細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的問(wèn)題題庫(kù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的問(wèn)題2006-11-23 15:53細(xì)胞中的顆粒到底是怎么回事？我的細(xì)胞總有顆粒， 開(kāi)始是細(xì)胞中有， 后來(lái)細(xì)胞之間也好像有許多顆粒。好像是細(xì)胞碎片一樣。是什么東西??？是支原體污染嗎？這可是我剛買(mǎi)回來(lái)的細(xì)胞啊!我們實(shí)驗(yàn)室也有這種情況， 是不是黑的小碎片， 有人說(shuō)是細(xì)胞代謝產(chǎn)物， 后來(lái)拿到高倍鏡下看還會(huì)動(dòng)，就懷疑是污染了，也想問(wèn)問(wèn)大家到底是什么是黑色的小碎片。 我沒(méi)注意到它會(huì)動(dòng)， 只是覺(jué)得不像是活的微生物。 我覺(jué)得是由于某種污染或外界因素導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)變差， 裂解出的東西。 但是，是什么東西不清楚。的確很常見(jiàn)在以前帖子見(jiàn)到說(shuō)是“黑焦蟲(chóng)”。 長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的很容易出現(xiàn)， 我根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)

2、估計(jì)是一種污染，因?yàn)殡S著黑點(diǎn)增多，本來(lái)生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞逐漸停滯甚至死亡。而且我后來(lái)原代培養(yǎng)的幾批細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)， 我懷疑有好多細(xì)胞系本身就是污染的。不過(guò)增加換液次數(shù)的情況下，好象一般不太嬌氣的細(xì)胞生長(zhǎng)不是很受影響。以前聽(tīng)很有經(jīng)驗(yàn)的老師說(shuō)黑焦蟲(chóng)是國(guó)產(chǎn)血清的問(wèn)題，可以有條件換進(jìn)口血清試試，或者離心一下也可能能解決問(wèn)題。那么所謂的“黑焦蟲(chóng)”到底是什么東西?。坑姓l(shuí)知道？我培養(yǎng)的細(xì)胞也出現(xiàn)過(guò)此中問(wèn)題， 放到高倍鏡下看時(shí)有東西在動(dòng)， 但培養(yǎng)液不混濁，估計(jì)不是細(xì)菌污染，可能是血清問(wèn)題，是支原體污染。我培養(yǎng)的細(xì)胞也出現(xiàn)過(guò)這樣的問(wèn)題， 我個(gè)人認(rèn)為是一種支原體污染。 國(guó)產(chǎn)血清是罪魁禍?zhǔn)祝驗(yàn)橹灰獙⒓?xì)胞饑餓一下，不超

3、過(guò) 24 小時(shí)，這種東西就會(huì)瘋長(zhǎng)我培養(yǎng)的細(xì)胞也有出現(xiàn)這中情況。但是并不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 應(yīng)該不是支原體污染最近，我復(fù)蘇細(xì)胞細(xì)胞的時(shí)候也發(fā)現(xiàn)過(guò)這樣的東西， 盡管我用的是 GIBCO的 FBS，后來(lái)，每天換液之前洗幾遍后，就慢慢變少，現(xiàn)在沒(méi)了細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)菌污染我們新建的細(xì)胞室。每周都會(huì)做清潔，用0。2%新潔爾滅消毒，照紫外。實(shí)驗(yàn)前也會(huì)照至少 30 分鐘。培養(yǎng)基中加青霉素，鏈霉素?？墒桥囵B(yǎng)細(xì)胞時(shí)還是常有細(xì)菌污染，有時(shí)甚至分析不出原因。 用培養(yǎng)瓶還好一點(diǎn)， 用多孔板或平皿就更凄慘。我養(yǎng)的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不知各位有什么好的方法避免污染！謝謝！很可能是超凈臺(tái)無(wú)效了，或者培養(yǎng)基？其實(shí)嚴(yán)格操作箱污染都難我們是新

