乙肝乙腦麻疹多表位噬菌體疫苗的構(gòu)建及其免疫原性.docx

1、中國圖書分類號Q939.48R392-33文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號10085503(2008)09。782"4【預(yù)防制品】乙肝乙腦麻疹多表位噬菌體疫苗的構(gòu)建及其免疫原性蘭蕓胡凝珠胡云章程玉興瞿素陳陽任翔陶里【摘要】目的構(gòu)建乙肝乙腦麻疹多表位噬菌體疫苗,并檢測其免疫原性。方法將PCR方法合成的乙肝乙腦麻疹多表位基因COM插入T7噬菌體基因組中,使其與噬萌體10B蛋白融合,展示在T7噬菌體表面，構(gòu)建成多表位噬菌體疫苗COM/T70分別以10wpfu/H和10'2pfu/H兩種劑艮:.通過腹腔、皮下和鼻腔3種途徑免疫昆明小鼠,ELISA檢測小鼠特異性抗體水平。結(jié)果重組噬菌體COM/T7

2、經(jīng)PCR鑒定證明構(gòu)建正確。乙肝乙腦麻疹多表位喋菌體疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對各表位的特異性IgC抗體。在3種免疫途徑中，腹腔免疫效果最好。免疫劑量與誘導(dǎo)的抗體水平在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。多表位噬菌體疫苗誘導(dǎo)的抗-HBs和抗-JEV水平高于常規(guī)疫苗，而抗-MV水平低于常規(guī)疫苗。結(jié)論構(gòu)建的乙肝乙腦麻疹多表位哩菌體疫苗具有良好的免疫原性。(關(guān)鍵詞】乙型肝炎；乙型腦炎;麻疹;噬菌體展示;多表位疫苗;免疫原性ConstructionandImmunogenicityofPhageDisplayedPolytopeVaccineagainstHepatitisB,JapaneseEncephalitisandM

3、easlesIANYun,HUNing-zhu,HUYun-zhang,etalInstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Kunming650118,China)AbstractObjectiveToconstructaphagedisplayedpolytopevaccineagainsthepatitisB(HB),Japaneseencephalitis(JE)andmeaslesandstudyitsimmunogenicity.MethodsSynthesiz

4、eHB-JE-measlepolytopegeneCOMbyPCRandinsertintothegenomeofT7phageforfusionwithphage10BproteinanddisplayonthesurfaceofT7phage.ImmunizeKMmicewiththeconstructedphagedisplayedpolytopevaccineCOM/T7atdosagesof1010and10"pfubyintraperitoneal,subcutaneousandintranasalroutesseparatelyanddeterminethespecif

5、icantibodylevelbyELISA.ResultsPCRprovedthatrecombinantphageCOM/T7wasconstructedcorrectly.ThepolylopevaccineinducedspecificIgGantibodiesspecifictovariousepitopesinmice.TheIgGlevelinducedbyintraperitonealroutewashigherthanthosebysubcutaneousandintranasalroutes.Theantibodylevelinducedwaspositivelyrelat

6、edtothedosageofvaccinewithinacertainrange.Comparedwiththosebyroutinevaccine,theanti-HBsandanli-JEVantibodylevelsinducedbythepolytopevaccinewerehigh,whileanti-MVantibodylevelwaslow.ConclusionTheconstructedphagedisplayedxilytopevaccineagainstHB,JEandmeaslesshowedgoodimmunogenicity.KeywordsHepatitisB;J

7、apaneseencephalitis;Measles;Phagedisplay;Polytopevaccine;Immunogenicity表位疫苗是應(yīng)用抗原表位構(gòu)建的疫苗。多表位疫苗是同時攜帶多個目標(biāo)抗原相關(guān)表位與輔助性表位構(gòu)建的疫苗c多表位疫苗能克服主要組織相容性復(fù)合物分子的遺傳限制,多表位可被多種遺傳背景的MHC分子識別并結(jié)合，而達(dá)到高效提呈；可以避免傳統(tǒng)的滅活或減毒疫苗存在的生物危害性和毒力返祖等問題;在誘生細(xì)胞免疫方面有獨特優(yōu)勢。抗原表位多肽是線性的,不能折疊,通常免疫原性較差;而且其相對分子質(zhì)量小，易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解。直接用表位多肽免疫動物所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體常常只能與相應(yīng)的表位

