偽狂犬病基因缺失疫苗的研究進(jìn)展.docx

1、偽狂犬病基因缺失疫苗的研究進(jìn)展碼爍(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院.江蘇南京210095)摘要:偽狂犬病(PR)是一種可引起多種家畜以發(fā)熱、奇庠及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病，是嚴(yán)重危害我國(guó)及世界其他各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。疫苗免疫接種是有效防治和根除偽狂犬病的根本措施。此文就偽狂犬病主要的毒力基因.以及不同的基因缺失苗的特性進(jìn)行了綜述，并對(duì)今后的發(fā)展進(jìn)行了展望。關(guān)鍵伺:偽狂犬病病毒；基因缺失苗;研究進(jìn)展偽狂犬病(pseudorabics,PR),又稱Aiyeszky氏病，是由胞痊病毒科a-皰疹病毒亞科豬皰疹病毒I型又稱為偽狂犬病病春(PseudorabiesVirus,PRV)所引起的豬、牛、羊等多

2、種家布、家禽和野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢(除豬外)及腦怦場(chǎng)炎為主癥的-種急性傳染病。豬站該病齦主要的傳染源，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失僅次于豬瘟和口路疫.我國(guó)自1947年首次報(bào)道以來(lái).現(xiàn)己蔓延到24個(gè)省(自治區(qū)、直轄市),造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.疫苗免疫接種是預(yù)防和控制乃至根除偽狂犬病的根本措施.早期的疫苗大多為*5毒苗和天活苗，但姑弱毒苗存在著標(biāo)力返強(qiáng)和畋養(yǎng)的危險(xiǎn).而滅活苗免疫效率較低，免疫時(shí)用最較大，有時(shí)可導(dǎo)致注射部位腫脹，出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng).隨者分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因缺失疫苗由于能較為有效地激發(fā)體液和細(xì)胞免疫，因此成為各國(guó)對(duì)偽狂犬病的研究中必不可少的研究?jī)?nèi)容.1PRV基因歌失苗的相關(guān)基礎(chǔ)研究偽狂

3、犬病茬基因缺失疫苗的研制始于20世紀(jì)80年代初期，利用基因工程技術(shù)在PRV基因組中插入或缺失-段序列致使PRV的某些基因不能&達(dá)，從而致弱PRV,同時(shí)又保持其較強(qiáng)的免疫原性.PRV基因缺失主妻包括：對(duì)與盤力相關(guān)基因如TK、gE、gl等造成缺失以降低病毒毒力.或?qū)园兹鏶G、gC.gD等基因造成映失以引入選擇標(biāo)記或阻止感染性病毒產(chǎn)生.研制生產(chǎn)高效可靠的基因缺失疫苗首先就要對(duì)主要毒力基因的功能特點(diǎn)進(jìn)行深入研究.1.1 TK基因的功能特性TK基因.又稱胸昔激IW(thymdinekinase,TK)基因，是決定PRV毒力最主妾的毒力基因，其主要作用是催化脫氧胸腺嗟度核昔硝酸化成dTMP,并進(jìn)一步磷

4、酸化為dTTP,即成為組成DNA分子的基本成分；此外也間接參與推進(jìn)dCTP、dGTP.dATP等物質(zhì)的合成.TK基因與病勝在機(jī)體中長(zhǎng)期保持潛伏感染和在神經(jīng)組織中的增殖.以及激活潛伏感染狀態(tài)的病毒粒子等過(guò)程密切相關(guān)，但與病毒在細(xì)胞中的增玳無(wú)關(guān).TK基因的缺失不僅會(huì)引起PRV扇力鹿失或極顯著地降低，同時(shí)也可使其在神經(jīng)組織中的復(fù)制能力、從外周神經(jīng)到腦的傳播能力和引起腦炎致死的能力大大降低.同時(shí)TK基因缺失后的毒株同野毒株一樣在培養(yǎng)細(xì)胞上增殖良好，但能力和潛伏感染的能力大大降低.1.2 gE基因的功能特性gE基因是PRV的-種糖蛋白基因，它編碼的gE糖米白在體內(nèi)和體外復(fù)制生長(zhǎng)中地非必需的，但決定了毒力