4、的超凈臺(tái)，不可能失效。而且用同一瓶培養(yǎng)基，一瓶傳兩瓶，原始的一瓶污染，新傳的很好。所以我分析不出原因呀那么假如把原始的那瓶換新瓶養(yǎng)可以么？都污染了，我仍還來(lái)不及，那還敢換新瓶染菌有很多原因，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)胞操作過(guò)程均要求無(wú)菌，所以看看操作是否規(guī)范，例如戴手套等。多半是環(huán)境因素，做點(diǎn)平板，操作時(shí)放在幾個(gè)地方，培養(yǎng)后看看長(zhǎng)菌情況。消毒用新潔爾滅好象不是太有用。人是最大的污染源， 不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩沒(méi)有， 其實(shí)，只要你操作的好，嚴(yán)格在靠近火的附近操作， 污染的幾率是很小的。 從你的描述中可以看出培養(yǎng)基應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題， 新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不當(dāng)引起的，還需要加強(qiáng)練手。求助！關(guān)

5、于細(xì)胞培養(yǎng)中的真菌污染！感激！先謝謝大家的幫助！ 現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基里出現(xiàn)了很多白色和黑色的小點(diǎn)， 有好長(zhǎng)的時(shí)間了！細(xì)胞的形態(tài)看起來(lái)不太好，但是有些細(xì)胞也長(zhǎng)的很好，如成纖維細(xì)胞，但是內(nèi)皮細(xì)胞就差很多！ 加大量的抗生素沒(méi)有效果！ 不知道是不是真菌污染， 怎么鑒別！因?yàn)榕囵B(yǎng)了很長(zhǎng)時(shí)間都沒(méi)有出現(xiàn)真菌的菌絲， 所以不能肯定是真菌！ 那些白色的小圓點(diǎn)有點(diǎn)象白色鏈球菌或鏈珠菌， 但是不能確定！ 怎么樣才能判斷確定，改用什么辦法解決！謝謝大家的幫助！殺滅真菌聽(tīng)說(shuō)用兩性霉素， 但從沒(méi)試過(guò)。 真菌污染是件很麻煩的事， 可能重新復(fù)蘇細(xì)胞是最好的辦法。同時(shí)該注意如何防止污染。我覺(jué)得如果是真菌污染， 培養(yǎng)基會(huì)渾濁， 是肉

6、眼可見(jiàn)的渾濁。 在這種情況下最好趕緊將該瓶細(xì)胞扔掉， 免得引起培養(yǎng)箱中的大規(guī)摸污染。 在顯微鏡下， 真菌是成念珠狀的，這時(shí)細(xì)胞界限不清。 這可能是不規(guī)范操作引起的， 安全起見(jiàn)還是將細(xì)胞室全面打掃一下，用新潔爾滅擦，紫外照！謝謝大家的幫助，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室以前從來(lái)就沒(méi)有這樣的污染， 所以大家也沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)！現(xiàn)在就是不能確定是不是污染。 我不可能把實(shí)驗(yàn)室所有的細(xì)胞都扔掉， 因?yàn)橛泻枚嗳硕荚谝黄痧B(yǎng)不同類(lèi)型的細(xì)胞！ 現(xiàn)在確實(shí)是問(wèn)題， 培養(yǎng)基也沒(méi)有渾濁， 操作的時(shí)候已經(jīng)十二分的小心了！我想問(wèn)一下，你看到的那些白色或黑色的圓點(diǎn)是在低倍還是高倍顯微鏡下？若培養(yǎng)基不混濁， 可能真的是細(xì)胞狀態(tài)太差，沒(méi)有貼壁還縮成球狀。