8、反應(yīng)，而不能中和病毒,因此可以將表位與載體偶聯(lián)成顆粒樣抗原，以增強其基金項目：國家863計劃資助項目(2006AA02Z4CO);云南省社會發(fā)展攻關(guān)項目(2006SG05).作者單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所理苗研究室(昆明650118).通訊作者：胡云章Email：huyunz免疫原性“)。乙型肝炎、乙型腦炎和麻疹均為亞洲多發(fā)的傳染性疾病，我國目前已將麻疹和乙肝疫苗納入國家免疫規(guī)劃，部分省也將乙腦疫苗納入了免疫規(guī)劃°本文選用T7噬菌體作為多表位疫苗的載體，通過基因重組將乙肝乙腦麻疹(HBV-JEV-MV)多表位基因片段與T7噬菌體10B衣殼蛋白基因融合，制備噬菌

9、體展示多表位疫苗。選用不同劑量(W。和10”pfu/只)的疫苗，經(jīng)鼻腔、皮下和腹腔免疫小鼠，檢測其誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答效果。1. 材料與方法1.1噬菌體、菌種、質(zhì)粒及疫苗E.coliBL5403購自Novagen公司;T7噬菌體和E.coliDH5a由本室保存;pGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品；乙肝疫苗由長春生物制品研究所提供;麻疹減毒活疫苗和乙腦滅活疫苗由蘭州生物制品研究所提供。1.2試劑小量膠回收試劑盒和小H:質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖袨樯虾ＨA舜生物工程有限公司產(chǎn)品;T7Select10-3bVector和T7SelectPackagingKit為Novagen公司產(chǎn)品；LATaqDNA

10、聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xho1購自寶生物工程（大連）公司;蛋白檢測微孔試劑盒購自晶美公司。1.3實驗動物昆明小鼠.雌性，1618g,由本所靈K類實驗動物中心提供。1.4引物設(shè)計及合成利用間隔子GPGPG將HBV兩個中和表位HBVpreSlaa19-26和aa3745、JEVprM蛋白模擬表位YGGIYMNG"】和MV中和表位MV-Faa404414（5】間隔串聯(lián)，并在N-端添加輔助性Th通用表位,構(gòu)建成乙肝乙腦麻疹多表位序列，見圖10叫ELGFFp|g贏祠YCC1YW4；ne>MC>p«»»>»*&

11、#187;WC»p««M-FMH-IH圖1多表位疫苗的氨基酸序列Fig1.Aminoacidsequenceofpolytopevaccine引物C0M1COM15按照互補拼接的原則設(shè)計,T7-UP和T7-D0WN為T7Select10-3bVector多克隆位點上下游引物。全部引物由寶生物工程（大連）公司合成,其序列如下:COM1：5'-GAA1TCACAATA-CATAAAAGCCAACTCG-3Z（弓I入EcoRI酶切位點）；COM2：5'-TCATAGGAATAACGGAACTCGGTCCGG-GTCCCGC-3/；COM3：5'-

12、TCCAAACCCGCTAGGATT-CTTTCCCGGTCCGGG-3'COM4：5,-TCCTGGCAAC-TCATCGCCACCGGACTGGGA3；COM5：5Z-CTTCG-GTCCAGGTCCCGGATACGGCGGAAT-3'；COM6：5'-CTATATGAATGGTGGACCTGGCCCAGGCAT-3'COM7：5'-CAATCAAGATCCAGACAAGATCCTAACCTATCT-CGAG3（引入XhoI海切位點）：COM8：5,-CTCGA-GATAGGTTACCATCTTGTC-3,（弓I入XhoI酶切位點）;COM9:5z-

