顯微操作在臍血干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷中的應(yīng)用

1、顯微操作在臍血干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷中的應(yīng)用         10-05-04 15:28:00     編輯：studa20             作者：尹文化，金大地，魯凱伍，閆慧博，王璐，鄧許勇 【摘要】  目的建立大鼠脊髓全橫斷損傷模型，應(yīng)用顯微操作方法和人臍血干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷，觀察顯微操作技術(shù)對(duì)大鼠受損脊髓功能恢

2、復(fù)的影響。方法 取足月健康順產(chǎn)新生兒臍血，分離、培養(yǎng)臍血干細(xì)胞。60只SD雌性大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組（A組，n=10）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（B組，n10）、常規(guī)治療組（C組，n=20）和顯微治療組（D組，n=20）。A組大鼠只打開椎板；B、C組大鼠采用常規(guī)方法行T89平面脊髓全橫斷，造成急性脊髓損傷，C組大鼠于脊髓兩斷端用1 l注射器分別注射臍血干細(xì)胞懸液1 l（干細(xì)胞濃度為6×109/L 7×109/L），B組同法注射等量PBS液；D組采用顯微操作技術(shù)行脊髓橫斷，并以口徑50 m的毛細(xì)玻璃針用相同方法注射臍血干細(xì)胞。術(shù)后18周內(nèi)每周進(jìn)行1次后肢BBB評(píng)分，術(shù)后第8周處死大鼠，

3、對(duì)比觀察術(shù)中和術(shù)后第8周各組大鼠脊髓大體標(biāo)本外形、顏色、質(zhì)地和體積大小改變。結(jié)果A組大鼠手術(shù)前后運(yùn)動(dòng)功能、脊髓大體標(biāo)本未見明顯變化。B、C、D組大鼠術(shù)后雙側(cè)后肢完全性癱瘓，B組大鼠無明顯恢復(fù)。而C、D組大鼠，從術(shù)后第2周開始逐漸恢復(fù)部分后肢運(yùn)動(dòng)功能。第3周以后，D組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分明顯優(yōu)于C組，具有顯著性差異（P<0.05）。術(shù)后第8周，所有大鼠脊髓橫斷處均瘢痕愈合，B組大鼠遠(yuǎn)側(cè)段脊髓干癟、皺縮；C組大鼠遠(yuǎn)側(cè)段脊髓直徑輕度變細(xì)，外形尚飽滿；D組大鼠橫斷處兩側(cè)脊髓直徑無明顯差異，外形圓潤(rùn)，但局部可見明顯瘢痕粘連。結(jié)論人臍血干細(xì)胞移植對(duì)脊髓橫斷性損傷具有較好的治療作用，顯微操作技術(shù)

4、的應(yīng)用能最大可能地減少人為造成的脊髓損傷，有利于脊髓損傷的功能修復(fù)。 【關(guān)鍵詞】  顯微操作； 脊髓損傷； 臍血干細(xì)胞； 移植    Abstract：ObjectiveTo establish effective and reliable complete spinal cord transection models in rats, and to investigate the effects of micromanipulation used in surgical procedure of transected spinal cord treat

5、ed with human umbilical cord blood stem cells (UCBSCs) grafts in rats.MethodHuman UCBSCs were obtained from umbilical cord blood of term deliveries.Sixty SpragueDawley (SD) female rats were divided randomly into  group A(control group), group B(spinal cord transection and PBS injection), group

6、C(spinal cord transection and UCBSCs transplantation) and  group D(spinal cord transection and UCBSCs transplantation by using micromanipulation).All groups were operated, and 1 l UCBSCs（6×109/L 7×109/L） were injected into the both ends of the completely transected spinal cord at the&

7、#160; groups C and D by two different surgical procedures respectively. From 1 week to 8 week postoperation, a behavioral testing was performed weekly upon each hindlimb for all animals according to the BBB scoring system. At the 8th week, all animals were sacrificed and the spinal cords were taken

8、out for morphological observation. ResultNo changes were observed at group A pre and postoperation. After 2 weeks postoperation, the hindlimb motor function of groups C and D began to recover. After 3 weeks postoperation, the  group D showed more improvement than  group C, and the differen

9、ce between  groups D and C were significant in the BBB scores(P<0.05).No functional recovery was observed at  group B. In addition to the adhesion between the spinal dura matter and peripheral tissues at  group D, hypertrophic scar existed in the injured spinal cord of every experi

10、mental rat.ConclusionHuman UCBSCs may improve functional recovery of the hindlimbs of the experimental rats. Micromanipulation is benefit to elevating the therapeutic efficacy, because it might minimize the possibility of spinal cord injury in surgical procedure.    Key words：microman

11、ipulation;  spinal cord injury;  umbilical cord blood stem cells;  transplantation    脊髓損傷（spinal cord injury, SCI）嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，促進(jìn)SCI后脊髓神經(jīng)和軸突再生，在一定程度上恢復(fù)雙下肢感覺和運(yùn)動(dòng)功能，一直是醫(yī)學(xué)界努力的方向。多種干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究已取得一定進(jìn)展，但療效尚不理想，除卻進(jìn)一步探索更理想的種子細(xì)胞，操作方法的選擇也是影響療效的一個(gè)重要因素。人臍血干細(xì)胞來源廣泛，具有分化成包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的