7、難道你們實(shí)驗(yàn)室所有細(xì)胞都用一瓶培養(yǎng)基？只要將污染的扔掉就行，沒(méi)必要都扔掉！兩性霉素！ sigma 在華美有分裝！但是濃度很小，關(guān)鍵還是環(huán)境問(wèn)題！黑白圓點(diǎn)在 100 倍顯微鏡下有多大，是不是酵母菌小黑點(diǎn)和小白點(diǎn)是在 200 倍的顯微鏡下觀察所見(jiàn)，大小可能是細(xì)胞核的 1/5 到 1/4 左右！細(xì)胞狀態(tài)不好是因?yàn)楦郧芭囵B(yǎng)的細(xì)胞來(lái)比較所得，細(xì)胞能貼壁，能生長(zhǎng)，但是沒(méi)有以前的那么快，而且形態(tài)看的也不好！另外問(wèn)一下sleevexz ，酵母菌是什么樣的，怎么鑒別！還有一個(gè)問(wèn)題就是，實(shí)驗(yàn)室用的雙抗是從Gibco 公司買(mǎi)過(guò)來(lái)的直接使用的液體，具體規(guī)格是 100ml 一瓶， Pelicillin-Strepto

8、mycin 一起， 50 倍的，要求儲(chǔ)存在 20 C，但是有效期只到 2002 年 9 月，現(xiàn)在都已經(jīng)差不多過(guò)期半年了，但是實(shí)驗(yàn)室的老師都說(shuō)沒(méi)有問(wèn)題，可以用，現(xiàn)在大家就都是一直用這樣的抗生素在！你們說(shuō)會(huì)不會(huì)是抗生素的問(wèn)題的！養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)常無(wú)緣無(wú)辜的染菌？煩煩煩！我是一個(gè)新手，但已養(yǎng)細(xì)胞近半年，最近一段時(shí)間經(jīng)常染菌，有時(shí)是培養(yǎng)基，有時(shí)連原因都找不到，在實(shí)驗(yàn)中我也非常小心，但結(jié)果總讓我傷心。現(xiàn)在都有點(diǎn)神經(jīng)質(zhì)了，請(qǐng)各位指點(diǎn)你這個(gè)問(wèn)題說(shuō)大不大，說(shuō)小也不小。說(shuō)不大呢，七個(gè)字就可以回答你：嚴(yán)格按照無(wú)菌要求。說(shuō)不小呢，這無(wú)菌要求的話(huà)匣子一打開(kāi)太大。還是簡(jiǎn)要吧： 1. 將試驗(yàn)用品放入超凈工作臺(tái)用紫外線(xiàn)照射 30

9、分鐘； 2. 照射 30 分鐘后，進(jìn)入緩沖間，換滅菌的無(wú)菌衣，換專(zhuān)用拖鞋； 3. 手部用 5的潔爾滅浸泡 2 分鐘，進(jìn)入潔凈區(qū)后，用 75的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。 4. 最好戴口罩； 5. 操作時(shí)盡量靠近火焰；6. 裝培養(yǎng)基的瓶子等不要直接口向上， 用一個(gè)架子斜放，瓶口朝向火焰；7. 標(biāo)準(zhǔn)操作，不要讓無(wú)菌吸管到處碰來(lái)碰去； 8. 中途出入無(wú)菌室，再次操作時(shí)，一定要再次用 75的酒精棉球消毒。一下也想不了那么多， 具體的你再問(wèn)吧。 最好把你怎么操作的過(guò)程描述一遍， 我們就好針對(duì)性的指出錯(cuò)誤了。建議你把細(xì)胞室，好好清理一下，污染是這樣的，出現(xiàn)一次就比較麻煩，千萬(wàn)別急。還有，你們的紫外燈沒(méi)有問(wèn)