13、TCTGGATCTTGATFGATGCCTGGGC-CAGGT-3'COM10：5'-CCACCATTCATATAGATTCC-GCCGTATCCG-3'；COM11：5Z-GGACCTGGACCGAA-GTCCCAGTCCGGTGGC-3'COM12：5七GATGAGTT-GCCAGGACCCGGACCGGGAAAG3，;COM13S-AA-TCCTAGCGGGTTTGGACCCGGACCCGGAC-3'COM-14：5'-CCGAGTTCCGTTATTCCTATGAACTTCGAGT-7833；COM15：5,-TGGCTnTATGTATTG

14、CATGAATTC-3'（引入EcoRI前切位點）;T7-UP：5,-GGAGCTGTC-GTATTCCAGTC-3'T7-DOWN：5'-AACCCCTCAAG-ACCCGTTTA-3，。1.5多表位基因（COM）的拼接及克隆將合成的引物COM1COM15等量混和，通過PCR反應(yīng)拼接。反應(yīng)條件為:945min30s,40Y30s,72Y30s,10個循環(huán);94T30s,55T30s,72弋30s,30個循環(huán)；72丁10minoPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收，連接入pGEM-T載體,轉(zhuǎn)化反collDH5a,提取質(zhì)粒,酶切鑒定并送寶生物工程（大連）公司測序,鑒

15、定正確者命名為COM/To1.6重組噬菌體的構(gòu)建用EcoRI和XhoI雙酶切重:組質(zhì)粒COM/T,將得到的COM基因片段插入經(jīng)同樣酶雙酶切的載體T7Select10-3b的多克隆位點，位于T710B基因的3'端。用T7SelectPackagingKit包裝，使多表位和T710B表達(dá)的融合蛋白展示在T7噬菌體表面。利用T7Select10-3b多克隆位點上下游引物T7-UP和T7-DOWN對包裝產(chǎn)物進(jìn)行PCR篩選，得到的陽性重組噬菌體命名為C0M/T7o1.7噬菌體疫苗的制備大量制備重組噬菌體COM/T7,測定其滴度后,按1：4000的比例用甲醛滅活4d,檢測滴度為0時，按每1ml噬菌

16、體溶液加100pulNaHSO3的比例中和殘余甲醛，得到噬菌體疫苗。1.8動物免疫用噬菌體疫苗分別經(jīng)腹腔、皮下和鼻腔免疫昆明小鼠，免疫劑量分別為10,0pfu/只和lOpfu/只，以免疫10'2PfuT7噬菌體作為陰性對照，乙肝疫苗、乙腦滅活疫苗和麻疹減毒活疫苗作為陽性對照。每組小鼠6只,共免疫3次，間隔2周。1.9小鼠血清IgG的檢測末次免疫后4、8、12周，分別經(jīng)小鼠尾靜脈采血，600禎/只，37勾放置1h后，4T過夜，分離血清。用蛋白檢測微孔試劑盒分別檢測抗乙型肝炎、麻疹和乙型腦炎病毒的IgG水平，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，檢測波長為405nmo10統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS軟件分析，

17、兩組之間的差異比較采用£檢驗。1. 結(jié)果1多表位基因的鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見約225bp的目的基因片段，與預(yù)期大小相符，見圖2。M:DNAmarkerDL2000;1:polytopegene.圖2多表位基因片段PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig2.1%AgarosegelelectrophoreticprofileofPCRproductofpolytopegenefragments2.2重組質(zhì)粒COM/T的酶切鑒定重組質(zhì)粒C0M/T經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶切,可見約3000bp的載體片段和225bp的目的基因片段，見圖3。測序結(jié)果與設(shè)計完全一致。M:DNAmarke

18、rDL2000;1:COM/TdigestedwithEcoRIandXhoI.圖3重組質(zhì)粒COM/T的醯切鑒定Fig3.RestrictionmapofrecombinantplasmidCOM/T2.3重組噬菌體COM/T7的PCR鑒定以COMI和COM8為引物,PCR擴增得到225bp的目的基因片段,以T7-UP和T7-D0WN為引物，PCR擴增得到316bp的片段(目的基因片段加上T7噬菌體載體臂上下游91bp),表明重組噬菌體C0M/T7構(gòu)建正確，見圖4。2.4小鼠血清IgG水平2.4.1抗-HBsIgG水平:末次免疫后4、8、12周，10”pfuT7噬菌體對照組均未檢測到抗-HBs

