bFGF對(duì)關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)作用

1、bFGF對(duì)關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)作用                作者：司全明 侯筱魁 毛賓堯 【摘要】  目的 觀察堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的影響。方法 在兔雙側(cè)股骨髁間窩造成骨軟骨缺損，一側(cè)應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，另一側(cè)作對(duì)照。術(shù)后3個(gè)月，利用組織切片及掃描電鏡等方法，觀察兩側(cè)骨軟骨缺損修復(fù)情況。結(jié)果 修復(fù)3個(gè)月后，對(duì)照側(cè)軟骨缺損難以完全修復(fù)，修復(fù)細(xì)胞形態(tài)多樣，似成纖維細(xì)胞，蛋白多糖顆粒較少。應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子側(cè)軟骨

2、缺損基本修復(fù)，修復(fù)細(xì)胞似軟骨細(xì)胞，有較多的蛋白多糖顆粒與膠原纖維結(jié)合。缺損修復(fù)組織評(píng)分，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)論 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可促進(jìn)骨軟骨缺損的修復(fù)。 【關(guān)鍵詞】  堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 軟骨缺損 修復(fù)Effects of bFGF on Articular Cartilage Defect     Abstract：Objective  To explore the effect of basic fibroblast growth factor(bFGF) on the repair of articular c

3、artilage defect.Methods  Cartilage defects in intercondylar fossa of the femur were created in rabbit bilateral knees.One side was treated by bFGF，the other side was used as contrast.Afer 3 months following operation，the methods，such as transmission electron microscopy(TEM)，scanning electronic

4、microscopy(SEM) were applied to the observation of cartilage repair.Results  Cartilage defect was difficult to repair in the contrast.The cells is similar to fibrolblast cells.The amount of proteoglycan was less than that in the bFGF groups.In the bFGF group，the cartilage defect can be repaired

5、.The cells were similar to chondrocytes.The total scores on the histological grading scale were significantly better the defects treated with bFGF than that for the contrast defects.Conclusion  bFGF may be could improve the repair of cartilage defect.   Key words：bFGF；cartilage defect

6、；repair   隨著高能、高速創(chuàng)傷的不斷增多及人口老齡化的進(jìn)程，關(guān)節(jié)軟骨缺損疾患不斷增加。由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏直接的血液供應(yīng)、淋巴循環(huán)和神經(jīng)支配，并具有低代謝的生理特點(diǎn)，關(guān)節(jié)軟骨缺損后的自行修復(fù)能力非常有限。關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)已成為臨床骨科急需解決的問(wèn)題之一。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibrolast growth factor，bFGF)可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化，增加修復(fù)細(xì)胞的數(shù)量。為此，觀察bFGF對(duì)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的影響，防止膝關(guān)節(jié)軟骨損傷進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。1  材料及方法1.1  標(biāo)本的獲取 取新西蘭大白兔12只，體重3.

7、03.5 kg，雌雄不限。將每只兔的雙側(cè)膝關(guān)節(jié)隨機(jī)分為bFGF組和對(duì)照組。25 g/L戊巴比妥鈉1.0 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉。麻醉后，兔仰臥位，膝關(guān)節(jié)屈曲，小腿固定在自制的固定架上。雙側(cè)膝關(guān)節(jié)前方剪毛，常規(guī)消毒、鋪巾。取髕韌帶內(nèi)側(cè)切口，顯露股骨髁間窩。在股骨髁間窩造成表面為4 mm×3 mm的骨軟骨缺損。用0.25氯霉素及生理鹽水沖洗后，在bFGF組骨軟骨缺損部，放入浸有bFGF(1 g的bFGF溶于1 mL透明質(zhì)酸鈉，Sigma公司)的明膠海綿一塊，約4.5 mm×3.5 mm大小。對(duì)照組缺損部放同樣大小僅浸有1透明質(zhì)酸鈉的明膠海綿一塊，無(wú)bFGF，縫合切口。術(shù)前1

8、 h及術(shù)后3 d，肌注青霉素80萬(wàn)單位。動(dòng)物放于籠中常規(guī)飼養(yǎng)，于術(shù)后4 d和8 d膝關(guān)節(jié)分別再注射一次，bFGF組注射1 gbFGF(1 g的bFGF溶于1 mL 1透明質(zhì)酸鈉)，對(duì)照組膝關(guān)節(jié)注射透明質(zhì)酸鈉1 mL。術(shù)后3個(gè)月經(jīng)耳緣靜脈注射空氣處死動(dòng)物。取股骨髁標(biāo)本進(jìn)行掃描電鏡及組織切片行形態(tài)學(xué)等觀察。1.2  組織切片光鏡觀察 bFGF組和對(duì)照組分別取8個(gè)標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)磷酸緩沖液清潔，用40 g/L的多聚甲醛PBS固定48 h。修整標(biāo)本后，在100 g/L的乙二胺四乙酸中脫鈣。每周換液一次，利用針刺法確定脫鈣情況，67周脫鈣徹底后，于軟骨缺損中部橫行切斷，每一標(biāo)本分為2部分

