微生物基因組學(xué)

1、微生物基因組學(xué)微生物基因組學(xué)微生物基因組研究概況微生物基因組的特點(diǎn)微生物基因組研究的意義微生物基因組學(xué)微生物基因組學(xué)一 微生物基因組研究概況1986年: 美國(guó)DOE啟動(dòng)MGP1994年: DOE項(xiàng)目轉(zhuǎn)向項(xiàng)目轉(zhuǎn)向 環(huán)境或能源相關(guān)環(huán)境或能源相關(guān) 系統(tǒng)發(fā)生學(xué)相關(guān)系統(tǒng)發(fā)生學(xué)相關(guān) 潛在商業(yè)應(yīng)用性潛在商業(yè)應(yīng)用性 的微生物的微生物1995年:Science發(fā)表第一株細(xì)菌流感嗜血桿發(fā)表第一株細(xì)菌流感嗜血桿菌全基因組菌全基因組 19952002年原核生物全基因組測(cè)序情況051015202519951996199719981999200020012002已完成測(cè)序的病原原核生物（40株）金黃色葡萄球菌（Staph

2、ylococcus aureus，SaurN） 3 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，Spneu） 2化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes，Spyo） 2腦膜炎奈瑟菌 （Neisseria meningitidis，Nmen） 2沙門(mén)氏菌（S. typhi; S. typhimurium ) 2 空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，Cjej） 1大腸桿菌（E. coli O157:H7，Ecoli_O157） 2幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hpyl ） 2霍亂弧菌（Vibrio cholerae，Vch

3、o） 1已完成測(cè)序的病原原核生物鼠疫耶氏菌（Yersinia pestis） 3布魯氏菌（Brucella melitensis 16M） 1梭菌（Fusobacterium nucleatum 1流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hinf） 1 麻風(fēng)分枝桿菌（M. leprae，Mlep） 1 結(jié)核分枝干菌（M. tuberculosis，Mtub) 2巴斯德氏菌（Pasteurella multocida，Pmul） 1李斯德桿菌（Listeria monocytogenes） 1綠膿假單孢菌（P. aeruginosa，Paer） 1已完成測(cè)序的病原原核生物沙眼

4、衣原體（Chlamydia trachomatis，Ctra） 2肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，Cpneu） 3 生殖道枝原體（M. genitalium，Mgen） 1肺炎枝原體（M. pneumoniae，Mpneu） 1支氣管枝原體（M. pulmonis，Mpul 1溶脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，Uure） 1 立克次體（Rickettsia prowazekii，Rpxx） 2梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tpal） 1伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi，Bbur） 1二二 微生物基因組的特點(diǎn)

5、微生物基因組的特點(diǎn) 原核生物基因組的大小原核生物基因組的大小原核生物基因組的編碼序列原核生物基因組的編碼序列( (CDS/ORF)CDS/ORF)原核生物染色體結(jié)構(gòu)原核生物染色體結(jié)構(gòu)GC GC 含量含量重復(fù)序列重復(fù)序列DNADNA鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性最小基因組最小基因組1. 1. 原核生物基因組的大小原核生物基因組的大小-基因組較小的原核生物基因組較小的原核生物ProkaryocyteProkaryocyte Genome(kb) ORF Genome(kb) ORFMycoplasma genitalium G-37B0 580 468Buchnera sp 640 583Buc

6、hnera aphidicola SG 641 545Glossina brevipalpis 679 621Ureaplasma urealyticum serovar 3B0 751 613Mycoplasma pneumoniae M129B0 816 677Mycoplasma pulmonis 963 782Borrelia burgdorferi B31B1 910 853Treponema pallidumNichols B1 1,138 1,041Chlamydia trachomatis serovar D 1,042 894Chlamydia trachomatis MoP