19、抗體。末次免疫后12周，3種途徑中，除lOQpfu腹腔組外，其余各組的抗HBs抗體水平均達(dá)到最高，腹腔組抗體水平顯著高于皮下(£=2.64,P<0.01)和鼻腔組。=3.49,P<0.01)o末次免疫后8、12周,10,2pfu的各組抗體水平均高于10'°pfu的各組相同免疫途徑相應(yīng)時間的抗體水平;第12周J0,2pfu腹腔組的抗體水平顯著高于皮下。=2.51,尹<0.01)和鼻腔組(t=2.36,P<0.01)o免疫效果最好的10”pfu腹腔組與乙肝疫苗對照組比較，前者末次免疫后第4周抗體水平顯著高于后者。=3.44,P<0.01),

20、第8周抗體水平也高于后者,但差異無顯著意義。=5.37,P>0.05).第12周二者水平相當(dāng)，且差異無顯著意義(：=-0.20,P>0.05),見表1。表明噬菌體展示多表位疫苗能誘導(dǎo)抗-HBs特異性抗體，且抗體產(chǎn)生快,持續(xù)時間長。MM25010031622520001000750500M:DNAmarkerDL2000;1:PCRproductofpositiveCOM/T7byCOMIandCOM8;2:PCRproductofpositiveCOM/T7byT7-UPandT7-DOWN.圖4重組噬菌體COM/T7的PCR鑒定Fig4.Identificationofrecom

21、binantphageT7byPCR2.4.2抗-JEVIgG水平：末次免疫后4、8、12周，10,2pfuT7噬菌體對照組均未檢測到抗-JEV抗體。末次免疫后12周,3種途徑中，各組的抗-JEV抗體水平均達(dá)到最高,腹腔組抗體水平高于皮下組，但差異無顯著意義(i=2.13,P>0.05),顯著高于鼻腔組(£=4.50,P<0.05)o末次免疫后8、12周，10,2pfu各組抗體水平均高于10'°pfu的各組相同免疫途徑相應(yīng)時間的抗體水平;第12周，10”pfu腹腔組的抗體水平高于皮下組，但差異無顯著意義(£=1.21,P>0.05),顯著

22、高于鼻腔組6=2.38,P<0.05)o免疫效果最好的10,2pfu腹腔組與乙腦滅活疫苗對照組比較，前者末次免疫后第4、8周抗體水平顯著高于后者(11=1.6132=2.58,P<0.05),第12周，前者抗體水平略高于后者，但差異無顯著意義(<=0.18,P>0.05),見表1。表明噬菌體展示多表位疫苗能誘導(dǎo)JEV特異性抗體，且抗體產(chǎn)生快,持續(xù)時間長。2.4.3抗MVIgG水平：末次免疫后4、8、12周，10,2pfuT7噬菌體對照組均未檢測到抗MV抗體。末次免疫后12周,3種途徑中，除102pfu腹腔免疫組外,其余各組的抗-MV抗體水平均達(dá)到最高，腹腔組抗體水平高于

23、皮下和鼻腔(«1=0.60,如=2.54,P<0.05)0末次免疫后4、8、12周,10°pfu的各組抗體水平均高于10'°pfu的各組相同免疫途徑相應(yīng)時間的抗體水平;第12周，10氣化腹腔組的抗體水平顯著高于皮下和鼻腔組(4=1.75,如=2.31,P<0.05)o免疫效果最好的1012pfu腹腔組與麻疹減毒活疫苗對照組比較,前者第4、8周抗體水平顯著高于后者2.71山=2.96,P<0.05),第12周，前者抗體水平顯著低于后者。=-1.75,P<0.05),見表lo表明噬菌體展示多表位疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對MV特異性免疫應(yīng)答，但免

24、疫效果不佳C表1小鼠血清抗各表位IgG水平Tab1.SerumIgGagainstvariousepitopesGroupRoute4weekn8weeks12weeksHBsAgJEVMVHBsAgJEVMV1HBsAgJEVMVCOM/T7.1010i.P35.011.311.373.530.340.560.835.935.3COM/1710”250.313.814.3101.341.257.0111.478.590.5T7.10niP000000000COM/T7-10w.c4.04.04.05.020.230.5COM/T7WS.C3.04.01