9、，一部分用于組織切片光鏡觀察，一部分用于掃描電鏡觀察。組織切片觀察標(biāo)本經(jīng)流水沖洗后，乙醇逐級(jí)脫水透明，石蠟包埋，連續(xù)5 m切片，常規(guī)HE染色，OlympusBH2顯微鏡下觀察，并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。1.3  掃描電鏡觀察 掃描電鏡，標(biāo)本置2戊二醛磷酸緩沖液中固定24 h(4)，用10 g/L四氧化鋨固定2 h，乙醇逐級(jí)脫水，臨界點(diǎn)干燥后，黏附于載物臺(tái)上，真空噴金，環(huán)境掃描電鏡(XL30，ESEM)觀察關(guān)節(jié)表面的情況。1.4  透射電鏡觀察 bFGF組和對(duì)照組分別取4個(gè)標(biāo)本，于軟骨缺損局部取修復(fù)組織，軟骨修復(fù)組織放入2戊二醛磷酸緩沖液中(含0.2釕紅)，置4冰

10、箱中固定48 h。將標(biāo)本修整為寬約1.0 mm的長(zhǎng)條形，PBS漂洗；1的四氧化鋨固定2 h，再PBS漂洗；乙醇逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片；醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙重染色；Hitachi600透射電鏡觀察軟骨修復(fù)細(xì)胞及膠原纖維上蛋白多糖顆粒的變化。         2  結(jié) 果2.1  光鏡觀察 對(duì)照組缺損局部只有部分修復(fù)組織，關(guān)節(jié)面不平整，修復(fù)細(xì)胞排列紊亂(見(jiàn)圖1)。bFGF組修復(fù)軟骨組織與周圍軟骨平齊，關(guān)節(jié)表面較平整，修復(fù)細(xì)胞密度較高，排列較為雜亂(見(jiàn)圖2)。 

11、0; 利用Sellers等1對(duì)骨軟骨缺損修復(fù)組織的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，Sellers對(duì)骨軟骨修復(fù)組織的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括缺損的修復(fù)程度、修復(fù)細(xì)胞形態(tài)、修復(fù)組織與臨近軟骨組織的整合、修復(fù)組織表面情況，軟骨下骨形成情況及潮標(biāo)形成情況等8方圖2  術(shù)后3個(gè)月，bFGF組關(guān)節(jié)軟骨缺損能修復(fù)，關(guān)節(jié)面基本平整(HE，×100)面，最低0分，最高31分。分?jǐn)?shù)越低，表明修復(fù)組織質(zhì)量越好。應(yīng)用bFGF側(cè)為10.7±3.6，未用bFGF側(cè)為18.4±4.1，兩組間t檢驗(yàn)P0.05，表明bFGF組優(yōu)于對(duì)照組。2.2  透射電鏡觀察 對(duì)照組修復(fù)細(xì)胞形態(tài)多樣，似成纖維

12、細(xì)胞，膠原纖維上蛋白多糖顆粒較少(見(jiàn)圖3)。bFGF組修復(fù)細(xì)胞似軟骨細(xì)胞，有較多的蛋白多糖顆粒與膠原纖維結(jié)合(見(jiàn)圖4)。2.3  掃描電鏡觀察 對(duì)照組關(guān)節(jié)面不平整，修復(fù)組織表面粗糙，與鄰近關(guān)節(jié)軟骨之間有裂隙存在，軟骨下骨與周圍的軟骨下骨尚未平齊。實(shí)驗(yàn)組軟骨下骨與鄰近的軟骨下骨基本平齊，關(guān)節(jié)表面較為平整，修復(fù)組織與鄰近關(guān)節(jié)軟骨間有裂隙存在。3  討 論   較小的骨軟骨缺損可以修復(fù)，較大的骨軟骨缺損難以修復(fù)，原因之一可能是局部缺乏足夠的修復(fù)細(xì)胞數(shù)量及軟骨細(xì)胞分化不足2。目前，增加局部修復(fù)細(xì)胞數(shù)量的方法主要有兩種：a)利用組織工程的方法，將軟骨細(xì)胞