5、和病卷岌制.另外，gE基因促進(jìn)PRV通過(guò)突觸相連的神經(jīng)元，從而促進(jìn)其進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和在其中轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)敞.因此，gE基因?qū)τ赑RV的毒力是:很阪要的,但PRV的毒力是受多基因控制的.單獨(dú)發(fā)生gE基因映失的疫苗株往往保留相當(dāng)程度的毒力。1.3 gl基因的功能特性gl基因同樣編碼-種精蛋白.gl基因?qū)Σ《驹诩?xì)胞中的增殖是作必需的，但對(duì)病卷的體外培芥仍有影響.在多種細(xì)胞系中，gl基因的映失可能會(huì)影響病催從細(xì)胞中的釋放。此外，gl基因還可誘導(dǎo)細(xì)胞瞅合，促進(jìn)病魅在細(xì)胞間的擴(kuò)散，PRVgl基因缺失株在多種細(xì)胞中形成的空斑僅為肝版株產(chǎn)生的空斑大小的85%.在病律侵染過(guò)程中，不僅促進(jìn)病春在神經(jīng)系統(tǒng)中的復(fù)

6、制，而且還能促進(jìn)或協(xié)同其他精蚩白在毒力、神經(jīng)晴性等方面發(fā)揮作用.當(dāng)gl基因、gC基因單獨(dú)峽央時(shí).能力有所下降.但gC基因、gl基因雙缺失的收組病扉的雇力幾乎完全水失，當(dāng)gl單基因缺央時(shí)，病成也可侵染一、二級(jí)神經(jīng)元，而當(dāng)gD基因、gl基因同時(shí)缺失時(shí).雙缺失病嵌在初級(jí)神經(jīng)元的夏制受到制約。1.4 gD基因的功能特性gD基因在病毒基因組中的兩大功能是介導(dǎo)病推進(jìn)入細(xì)胞和編碼PRV主要中和抗原景白。舔失gD基因的健株及失了感染能力，即gD賀白參與病毒穿透過(guò)程，與病柢進(jìn)入靶細(xì)胞有關(guān)，但對(duì)病卷在細(xì)胞間的傳播并非必需.同時(shí)，gD基因編碼的gD糖蛋白也是PRV主妻的免疫原性蛋白之一，它刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗gD糖蛋白

7、的抗體具有中和保護(hù)能力。2偽狂犬基因缺失疫苗的構(gòu)建方法PRV基因缺失疫苗可分為天然基因缺失疫苗、人工傳代致弱的基因缺失疫苗和使用基因工程技術(shù)去除特定的和毒力有關(guān)的基因或基因片段而獲得的缺失疫苗3種,而目前所稱的“基因缺失疫苗”主要是指最后一種。隨著人們對(duì)PRV分子生物學(xué)的研究不斷深入，PRV中冬基因的功能逐漸清楚，可以有目的地對(duì)基因序列進(jìn)行改造，從而構(gòu)建甦安全有效的基因缺失苗。目而，偽狂犬基因缺失疫苗的構(gòu)建有3種方法：同源敢組法、煎登克隆文庫(kù)法、細(xì)菌人工染色體法。3偽狂犬病基因缺失苗的種類3.1偽狂犬病毒單基因缺失苗TK基因缺失疫苗由Kit等干1985年以PPVBUK株為起始材料，通過(guò)缺失TK

8、基因序列的148bp而獲得，它對(duì)鼠和免的春力大為減退，并能引起鼠、兔和豬的堅(jiān)強(qiáng)保護(hù)力，抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊，強(qiáng)柩排出時(shí)間減少.1986年該毒株被美國(guó)批準(zhǔn)為上市的第I個(gè)基因工程疫苗。TK基因缺失株經(jīng)生物學(xué)和動(dòng)物試驗(yàn)證明其對(duì)Balb/c小白鼠有較高的安全性，接種豬能產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫力并能抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊，但是，僅缺失TK基因的弱毒株對(duì)犢牛還有較低的毒力，對(duì)狗、貓的毒力更強(qiáng).現(xiàn)在的基因工程苗均以TK基因缺失為基礎(chǔ)制成。3.1.1 gD基因缺失疫苗由Peeters等于1994年構(gòu)建而成。當(dāng)動(dòng)物接種表型互補(bǔ)的PRVgD-突變株時(shí)，病毒能纏直接在細(xì)胞和細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，但是感染細(xì)胞釋放的子代病毒無(wú)感染性，缺失