7、nB1 1,069 924Chlamydia pneumoniae J138 1,228 1,070Chlamydia pneumoniae AR39B1 1,229 1,052Chlamydia pneumoniae CWL029B1 1,230 1,052Rickettsia conorii Malish 7 1,268 1,374Rickettsia prowazekii Madrid EB1 1,111 8341.1. 原核生物基因組的大小原核生物基因組的大小-基因組較大的原核生物基因組較大的原核生物ProkaryocyteProkaryocyte Genome(kb) ORF Gen

8、ome(kb) ORFXanthomonas campestris 5,076 4,182Xanthomonas axonopodis 5,273 4,386Methanosarcina acetivorans C2A 5,751 4,540Ralstonia solanacearum GMI1000 5,810 5,120Escherichia coli O157:H7. Sakai 5,996 5,448Pseudomonas aeruginosa PAO1B6 6,264 5,570Nostoc sp. PCC 7120 6,413 5,366Sinorhizobium meliloti

9、 6,690 6,205Mesorhizobium loti MAFF303099 7,036 6,752Streptomyces coelicolor A3(2) 8,667 7,8251. 1. 原核生物基因組的大小原核生物基因組的大小-真核生物基因組的大小真核生物基因組的大小 ChrChr. Genome(kb) ORF. Genome(kb) ORFGuillardia theta 3 551 464Encephalitozoon cuniculi 1 2,500 1,997Saccharomyces cerevisiae S288C 16 12,069 6,294Schizosacc

10、haromyces pombe 3 14,000 4,824Caenorhabditis elegans 6 97,000 19,099Arabidopsis thaliana 5 115,428 25,498Drosophila melanogaster 6 137,000 14,100Oryza sativa L. ssp. Indica 12 420,000 50,000Oryza sativa ssp. Japonica 12 420,000 50,000Homo sapiens 24 3,000,000 30,000Dictyostelium discoideum Chr. 2 6

11、8,000 2,799Leishmania major Friedlin Chr. 1 36 257 79Plasmodium falciparum 3D7 Chr. 3 14 1,060 220Plasmodium falciparum 3D7 Chr. 2 14 947 2052. 原核生物基因組的編碼序列(Coding sequence) 占原核生物基因組總序列的90 基因的平均大小為1kb ORF2. 2. 原核生物基因組的編碼序列原核生物基因組的編碼序列 不同生物編碼序列的比不同生物編碼序列的比較較Organism Genome (kb) ORFs ORF size Coding S

12、equence(%)Buchnera sp 640 583 988 90Aquifex aeolicus 1,551 1,512 956 93Saccharomyces cerevisiae 12,069 6,294 1,092 57 Schizosaccharomyces pombe 14,000 4,820 2,033 70 Caenorhabditis elegans 97,000 19,099 1,311 27 Arabidopsis thaliana 115,428 25,498 460 29Homo sapiens 3,000,000 3,100 1,340 87 5. 5. 重復(fù)

13、序列重復(fù)序列騰沖嗜熱厭氧菌基因組的部分重復(fù)序列（續(xù)）騰沖嗜熱厭氧菌基因組的部分重復(fù)序列（續(xù)） Long, coding repeats Copies Repeat ID length Complete Partial Identity (%) Database matchTLR028b3,5654599 Transposase + hypothetical TLR393c3,0452198 ABC transporters + hypothetical TLR3152,603294 ABC transporters + Permease TLR4082,490298 Ferredoxin ox

14、idoreductases, TLR0762,021291 Hypothetical proteinTLR2712,020292 ABC transportersTLR2641,9865198 TransposaseTLR2941,851298 ABC transporters + PermeaseTLR0041,8191498 TransposaseTLR0051,800798 TransposaseTLR1581,7741289TPR-repeat-containing proteinsTLR0481,711299 TransposaseTLR2231,629297 Transposase

15、TLR0081,5962192 Hypothetical proteinTLR0141,59214387 Hypothetical protein 5.5.重復(fù)序列重復(fù)序列 Number of repeats by type in N. meningitidis Z2491 Type Size (bp) FrequencyDNA uptake sequence: gccgtctgaa 10 1,892RS 24161 681dRS3: attcccnnnnnnnngggaat 20 772Correia (full) 150159 173Correia (internal deletion)