10、題吧？非常感謝樓上的回信， 在操作中我也嚴(yán)格按照無(wú)菌要求去做， 因?yàn)椴僮髋_(tái)是公用的，而其它同學(xué)很少染菌，我想主要問(wèn)題應(yīng)在我身上，但是又找不到主要原因。我一般是這樣操作的： 紫外照后， 用酒精棉檫拭手部開(kāi)始操作， 基本步驟是吸培養(yǎng)液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例傳代，有時(shí)吸管頭部碰在培養(yǎng)瓶口，有時(shí)吸管口棉花塞的太緊或太松不好用，有時(shí)原因都找不到，請(qǐng)各位指點(diǎn)。戴手套試試巴最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰別處立即更換。污染是常有的事，也不必太給自己壓力，熟能生巧。你的滴管吸管進(jìn)培養(yǎng)液瓶和細(xì)胞培養(yǎng)瓶前要在酒精燈上仔細(xì)烤一下， 滴管不要反復(fù)用。其實(shí)無(wú)菌操作第一重要的就是你的超凈臺(tái)是不是還能用

11、， 濾網(wǎng)要及時(shí)清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是過(guò)火的是否正確。還有一點(diǎn)很重要，手一定不能在任何瓶口上方經(jīng)過(guò)！從你操作的步驟來(lái)看， 你的細(xì)胞應(yīng)該是很好操作的。 沒(méi)看到你要用消化液， 這就減少了污染的機(jī)會(huì)。 你用的吸管是自己做的嗎？經(jīng)常練練， 熟能生巧，時(shí)間長(zhǎng)了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。 （用牙簽或 12 號(hào)針頭等工具來(lái)塞比較方便，塞完后用火將露出的部分燒掉再滅菌， 這樣就不會(huì)在上吸耳球的過(guò)程中， 出現(xiàn)將棉花弄掉的情況），另外，你要勤剪指甲，不要戴首飾，吸管一周滅一次菌，不要沒(méi)用完老用。操作是導(dǎo)致污染的最主要原因根據(jù)本人的經(jīng)驗(yàn)，操作是導(dǎo)致細(xì)菌污染的最主要原因。本人以前曾經(jīng)在一個(gè)相當(dāng)

12、嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室工作過(guò)， 那里的細(xì)胞室的要求是按照外科手術(shù)室要求的，更衣，換鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培養(yǎng)液中加雙抗，所有細(xì)胞操作器械專(zhuān)用；每天紫外燈照射 40 分鐘后才允許進(jìn)入。但是，就是這樣的條件，操作不好，一樣要污染?，F(xiàn)在本人工作的實(shí)驗(yàn)室要求比那個(gè)實(shí)驗(yàn)室差的天遠(yuǎn)地遠(yuǎn)，但是只要操作仔細(xì)了，一樣可以把最難養(yǎng)的細(xì)胞養(yǎng)好。 本人曾經(jīng)參觀過(guò)一些名人進(jìn)行細(xì)胞操作， 也就是換上拖鞋，連工作服都不換就進(jìn)細(xì)胞室， 細(xì)胞一樣沒(méi)有問(wèn)題。 所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情況如何，袖口是否能夠扎緊。如果不能保證，不如索性把袖口挽起來(lái)，把手臂用酒精擦一遍（其實(shí)我本人連擦都懶得擦， 一樣沒(méi)事）。操

13、作時(shí)，滴管兩頭都要燒。還有一點(diǎn)很重要，就是滴管頭在加液體的時(shí)候，不要深入瓶口太多。在倒培養(yǎng)液的時(shí)候， 可以拿起培養(yǎng)瓶直接倒， 但是注意要倒干凈，瓶口沾的最后一滴液體千萬(wàn)不可回流倒瓶?jī)?nèi)。 還有一些基本的問(wèn)題， 比如瓶口要多燒一會(huì)，懷疑滴管有污染就一定要換。 一旦細(xì)胞出現(xiàn)污染的跡象了， 就一定要扔掉。如果實(shí)在想挽救，可以用一些高檔抗生素（醫(yī)院里給病人加藥后的藥瓶，用無(wú)菌鹽水涮涮就能用，濃度足夠），但要小心濃度太高細(xì)胞也會(huì)死亡。對(duì)付霉菌通常用飽和的硫酸銅溶液， 放在培養(yǎng)箱的裝水盤(pán)中， 細(xì)胞房的空調(diào)要用除濕的功能。如果不幸染上，要用 84 液擦培養(yǎng)箱，再用 75%酒精擦。滅菌操作：在無(wú)菌箱內(nèi)每立方米用