13、或骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞等分離培養(yǎng)，增殖后移植到軟骨缺損的部位，直接增加局部的修復(fù)細(xì)胞數(shù)量；b)利用骨膜、軟骨膜移植或局部應(yīng)用生長(zhǎng)因子，通過(guò)促進(jìn)局部細(xì)胞的分裂增殖，增加局部的修復(fù)細(xì)胞數(shù)量。在生長(zhǎng)因子中，bFGF、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGF)、骨形成蛋白2(BMP2)等多種生長(zhǎng)因子均可促進(jìn)細(xì)胞的增殖分裂。體外研究表明，bFGF是最強(qiáng)的促細(xì)胞有絲分裂劑，它可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖13.5倍3。有研究表明，TGF1、BMP2可促進(jìn)軟骨基質(zhì)的鈣化，導(dǎo)致滑膜增生，出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨壞死等病理變化。故我們選用bFGF。結(jié)果與Cuevas等4觀察到的bFGF促進(jìn)較大范圍軟骨缺損的修復(fù)情況相似，修復(fù)組織為類透明軟骨，無(wú)明顯滑膜增

14、生及軟骨壞死。   生長(zhǎng)因子為蛋白質(zhì)，在體內(nèi)可被降解，其在生物體內(nèi)的半衰期較短，如TGF的半衰期不超過(guò)1 h。利用同位素標(biāo)記的bFGF在關(guān)節(jié)內(nèi)也只能維持幾小時(shí)5，其生物半衰期不超過(guò)6 h。為充分發(fā)揮生長(zhǎng)因子在體內(nèi)的作用，需延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子的作用時(shí)間。主要有以下三種方法：a)利用微泵持續(xù)局部給藥，維持局部有效的藥物濃度；b)采用多次反復(fù)注射的方法；c)將生長(zhǎng)因子與載體結(jié)合，讓生長(zhǎng)因子緩慢緩放。所用載體有膠原、透明質(zhì)酸鈉、明膠海綿等67。實(shí)驗(yàn)研究表明，用透明質(zhì)酸鈉作為bFGF的載體，可減少bFGF用量，延長(zhǎng)其生物學(xué)作用時(shí)間。我們將生長(zhǎng)因子溶于透明質(zhì)酸鈉中并用明膠海綿作為載體，希望起

15、到緩釋的作用。   在骨軟骨缺損的修復(fù)過(guò)程中，2周內(nèi)是間充質(zhì)干細(xì)胞增生的主要階段。當(dāng)局部有足夠數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞后，在關(guān)節(jié)內(nèi)低氧張力、高應(yīng)力的環(huán)境下，會(huì)促使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。同時(shí)bFGF促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用與局部細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)，在低密度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，在高密度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖作用不明顯。我們注射用三次就是希望bFGF在細(xì)胞增生階段發(fā)揮最大作用。   關(guān)于生長(zhǎng)因子的用量，在體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)中，不同的劑量有不同的作用。bFGF、TGF在高低不同的濃度下，可起相反的作用8。在體內(nèi)當(dāng)bFGF用量較大時(shí)，也會(huì)影響正常軟骨細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)修復(fù)軟骨缺損，bF

16、GF的最適用量尚不清楚，我們參照Andreshak等在體內(nèi)應(yīng)用bFGF的用量。   應(yīng)用bFGF后的軟骨修復(fù)組織與正常關(guān)節(jié)軟骨有別，間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化是由多種因子調(diào)節(jié)的結(jié)果。多種因子的聯(lián)合應(yīng)用及在不同的階段用不同的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞的增殖、分化，可能會(huì)進(jìn)一步提高組織修復(fù)的質(zhì)量?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Sellers RS，Peluso D，Morris EA，et al.The effect of recombinant human bone morphogenetic protein2(rhBMP2) on the healing of fullthi

17、ckness defects of articular cartilageJ.J Bone joint Surg(Am)，1997，79(10)：14521463.2Metsaranta M，Kujala UM，Pelliniemi L，et al.Evidence for insufficient chondrocytic differentiation during repaire of fullthickness defects of articular cartilageJ.Matrix Biol，1996，15(1)：3947.3Stevens P，Shatzen EM.Synerg

18、ism of basic fibroblast growth factor and interleukin1 beta to induce articular cartilagedegradation in the rabbitJ.Agents Actions，1991，34(12)：217219.4Cuevas P，Burgos J，Baird A.Basic fibroblast growth factor(FGF) promotes cartilage repair in vivoJ.Biochem Biophys Res Commun，1988，156(2)：611618.5Shida JI，Jingushi S，Izumi T，et al.Basic fibroblast growth factor stimulates articular cartilage en