16、104 84Correia (partial) 37145 29ATR 183 19REP 2 59154 26REP 3 60 13REP 4 26 20REP 5 20 9IS1016 256740 14 (including partial)IS1106 2631219 22 (including partial)IS1655 1,0741,257 7 (including partial)Prophage 2,33038,964 5Correia elements (CEs, 156-bp sequences bounded by 26-bp inverted repeats) 5.5

17、.重復(fù)序列重復(fù)序列 Largest families of Largest families of paralogousparalogous genesgenes Family Number of genes (total 312) (total 853) ATP-binding subunits of ABC transporters 23Reductases/dehydrogenases 12Two-component system, regulatory proteins 12Hypothetical proteins 10Transcriptional regulators 9Fimb

18、rial proteins 9Two-component system, sensor proteins 96. DNA6. DNA鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性 GCGC分布不對(duì)稱(chēng)分布不對(duì)稱(chēng) （GC skewGC skew） AT AT分布不對(duì)稱(chēng)（分布不對(duì)稱(chēng)（AT skewAT skew）前導(dǎo)鏈含有較多的前導(dǎo)鏈含有較多的G G（A A） 而后隨鏈含有較多的而后隨鏈含有較多的C C（T T） 計(jì)算公式為（計(jì)算公式為（nG-nCnG-nC）/ /（nG+nCnG+nC） （nA-nTnA-nT）/ /（nA+nTnA+nT） 累計(jì)累計(jì)skew skew （cumulative skew)cum

19、ulative skew)用于復(fù)制起點(diǎn)和終點(diǎn)的定位用于復(fù)制起點(diǎn)和終點(diǎn)的定位6. DNA鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性（真細(xì)菌） 基因方向性偏好基因方向性偏好 基因方向性偏好基因方向性偏好 （gene orientation biasgene orientation bias） 先導(dǎo)鏈上編碼的基因總是多于后隨鏈先導(dǎo)鏈上編碼的基因總是多于后隨鏈6. DNA鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性（真細(xì)菌） GC skewGC skew， AT skew AT skew ， gene orientation bias gene orientation bias Organism (34株株) Gene biasc(%)GC skewd

20、AT skeweTten 86.7 0.1920.075Llact 80.7 0.0990.034Mgen 80.4 0.0450.045 Spneu 80.2 0.102 0.016Spyo 79.4 0.0940.022Cace 79.0 0.2120.078Bhal 77.4 0.1000.034 Mpneu 77.3 0.014 0.022 SaurN 74.7 0.122 0.051Bsub 74.2 0.0790.045Uure 68.1 0.0590.029 Bbur 66.2 0.182 - 0.086 . Ccre 54.3 0.016 - 0.014GC skewd of

21、of T. T. tengcongensistengcongensis genomegenomeCircular representation of the genome of T. tengcongensis MB46. DNA鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性 密碼子使用偏好（密碼子使用偏好（codoncodon usage bias usage bias） 先導(dǎo)鏈和后隨鏈密碼子的不同 在先導(dǎo)鏈，以G或T開(kāi)頭或結(jié)尾的密碼子顯著地多于后隨鏈，常見(jiàn)的有GTG、GCG和GAG 在后隨鏈以C或A開(kāi)頭或結(jié)尾的密碼子多于先導(dǎo)鏈，如CTC、GCC、CCC、ATC和ACC6. DNA鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性 原核生物基因組先導(dǎo)鏈和

22、后隨鏈密碼組成的差異原核生物基因組先導(dǎo)鏈和后隨鏈密碼組成的差異 Org. Bases Codon bases AA Codons - + - + - + - +Smel C GC3A3 G3G1T3 T P V E GCC CCC ACC CTC GGT GGG GTT GAG Ecoli C GC3 G3 G1 T H I V G GCC CCC ACC CTC GCG GTG CGT GGGHinf C GT C3 G3 T3 T N P V ACC GCC CTC AAC GAG GTG CGT GCTTacid C GC3C1 G3 H L DT V Q ACC CCC GCC CTC