14、甲醛810 毫升，高錳酸鉀 5 克，熏蒸 45 分鐘后接種在無(wú)菌箱中每立方米用甲醛 810 毫升、高錳酸鉀 0.25 千克，熏蒸 45 分鐘后接種，栽培種接種量按每瓶二級(jí)種接 3040 袋為宜。（一）常用消毒劑現(xiàn)將常用的消毒藥品及其配制、使用方法，介紹如下：1 35 甲醛水溶液（ HCHO）：又名福爾馬林，使蛋白質(zhì)變性。用于培養(yǎng)室、無(wú)菌室的滅菌。2 0.1 的升汞水（ HgCL3）：能使蛋白質(zhì)變性，抑制酶類(lèi)。0.1 升汞配制方法是稱(chēng)取升汞0.1 克，用少許酒精溶解，再加水至100 毫升即成。用于無(wú)菌箱、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿四周表面以及手指的滅菌。3 石炭酸（ C6H5OH）， 5濃度噴霧后，能使蛋白

15、變性沉淀。石炭酸（苯酚） 50 毫升，加水 950 毫升配成。用于 工作服、實(shí)驗(yàn)桌的滅菌。殺菌效果同升汞。4 高錳酸鉀（ KMnO4）：氧化劑。 0.1 濃度能使蛋白質(zhì)與氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或殺死 雜菌。 5 乙醇（ CH3CH3OH）：又稱(chēng)酒精。消毒以75濃度的效果最好。它能使蛋白質(zhì)脫水變性。高濃度酒精會(huì)使蛋白質(zhì)很快脫水凝固，消毒作用反而減弱。6 新潔爾滅： 0.25 新潔爾滅用于無(wú)菌箱、無(wú)菌室的滅菌。一般新潔爾滅5原液 50 毫升；加水 950 毫升配成。7 漂白粉水：取漂白粉10 克，加水 140 毫升配成。通常在使用前臨時(shí)配制，靜置 12 小時(shí)，取上清液噴射，進(jìn)行

16、室內(nèi)消毒，每平方米用1 升。8 藥皂：煤酚皂、硼酸皂等各種藥皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。9 2硫酸銅溶液：用硫酸銅（膽礬） 2 克，加水至 100 毫升加熱溶解配成。用于床架、木架等各種菌種架的消 毒。還可用 5硫酸銅溶液。10 0.5 波爾多液：先用硫酸銅 1 斤，溶于 100 斤水， 再用石灰 1 斤，加水 100 斤。然后等量混合起來(lái)即成。用于菌種架、段木的消毒。11. 多菌靈：用于殺滅真菌、 半知茵。 1：800 倍拌料或 1 ：500 倍噴灑均可。（二）無(wú)菌箱及無(wú)菌室的消毒滅菌無(wú)菌箱的消毒滅菌，可采取以下幾種方法：l 用甲醛和高錳酸鉀混合熏蒸：一般每平方米需 40甲

17、醛 10 毫升、高錳酸鉀 8 毫升，進(jìn)行熏蒸。使用時(shí)，先密閉門(mén)窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高錳酸鉀，人員隨之離開(kāi)接種室，關(guān)緊房門(mén)，熏蒸2030 分鐘即可。2 0.1 升汞水消毒：用0.1 升汞水浸過(guò)的紗布或海綿進(jìn)行指擦，或用噴霧器噴霧滅菌， 使箱內(nèi)的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞水消毒， 并把袖子卷起來(lái)。噴霧后20 30 分鐘，箱內(nèi)的雜菌和霧滴一起落到箱底被殺死，內(nèi)部的空氣就變得很清潔。3 紫外線(xiàn)照射滅菌：在無(wú)菌箱中裝一支 200 伏、 3O瓦的紫外線(xiàn)燈管；每次開(kāi) 2030 分鐘，就能達(dá)到空間殺菌的 目的。照射結(jié)束后，罩黑布半小時(shí)，以增強(qiáng)殺菌效果。4 石炭酸噴霧：在每次接種之前

