斷晃動(dòng)玻片在燈箱附近不斷晃動(dòng)玻片2分鐘，觀察有無分鐘，觀察有無凝集凝集五五 結(jié)果判定結(jié)果判定2 2 分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集（背景透亮）為陽性分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集（背景透亮）為陽性; ;背景均勻一致背景均勻一致呈混濁樣，無凝集者為陰性呈混濁樣，無凝集者為陰性. . 陰性陽性雞白痢沙門氏菌的

23、平雞白痢沙門氏菌的平板凝集試驗(yàn)的觀察板凝集試驗(yàn)的觀察新城疫病毒、新城疫病毒、禽流感病毒的分離和鑒定禽流感病毒的分離和鑒定 一一 病料的采集和處理病料的采集和處理活動(dòng)物：氣管、喉頭、呼吸道分泌物（拭子）死動(dòng)物：肝、脾、肺等內(nèi)臟用生理鹽水（肉湯）（含雙抗2000單位/ml）制成12組織勻漿4冰箱作用小時(shí)或過夜轉(zhuǎn)分離心分鐘取上清液備用 二 雞胚接種雞胚接種1取9-11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣接種5-10個(gè)雞胚2取上述處理的上清液0.2ml接種于雞胚尿囊腔中337培養(yǎng)4-7天4每天照蛋2次，棄去24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚5收集死胚及培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的活胚放4冰箱中冷卻2小時(shí)以上（過夜）6收取尿囊液測(cè)定其HA活性（效價(jià)

24、）陰性者需傳代2次三三 病毒鑒定病毒鑒定禽流感病毒與其他血清型的副粘病毒以及某些細(xì)菌支原體也具有血凝性可用相應(yīng)特異陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)或全血平板凝集抑制試驗(yàn)進(jìn)行鑒定新城疫血凝抑制試驗(yàn)禽流感瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)不同血清型禽流感血凝抑制試驗(yàn) 四四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力測(cè)定新城疫病毒、禽流感病毒的致病力測(cè)定（一）（一） 雞胚平均致死時(shí)間（雞胚平均致死時(shí)間（MDTMDT）（最小致死量）（最小致死量） 1 1 將新鮮感染尿囊液進(jìn)行將新鮮感染尿囊液進(jìn)行10101 1-10-109 9稀釋稀釋 2 2 每個(gè)稀釋度接種每個(gè)稀釋度接種5 5枚枚911911天天 SPF SPF雞雞0.1ml/0.1ml/胚

25、胚 3 3 置置3737培養(yǎng)。每日照蛋培養(yǎng)。每日照蛋2 2次次 4 4 連續(xù)觀察連續(xù)觀察7 7天，記錄每個(gè)雞胚死亡時(shí)間天，記錄每個(gè)雞胚死亡時(shí)間 最小致死量為引起所有雞胚死亡最大稀釋度最小致死量為引起所有雞胚死亡最大稀釋度 MDT MDT最小致死量引起雞胚死亡平均時(shí)間最小致死量引起雞胚死亡平均時(shí)間 強(qiáng)強(qiáng) 毒毒6060小時(shí)小時(shí) 中等毒力中等毒力61-9061-90小時(shí)小時(shí) 低等毒力低等毒力9090小時(shí)小時(shí) （二）（二） 腦內(nèi)致病指數(shù)（腦內(nèi)致病指數(shù)（IICP） 1、取凝集價(jià)在、取凝集價(jià)在24以上的新鮮感染尿囊液以上的新鮮感染尿囊液 用生理鹽水用生理鹽水10倍稀倍稀釋；釋； 2、腦內(nèi)接種、腦內(nèi)接種1日

26、齡雛雞（日齡雛雞（24-40小時(shí)）小時(shí)） 10只，只， 每每只只0.05ml； 3、 每每24小時(shí)觀察一次，共觀察小時(shí)觀察一次，共觀察8天；天； 4、 每天觀察給雞打分，正常雞為每天觀察給雞打分，正常雞為0分；分； 病雞為病雞為1分；死雞為分；死雞為2分；雞每天觀察仍記錄分；雞每天觀察仍記錄2分）分） IICP是每只雞是每只雞8天所有觀察數(shù)值的平均數(shù)強(qiáng)毒力病毒天所有觀察數(shù)值的平均數(shù)強(qiáng)毒力病毒ICPI為為2，溫和，溫和毒數(shù)為毒數(shù)為0 (三）三） 靜脈致病指數(shù)（靜脈致病指數(shù)（IVPI） 1 將將HA高于高于24的新鮮感染尿囊液的新鮮感染尿囊液 用生理鹽水做用生理鹽水做10倍倍稀釋稀釋 2 給給10只只6周齡周齡SPF雞靜脈接種雞靜脈接種0.1ml 3 每天觀察一次，共每天觀察一次，共10天，每次觀察記錄正常雞為天，每次觀察記錄正常雞為0，病雞病雞1， 癱瘓雞、有神經(jīng)癥狀者為癱瘓雞、有神經(jīng)癥狀者為2， 死雞記作死雞記作3（死雞以后每天仍記（死雞以后每天仍記3） IVPI指每只雞