23、 GGT CCG GTG CAG Nmen C GC3A3 G3 T I HP V M CTC GCC GGC CTA TTG GAG GCG GGT Ctra C GC3C1 G3G2G1 T P IL V G R CTC CGC CTA CAA GGG GAG AAG GTG Cpneu C GC3C1 G3G2G1 T I PN V R CTA ATC CAA AAC TTG GTT GTG GATCcre C GT A3C3 G3 T P H V G E CCC GCC CGC ACA GGG GCT GGT CGT每一株原核生物的密碼子、氨基酸及組成密碼子的核苷酸等的使用情況。每組最

24、后一位的頻率大于或等于本組最大值的一半?！啊北硎鞠葘?dǎo)鏈，“”表示后隨鏈。 6. DNA鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性 基因密度和密碼子使用的差別基因密度和密碼子使用的差別 高度表達(dá)基因: 核蛋白體蛋白基因，與翻譯和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的因子基因，分子伴侶基因和與主要的能量代謝相關(guān)的基因 大多編碼于前導(dǎo)鏈通常都有密碼子偏好(核蛋白體蛋白基因密碼子的第三位多為G )快速生長(zhǎng)的細(xì)菌（大腸桿菌、霍亂弧菌、枯草芽孢桿菌和流感嗜血桿菌） 主要的糖酵解和三羧酸循環(huán)基因?yàn)楦叨缺磉_(dá)基因產(chǎn)甲烷菌，與甲烷代謝有關(guān)的基因?yàn)楦叨缺磉_(dá)基因 高度表達(dá)基因高度表達(dá)基因: 那些在密碼子使用上與一般基因相差很大，與核蛋白體蛋白基因，那些在密碼子使用上與一

25、般基因相差很大，與核蛋白體蛋白基因，翻譯和轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，伴侶翻譯和轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，伴侶-降解蛋白基因等在密碼子使用上高度相似的基因?yàn)楦呓到獾鞍谆虻仍诿艽a子使用上高度相似的基因?yàn)楦叨缺磉_(dá)基因度表達(dá)基因。 6. DNA鏈組成的非對(duì)稱(chēng)性 信號(hào)序列等寡核苷酸序列的分布不同信號(hào)序列等寡核苷酸序列的分布不同 大腸桿菌的序列：富含G的8核苷酸序列 （GCTGGTGG）共1000多拷貝，其中75 % 位于前導(dǎo)鏈 7. 最小基因組最小基因組：細(xì)胞必需的最少基因數(shù)細(xì)胞必需的最少基因數(shù) 最小基因組最小基因組：一個(gè)獨(dú)立生存的細(xì)胞生命至少需要多少個(gè)基因一個(gè)獨(dú)立生存的細(xì)胞生命至少需要多少個(gè)基因MycoplasmaMyco

26、plasma genitaliumgenitalium： 580,070 580,070 bpbp; 468; 468（480480） ORFs ORFs；3737個(gè)個(gè)RNARNA基因基因 基因組構(gòu)成基因組構(gòu)成：具有復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)必需基因具有復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)必需基因 具有具有DNADNA復(fù)制所必需的許多蛋白質(zhì)復(fù)制所必需的許多蛋白質(zhì) 具有轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶具有轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶 具有表達(dá)有關(guān)基因：具有表達(dá)有關(guān)基因： 一個(gè)一個(gè)rRNArRNA operon operon（16s16s23s23s5s5s），）， 33 33個(gè)個(gè)tRNAtRNA基因，全部氨基酰基因，全部氨基酰tRNAtRNA合成酶基因合成酶基