9、gD基因的毒株將失去從免疫動(dòng)物向非免疫動(dòng)物傳染的能力，因此是一種高度安全的疫苗候選毒株，對(duì)接種豬能產(chǎn)生明顯的保護(hù)性，證明gD缺失突變株是一種安全、不散毒的活疫苗，也可作為安全表達(dá)異源基因產(chǎn)物的活載體疫苗。3.1.2 RR基因缺失疫苗DeWind等(1993)報(bào)道了RR缺失的毒株對(duì)小鼠和豬的毒力下降,編碼RR大單位的UL39基因滅活后，在口鼻弒液中排卷量低，雖然誘生的抗體低，但可保護(hù)強(qiáng)毒攻毒后豬不出現(xiàn)臨床癥狀.所以RR突變株有望成為新型疫苗的候選者，此外RR突變株還可作為進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的基因莪體.RR前在體外可被一種作用于小亞單位C末端的多肽特異性抑制，為研究抗ADV藥物提供模型.3.1.3 PK

10、基因缺失疫苗Kimman等于1994年證明US3-缺失株對(duì)豬的毒力明顯降低.與gE基因缺夾株比較.PK缺失株在毒力下降方面與其相似，但免疫原性下降不如gE基因缺失株。此外，PK-技失株在體內(nèi)外的增殖滴度很低，但不影響共免疫原性，PK不包含保護(hù)性抗原決定簇，其激醵活性對(duì)免疫保護(hù)也不楚必需的。PK基因缺失病毒對(duì)兔子、小白鼠和仔豬的毒力大大降低，在測(cè)定攻毒保護(hù)率的實(shí)驗(yàn)中，證明重組病毒免疫豬己經(jīng)產(chǎn)生了對(duì)偽狂犬病病毒的保護(hù)，與油苗的效果相當(dāng).3.1.4 dUTPase基因5失疫苗dUTPase基因由UL50編碼。Jons等1996年將報(bào)告基因LacZ插入PRVKa株構(gòu)建了UL50-缺失株。對(duì)病毒在細(xì)胞上

11、的繁殖影響不大，但毒力下降，用它免疫能能保護(hù)豬抵抗致死St的強(qiáng)毒攻擊，可作為新的基因工程疫苗候選毒株。3.1.5 gM基因缺失疫苗由Dijkstra等于1997年構(gòu)建而成。gM蛋白由UL10編碼，是PRV的一個(gè)非必需糖蛋白.用它原內(nèi)免疫接種6周齡豬，能夠保護(hù)豬抵抗強(qiáng)毒的攻擊。3.2偽狂犬病毒雙基因缺失苗偽狂犬病毒雙幕因缺關(guān)疫苗是在TK基因缺失疫苗的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它比僅布TK也基因缺失的疫苗更優(yōu)越。由于TK基因?qū)儆诿傅鞍谆?，在體內(nèi)不能產(chǎn)生共相應(yīng)的抗體，若要用血清學(xué)方法區(qū)別開免疫接種豬與自然感染豬，就必須缺失相應(yīng)的糖蛋白基因。據(jù)此，偽狂犬病盤雙基因缺失疫苗株除了在TK基因引入1個(gè)缺失外，在編

12、碼非必需械賀白的幕因內(nèi)引入1個(gè)新的缺失，或插入1個(gè)報(bào)告基因，這樣得到的突變株就不能產(chǎn)生被造成缺失的精蛋白，因而免疫動(dòng)物就不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，從而可以通過(guò)血清學(xué)方法將免疫接種豬與自然感染野卷豬相區(qū)別，同時(shí)某些糖蛋白的缺失也可進(jìn)一步降低其毒力.這些為雙基因缺失疫苗的特點(diǎn).3.2.1 TK-/gC雙基因缺失苗該疫苗株是由Kit等于1987年為克服TK單基因缺關(guān)的不足，在PRVBUK-dl3株的基礎(chǔ)上，通過(guò)缺失gC基因序列的1100bp,構(gòu)建出的缺失了TK、gC基因的PRVTK/gC疫苗株.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，用該缺失疫苗接種的動(dòng)物不能產(chǎn)生抗gC的抗體，用gC-ELISA可將接種動(dòng)物與自然感染動(dòng)物區(qū)分開，有