18、，用 5石炭酸溶液噴霧，可促使空氣中的微粒和雜菌沉降，防止桌面微塵飛揚(yáng)，并有殺菌作用。5 石灰揩擦：經(jīng)常用藥物熏蒸，易造成酸性環(huán)境，特別用甲醛和高錳酸鉀熏蒸長(zhǎng)久，污染往往越來(lái)越嚴(yán)重， 預(yù)防辦法可把各種藥品交替使用， 過(guò)一段時(shí)間（約五周）用石灰擦洗一遍。實(shí)踐證明，這樣做效果很好。無(wú)菌室消毒同無(wú)菌箱。（三）無(wú)菌室的使用規(guī)程無(wú)菌室無(wú)固定程序，但按一般操作應(yīng)遵循如下規(guī)程：1 接種室內(nèi)和緩沖室內(nèi)使用前，用 5石炭酸溶液噴霧。把所需要的器材搬入緩沖室清洗，等曬干后搬入接種 室，打開(kāi)紫外線(xiàn)燈，照射殺菌。2 穿上工作服及無(wú)菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手 2 分鐘。進(jìn)人接種室后，查驗(yàn)器械是否放在一定位置。 然后

19、用 5 石炭酸溶液重點(diǎn)在工作臺(tái)的上方和附近的地面上噴霧。 然后退回緩沖室。 還可給接種室門(mén)口地面灑一層石灰， 進(jìn)門(mén)時(shí)踩石灰可使鞋底保持無(wú)雜菌狀態(tài)。3 接種操作前，用 70的酒精棉球擦手。進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，要嚴(yán)格認(rèn)真，動(dòng)作輕捷，盡量減少空氣流動(dòng)。4 工作結(jié)束后，立即將臺(tái)面收拾干凈，不留殘物。然后用 5石炭酸全面噴灑。5 操作時(shí)，注意安全。如棉塞著火，用手緊握即可熄滅。如打破菌瓶，可用抹布沾 5石炭酸，收拾到廢物桶 內(nèi)。每次的污染物應(yīng)小心放在盤(pán)內(nèi)，蓋嚴(yán)拿出室外深埋或燒掉。（四）無(wú)菌室空氣污染情況的檢驗(yàn)定期檢驗(yàn)無(wú)菌室空氣污染情況，對(duì)改進(jìn)滅菌措施，提高成品率是非常必要的。常用方法步驟如下：1 平板檢驗(yàn)法

20、：用常規(guī)培養(yǎng)基，倒成平板，收入接種室。在事先熏蒸好的接種室，使用前半小時(shí)或 1 小時(shí)把供試的培養(yǎng)皿或試管打開(kāi)， 按預(yù)定時(shí)間蓋好培養(yǎng)皿或試管。留對(duì)照皿不打開(kāi)。然后一起放入 30的溫箱中培養(yǎng) 48 小時(shí)，檢查有無(wú)菌殖生長(zhǎng)，并由菌落形態(tài)，判斷雜菌種類(lèi)。一般要求平板培養(yǎng)基開(kāi)蓋 5 分鐘，菌落不超過(guò) 3 個(gè)；敘面培養(yǎng)基開(kāi)塞 30 分鐘者，以不出現(xiàn)菌落為合格。2 斜面檢驗(yàn)法：將常用的瓊脂斜面培養(yǎng)基各取二管， 放入接種室，按無(wú)菌操作各將其中的一管的棉塞取出， 放在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)。 經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后， 再將棉塞通過(guò)火焰，塞回試管，連同對(duì)照一起培養(yǎng)。經(jīng) 48 小時(shí)后，檢驗(yàn)無(wú)雜菌生長(zhǎng)。和上邊方法同。3 空氣污染情況