27、因 7. 7. 最小基因組最小基因組： MycoplasmaMycoplasma genitaliumgenitalium基因組構(gòu)成基因組構(gòu)成 DNA修復(fù)基因很少 氨基酸和輔助因子生物合成相關(guān)基因極少 能量代謝途徑中有許多重要基因不存在： 如厭氧代謝途徑、電子傳遞鏈、ED途徑、發(fā)酵、 糖異生和三羧酸循環(huán)相關(guān)的基因全無(wú) 脂肪酸和磷脂代謝基因很少 調(diào)控基因極少7. 7. 最小基因組：最小基因組：MycoplasmaMycoplasma genitaliumgenitalium支原體的系統(tǒng)發(fā)生支原體的系統(tǒng)發(fā)生 ： 鏈球菌（6億年前，2,000 kb） 支原體分支（4.5億年前，17002,000 k

28、b） 支原體2個(gè)亞系（1,2001,700 kb） 多個(gè)支原體亞系（6001,100 kb）7. 7. 最小基因組：最小基因組：MycoplasmaMycoplasma genitaliumgenitalium支原體與流感嗜血桿菌的種間同源基因比較分析 240個(gè)種間同源基因個(gè)種間同源基因 22個(gè)非種間同源基因個(gè)非種間同源基因 6個(gè)功能重復(fù)或?qū)I(yíng)寄生的基因個(gè)功能重復(fù)或?qū)I(yíng)寄生的基因 = 256個(gè)基因個(gè)基因除7個(gè)DNA復(fù)制必需的基因外，絕大多數(shù)基因都在真核生物和古細(xì)菌中找到同源基因7.最小基因組最小基因組：MycoplasmaMycoplasma genitaliumgenitalium兩種支原體

29、(M.genitalium,M.pneumoniae)基因組的 插入突變分析插入突變分析 2209個(gè)突變 1354個(gè)位點(diǎn) 319個(gè)基因（其中243個(gè)基因失去功能） 129個(gè) M.genitalium（480 Genes） 基因失去功能M.genitalium細(xì)胞必需的最少基因數(shù)為：265350個(gè)7. 7. 最小基因組最小基因組：枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 酵母酵母枯草桿菌：300560 個(gè)基因 （Itaya 用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入，敲除枯草桿菌基因）酵母（6294 genes）： 1000個(gè)基因（Winzeler 的PCR介導(dǎo)基因中止策略，用含同源序列的特異序列標(biāo)簽的PCR產(chǎn)物，導(dǎo)入菌體中同源重組刪除

30、目的基因）三三 微生物基因組研究的意義微生物基因組研究的意義基因組研究在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用基因組研究在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用 基因組研究的生物技術(shù)應(yīng)用基因組研究的生物技術(shù)應(yīng)用 微生物的進(jìn)化微生物的進(jìn)化 A A 基因組研究在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用基因組研究在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用 1致病相關(guān)基因的鑒定致病相關(guān)基因的鑒定 2設(shè)計(jì)特異的實(shí)驗(yàn)診斷方法設(shè)計(jì)特異的實(shí)驗(yàn)診斷方法3疫苗的研究疫苗的研究 4新型抗生素的開(kāi)發(fā)新型抗生素的開(kāi)發(fā) 1. 1. 致病相關(guān)基因的鑒定致病相關(guān)基因的鑒定 通過(guò)基因組比較鑒定病原相關(guān)基因流感桿菌： 7種內(nèi)毒素（脂多糖）基因25種新基因 細(xì)胞表面定居的粘附分子重復(fù)序列1. 1. 致病相關(guān)基因的鑒定致病相關(guān)基因的鑒定 致病相關(guān)

31、基因的預(yù)測(cè)致病物質(zhì)多為病原體細(xì)胞壁成分、 表面蛋白和一些分泌性蛋白質(zhì) PHD預(yù)測(cè)基因組的跨膜蛋白預(yù)測(cè)基因組的跨膜蛋白 SIGNALP預(yù)測(cè)分泌性蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分泌性蛋白質(zhì) 1. 1. 致病相關(guān)基因的鑒定致病相關(guān)基因的鑒定 致病相關(guān)基因的預(yù)測(cè)（續(xù)）功能相同的蛋白質(zhì)往往相鄰并受共同的調(diào)控序列調(diào)控 operon同一菌種的致病菌株與非致病菌株的基因組進(jìn)行比較 E. coli K12 MG 1655 4.1 + 0.53 M (528genes) E. coli O157:H7 EDL 933 4.1 + 1.34 M (1387genes)2. 2. 設(shè)計(jì)特異的實(shí)驗(yàn)診斷方法設(shè)計(jì)特異的實(shí)驗(yàn)診斷方法尋找高度特異