12、多種組織細(xì)胞的潛能1、2，有望成為脊髓再生研究中移植細(xì)胞的良好替代品，具有較好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠完全性脊髓橫斷模型，并對(duì)采用不同操作方法治療大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)和脊髓大體形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行了對(duì)比研究。    1  材料與方法    1.1主要實(shí)驗(yàn)材料  微型不銹鋼薄唇槍鉗（槍頭2 mm×1.5 mm，唇厚0.15 mm）、微型神經(jīng)剝離子（寬1 mm、1.5 mm各1把，唇厚0.15 mm）和用上海吉列刀片改制的超薄手術(shù)刀片（刀片厚50 m）由廣州器化醫(yī)療設(shè)備有限公司代為加工制造。顯微鑷和微型

13、自動(dòng)牽開器購(gòu)自廣州市金路工貿(mào)有限公司。甲基纖維素5 g/L（美國(guó)Sigma公司,），低糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；FBS（Gibco公司），淋巴細(xì)胞分離液（比重1.077 g/ml，天津生物制品研究所）?？谷薈D29、CD34、CD45、CD105、CD106單克隆抗體（深圳晶美公司）, EpicsXL II型流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司）。1 l微量注射器購(gòu)自上海高鴿工貿(mào)有限公司。毛細(xì)玻璃針由南方醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供。手術(shù)顯微鏡（云南SSX型），立體定向儀（Narishige SR6），倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（日本Olympus產(chǎn)品）。實(shí)驗(yàn)主體在南方醫(yī)科大

14、學(xué)生物材料研究所（廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）完成。    1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組  雌性SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)SCXK(粵)200600152006B023）。隨機(jī)挑選60只成年雌性健康SD大鼠，體重230270 g，平均（236±6.78）g，隨機(jī)分成4組，其中A組（n=10）只打開椎板，為假手術(shù)對(duì)照組；B組（n=10）行完全性脊髓橫斷PBS斷端注射；C組(n=20)行完全性脊髓橫斷臍血干細(xì)胞移植，D組(n=20)在顯微操作下行完全性脊髓橫斷臍血干細(xì)胞移植。對(duì)死亡大鼠模型，分析死亡原因，并及時(shí)予以補(bǔ)足。 

15、;   1.3  大鼠脊髓全橫斷模型的建立和人臍血干細(xì)胞移植  大鼠用100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，無菌條件下以T9椎體棘突為中心，縱行切開約2 cm，鈍性分離棘突兩側(cè)椎旁肌達(dá)椎板表面，微型自動(dòng)牽開器牽開兩側(cè)椎旁肌，暴露椎板和椎體棘突，咬除T810椎體棘突。微型神經(jīng)剝離子鈍性分離T810椎間黃韌帶，微型槍鉗咬除T8、9椎板至兩側(cè)關(guān)節(jié)突內(nèi)緣。縱行剖開硬脊膜約0.5 cm，經(jīng)硬脊膜切口，于硬脊膜下蛛網(wǎng)膜外，將超薄手術(shù)刀片抵在一側(cè)骨壁上，劃斷脊髓，包括脊髓背靜脈、兩側(cè)的脊髓背動(dòng)脈和脊髓腹動(dòng)脈，避免反復(fù)切割。選

16、擇健康足月產(chǎn)婦，待新生兒娩出后，按照Wang等3的方法備取第3代臍血干細(xì)胞，在立體定位儀下用1 l微量注射器行細(xì)胞移植。D組大鼠采用毛細(xì)玻璃針行細(xì)胞移植，其硬脊膜切口采用顯微縫合。其余各組大鼠背側(cè)硬脊膜切口用胸背部筋膜片覆蓋，常規(guī)分層縫合。術(shù)后連續(xù)3 d每日予青霉素（3萬IU/kg）肌注1次。每籠飼養(yǎng)45只大鼠，恒溫保暖，隔日更換墊料。每日行人工膀胱按摩排尿，早晚各1次。D組顯微操作在10倍手術(shù)顯微鏡下完成。    1.4  脊髓形態(tài)學(xué)觀察及后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)  術(shù)中觀察各組大鼠脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。從術(shù)后第1周開始，對(duì)大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分4，每周1次

17、，每次持續(xù)觀察4 min或來回爬行5個(gè)輪回，取平均分，直至術(shù)后8周。沒有額外的引誘或促動(dòng)因素。評(píng)分者為非本組實(shí)驗(yàn)人員且熟知BBB 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后第8周，過量麻醉處死大鼠，經(jīng)心臟灌注固定脊髓，觀察其形態(tài)、顏色、質(zhì)地、體積大小及局部粘連情況，并與術(shù)中情況進(jìn)行對(duì)比。    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理  所有計(jì)量資料均以±s表示，應(yīng)用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用OneWay ANOVA檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)。 P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)果    2.1  人臍血干細(xì)胞分離、體外培養(yǎng)及免疫鑒定    共采集36份新鮮臍血，每份臍血平均采集量為25.94 ml(2089