21、檢驗(yàn)：在接種過(guò)程中，人員的出過(guò)、器材的搬放、接種操作的動(dòng)作等原因造成空氣污染， 檢驗(yàn)方法是在準(zhǔn)備工作結(jié)束后， 接種操作開(kāi)始時(shí)，按上述方法打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子或試管塞，經(jīng) 5 分鐘、 30 分鐘或直到工作結(jié)束時(shí)再蓋好，以檢驗(yàn)在不同的使用時(shí)間內(nèi)，空氣污染的程度。如霉菌較多時(shí)；可先用 5石炭酸全面噴射后，再用甲醛熏蒸。如細(xì)菌較多時(shí)，可采取用乳酸和甲醛交替熏蒸的辦法加以殺滅。黑膠蟲(chóng)1 、 黑膠蟲(chóng)概況：在細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候，有時(shí)會(huì)在 400 倍顯微鏡下看到小黑點(diǎn)在動(dòng)，小黑點(diǎn)有時(shí)呈點(diǎn)狀，有時(shí)呈小的片狀，運(yùn)動(dòng)形式為在原地振動(dòng)（類(lèi)似布朗運(yùn)動(dòng)），這種小黑點(diǎn)既不是細(xì)菌、霉菌，也不是支原體（我們?cè)?jīng)請(qǐng)周守長(zhǎng)用血平板培養(yǎng)過(guò)，沒(méi)

22、有菌落出現(xiàn)），目前業(yè)內(nèi)人士稱(chēng)其為“黑膠蟲(chóng) ”。黑膠蟲(chóng)到底是否為生物？這個(gè)一直是業(yè)內(nèi)人士的疑惑。 黑膠蟲(chóng)一般是存在血清里的， 而血清通常是經(jīng)過(guò) 0.1 m濾膜過(guò)濾的 ,所以血清里不可能存在細(xì)菌、霉菌及支原體等微生物。如果說(shuō)黑膠蟲(chóng)不是生物，它會(huì)不斷增多， 達(dá)到一定數(shù)量時(shí)會(huì)與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)，從而使得細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。不管對(duì)于黑膠蟲(chóng)的爭(zhēng)論如何,但有幾個(gè)是目前大家公認(rèn)的： 與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有不利影響。 “黑膠蟲(chóng) ”會(huì)增殖，增殖多時(shí)，視野下一大片都為“黑膠蟲(chóng) ”。 “黑膠蟲(chóng) ”與血清有關(guān)，與血清質(zhì)量有很大關(guān)系。2 、目前對(duì) “黑膠蟲(chóng) ”的定論：有2 種解釋?zhuān)旱谝?，?/p>

23、膠蟲(chóng)為生物。它是小于細(xì)菌的生物，直徑小于0.1 m，大多國(guó)外血清中多見(jiàn)，可能是國(guó)外牛血清中含有的某種原蟲(chóng)。只要它是生物， 那么在培養(yǎng)基中一定會(huì)對(duì)細(xì)胞有影響。第二，黑膠蟲(chóng)不是生物。國(guó)內(nèi)的血清中，通常滅活之后都會(huì)有絮狀沉淀出現(xiàn)，而黑膠蟲(chóng)出現(xiàn)時(shí)，所使用的血清被反復(fù)凍融過(guò)多次。所以推測(cè)，所謂的“黑膠蟲(chóng) ”其實(shí)就是血清中的某些蛋白成分的物質(zhì)， 經(jīng)過(guò)滅活之后喪失活性， 在培養(yǎng)基中， 鏡檢見(jiàn)到的運(yùn)動(dòng)其實(shí)是這些物質(zhì)在溶液中做 “布朗運(yùn)動(dòng) ”。隨著細(xì)胞消耗培養(yǎng)基，這些物質(zhì)越來(lái)越多，最后細(xì)胞所用的營(yíng)養(yǎng)消耗完，細(xì)胞容易死亡。3 、對(duì)于 “黑膠蟲(chóng) ”的處理方法：首先， 血清買(mǎi)回來(lái)滅活前凍融應(yīng)逐級(jí)凍融，即按照 -20