32、的核酸序列尋找高度特異的核酸序列 實(shí)驗(yàn)技術(shù) PCR 雜交技術(shù)（Microarray，DNA chip) 應(yīng)用 鑒定病原種類(lèi)進(jìn)行臨床診斷 病原分型的流行病學(xué)研究 預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展及臨床療效3. 3. 疫苗的研究疫苗的研究通過(guò)全基因組序列的同源性比較，尋找致病菌的屬特屬特異、群特異、種特異、型特異、甚至亞型特異異、群特異、種特異、型特異、甚至亞型特異的抗原的抗原 Pizza等和Tettelin等對(duì)血清型B腦膜炎奈瑟菌腦膜炎奈瑟菌近350種抗原的研究Wizemann等對(duì)對(duì)肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌的基因組的抗原性蛋白研究 4. 4. 新型抗生素的開(kāi)發(fā)新型抗生素的開(kāi)發(fā) 藥靶的特征：藥靶應(yīng)是病原生物必需的，在進(jìn)化

33、上是保守的病原生物必需的，在進(jìn)化上是保守的可作為藥靶的微生物基因或蛋白質(zhì): 毒力基因、毒力基因、必需基因、菌種專(zhuān)一基因、獨(dú)特酶類(lèi)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)必需基因、菌種專(zhuān)一基因、獨(dú)特酶類(lèi)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等蛋白等 毒力基因作為靶位毒力基因的發(fā)現(xiàn)：非致病菌（E.coli K12)與致病菌（ E.coli O157, 沙門(mén)氏菌，耶爾森氏菌）基因組的比較致病島(Pathogenicity islands)編碼的功能已知蛋白作為藥靶必需基因作為藥靶尋找必需基因的方法： 比較基因組：在不同進(jìn)化階段保守的基因 往往是必需基因 缺失致死或轉(zhuǎn)座子插入 轉(zhuǎn)座子插入PCR尋找流感嗜血桿菌， 肺炎鏈球菌必需基因 致病菌特殊且必需的蛋白作為

34、靶位 菌種專(zhuān)一基因作為藥靶尋找菌種專(zhuān)一基因的方法： 比較基因組方法病原生物基因組中存在但病原生物基因組中存在但 近緣種屬中缺少的基因可能是致病關(guān)鍵基因近緣種屬中缺少的基因可能是致病關(guān)鍵基因幽門(mén)螺桿菌（與大腸桿菌和流感桿菌比較）找到594個(gè)特有基因，73個(gè)編碼種專(zhuān)一蛋白，如丙酮酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶，可作為靶位獨(dú)特酶類(lèi)作為藥靶所有細(xì)菌獨(dú)特酶類(lèi)均可作為靶位： 如： 參與細(xì)胞壁合成的酶類(lèi) 葉酸合成酶類(lèi) 核酸合成酶類(lèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為靶位衣原體和立克次體的ATP/ADP轉(zhuǎn)位酶是致病菌必需，而只有植物葉綠體、線粒體具有類(lèi)似酶細(xì)菌多藥運(yùn)輸?shù)鞍祝ū茫┬滦涂股氐拈_(kāi)發(fā)新型抗生素的開(kāi)發(fā)藥靶的種類(lèi)共有藥靶共有藥靶菌種或某菌種的致病菌株的特異性藥靶菌種或某菌種的致病菌株的特異性藥靶 某一部位常見(jiàn)致病菌的共同藥靶某一部位常見(jiàn)致病菌的共同藥靶 新型抗生素的開(kāi)發(fā)新型抗生素的開(kāi)發(fā)Timothy等的研究：肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，腦膜炎奈瑟菌肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，