25、4.338.632.054.0T7-I0'2AC000000000COM/T7-1010i.n5.02.02.0COM/T7-10'2i.n40.314.332.0T7-10'1i.n000000000HB.vaccineS.C6.1.-22.6-.119.4-InactivatedJEvaccineSC-6.1-19.7-68.6-Liveattenuatedmeaslesvaccine*6.112.1一-222.83.討論最常用的多表位構(gòu)建方式是將輔助性表位與多個抗原特異的表位首尾相接

26、，各表位間以間隔子串聯(lián)；力。輔助性的Th通用表位可以增強對免疫細(xì)胞的活化技而。而GPGPG柔性片段富含G、P,有助于二級和三級結(jié)構(gòu)的形成，可以促進(jìn)表位呈遞1刃。噬菌體作為疫苗載體有多種優(yōu)勢:有強的免疫原性，是天然的免疫佐劑，在噬菌體表面表達(dá)的多肽易被免疫系統(tǒng)識別;可以募集T輔助細(xì)胞，而且噬菌體顆粒的不對稱性有利于引發(fā)T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答;由感染的細(xì)菌細(xì)胞分泌,噬菌體顆粒便于大規(guī)模生產(chǎn)疫苗用抗原表位，還可以在同一噬菌體上展示多個抗原決定簇,構(gòu)建多價噬菌體疫苗;純化簡便，成本低;粒穩(wěn)定，對理化因素的抵抗力強小)。本文選擇的T7噬菌體是一種烈性噬菌體，已完成全序列分析，遺傳背景清楚；比X噬菌體和絲狀

27、噬菌體更易培養(yǎng),且繁殖更快;復(fù)制周期短,胞質(zhì)蛋白組裝、操作和儲存方便,克隆效率高。本文對噬菌體疫苗采用3種途徑接種均有一定的免疫效果，但腹腔免疫效果明顯優(yōu)于另外兩種免疫途徑。可能是因為噬菌體顆粒直徑較小(約100nm),不能有效刺激鼻黏膜系統(tǒng)和皮下淋巴系統(tǒng)誘發(fā)特異的局部免疫反應(yīng),具體的免疫機制仍需深入研究。實驗結(jié)果還顯示，多表位疫苗誘導(dǎo)的抗-HBs和抗-JEV抗體水平優(yōu)于常規(guī)疫苗，而抗-MV抗體水平低于常規(guī)疫苗。這可能是因為:所構(gòu)建的多表位片段中，在位置上與輔助性Th表位最接近的HBV中和表位的加工呈遞效率最高，因此抗-HBs免疫效果最優(yōu)，抗-MV的效果低?？梢钥紤]在設(shè)計多表位片段時,在各表位

28、基因上游添加輔助性表位基因;表位間隔對不同表位的穩(wěn)定性和免疫原性有一定影響，可考慮對間隔序列進(jìn)行優(yōu)化。10'2pfu組誘導(dǎo)的抗體水平高于10'°pfu組，提示在一定范圍內(nèi)，噬菌體疫苗的免疫效果與免疫劑量呈正相關(guān)。參考文獻(xiàn)1AmonR,Tarrab-HazdaiR,StewardM.Amimotopepeptide-basedvaccineagainstSchistosomamansoni:synthesisandcharacterization.Immunology,2000,101(4):555-562.2 程玉興.朱高紅，段素，等.C3d分子多表位DNA疫苗體液免

29、疫應(yīng)答的增強作用.中國生物制品學(xué)雜志,2007,20(4):267-270.3 MaengCY,RyuCJ,GriponP,elal.Finemappingofvirus-neutralizingepitopesonhepatitisBvirusPreSl.Virology.2000,270(1):9-16.4 HirabayashiY,FukudaH,KimuraJ,eta).IdentiGcationofpeptidesmimickingtheantigenicityandimmunogenicityofconformationalepitopesonJapaneseencephalitisvirusproteinus