13、利于檢疫工作的開展.值得一提的是，核基因缺失疫苗株還不能產(chǎn)生gE的抗體，因此，gE-ELISA也可以作為區(qū)分接種動(dòng)物和自然感染動(dòng)物的一個(gè)標(biāo)志。怛這種基因缺失苗產(chǎn)生的中和杭體不高，在除日本外的其他國(guó)家很少使用.3.2.2 TK-/gG雙基因缺失苗Marchioli等于1987年利用一株碘脫氧尿昔抗性突變株HR(TK)作為親本構(gòu)建了TK/gG雙基因缺失株。該基因缺失株TK基因缺失276bp,gG基因也被造成缺失。用PRVTK/gG-制備的疫苗接種動(dòng)物，結(jié)果表明對(duì)小鼠、豬、綿羊無(wú)毒性，對(duì)牛有中等卷豬群保健IIEALTII性，對(duì)犬、貓有較強(qiáng)的毒性，小鼠、豬被免疫接種后，能抵抗強(qiáng)毒的攻擊,結(jié)合gGELI

14、SA可以區(qū)分疫苗接種動(dòng)物與野毒感染動(dòng)物。這種基因缺失苗在美國(guó)批準(zhǔn)使用，但其應(yīng)用首先還要:解決血清學(xué)鑒別診斷的敏感性問題.3.2.3TKVgE-雙基因缺失苗1987年和1990年，Quint和VanOirschot等分別利用NIA-3和NIA-4做親本，構(gòu)建了TK/gE雙基因映失株并建立了血清學(xué)鑒別診斷方法gE-ELISA。該疫苗對(duì)豬、牛、羊均安全，不產(chǎn)生潛伏感染，用它接種的豬能抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊。因不表達(dá)抗gE蛋白的抗體.同樣也可用gEELISA將疫苗接種動(dòng)物與自然感染動(dòng)物相區(qū)別。3.3偽狂犬病毒多基因缺失苗TK-/gE/gI-/LacZ+基因缺失苗2003年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春等將質(zhì)粒pF

15、BBS與EcoRI線性化的PRV鄂A株（SA株）TK/gE/LacZf突變株基因組DNA共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，經(jīng)過(guò)空斑篩選獲得。該基因缺失株遺傳穩(wěn)定，不會(huì)返強(qiáng)。將其接種于仔豬、育肥豬、妊娠母豬，扶得了明顯的免疫效果，可用gE-ELISA進(jìn)行檢測(cè)。疫苗接種小鼠、家兔等動(dòng)物在試驗(yàn)期內(nèi)均未出現(xiàn)精神異?；蛩劳霈F(xiàn)象，表明該疫苗具有極高的生物安全性，適用于偽狂犬期的防制。3.3.1 gG-/gE-/gI-/gC-4基因缺失疫苗1990年，Mettenleiter等構(gòu)建了gG/gE/glVgC4基因映失株,它對(duì)6周齡仔豬完全無(wú)毒，免疫接種仍使豬獲得對(duì)強(qiáng)靡攻擊的保護(hù)。3.3.2 gG-/gE-/gI-/gD-4基因缺失疫苗】994年，Mettenleiter等利用已整合PRVgD的細(xì)胞系，構(gòu)建了gG/gE-/gI/gD4基因映失疫苗，這種疫苗不會(huì)散毒，非常安全，對(duì)豬失去毒性，能剌激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)PRV的保護(hù)性免疫。4小結(jié)與傳統(tǒng)的滅活苗和弱毒苗相比，基因缺失疫苗具有明顯的優(yōu)越性。首先，基因缺失突變株只有突變性狀明確、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。第二，PRV缺失株毒力低，但免疫原性強(qiáng)，保護(hù)力好.第三，不易侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)夏制或侵入能力大大減弱.第四，疫苗免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物可以密別診斷。但是，堆因缺失疫苗在引起潛伏感染