24、4 完全融化后， 再置入水浴中，與室溫一起升高到56 度，這樣的目的是避免溫度驟變，導(dǎo)致血清中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失活性。第二，血清滅活后分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數(shù)。分裝時(shí)注意無(wú)菌。第三，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)血清濃度稍大一些。通常細(xì)胞培養(yǎng)血清濃度為10%-15% ，但如果血清凍融次數(shù)過(guò)多，那營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失活性，按15% 的濃度配制事實(shí)上達(dá)不到15% 的營(yíng)養(yǎng)成分，故培養(yǎng)基配置時(shí)一般用18%-20% 的血清。這種黑膠蟲(chóng)，在國(guó)外稱(chēng)其為- 納米細(xì)菌，現(xiàn)將我看到的一些資料轉(zhuǎn)述如下，希望對(duì)大家有所幫助：1.納米細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)徑芬蘭的一個(gè)科學(xué)家Ciftcioglu et al在其細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中, 發(fā)現(xiàn)

25、在胎牛血清中存在一種直50-500 nm的微粒 ; 這種顆粒物對(duì)伽瑪射線(xiàn)具有很強(qiáng)的耐受性; 針對(duì)包括支原體在內(nèi)的所有已知微生物的特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均為陰性基中無(wú)法生長(zhǎng) , 通常的細(xì)菌染色方法難以著色;這種顆粒物在血瓊脂培養(yǎng)基以及支原體培養(yǎng). 因此 , Kajander判定這是一種新的微生物,根據(jù)其體型微小并且棲息在血液中的特點(diǎn), 將其命名為Nanobacterium sanguineum,簡(jiǎn)稱(chēng)Nanobacteria,中文譯名納米細(xì)菌, 并將菌種保存于德國(guó)微生物存儲(chǔ)中心(DSM No:5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braun

26、schweig, Germany).2 納米細(xì)菌的生物學(xué)特性2.1 納米細(xì)菌 哺乳動(dòng)物體內(nèi)最小的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所使用的血清通常采用過(guò)濾法達(dá)到無(wú)菌的目的 , 通常采用直徑 0.1 m的濾膜過(guò)濾除菌 . Kajander研究發(fā)現(xiàn) , 0.1 m的濾膜過(guò)濾并不能有效地清除血清中的納米細(xì)菌, 但是血清經(jīng)過(guò)0.05 m的濾膜過(guò)濾則能有效清除納米細(xì)菌污染. 細(xì)胞培養(yǎng)條件下的納米細(xì)菌經(jīng)過(guò)0.2 m的濾膜過(guò)濾后約有3%的納米細(xì)菌可以通過(guò)濾膜, 而在加壓過(guò)濾的情況下, 約有 50% 的納米細(xì)菌可以通過(guò) 0.2m的濾膜 . 剛剛經(jīng)過(guò)過(guò)濾的納米細(xì)菌在相差顯微鏡下無(wú)法發(fā)現(xiàn), 但在不含血清添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng) 24

27、 h 后 ,即可以用相差顯微鏡觀測(cè)到. 電子顯微鏡觀察顯示 , 納米細(xì)菌的平均直徑為 200 nm, 而子代納米細(xì)菌的最小直徑僅50 nm. 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為 , 只有當(dāng)細(xì)胞直徑在不低于 140 nm 時(shí) , 才能維持其最基本的新陳代謝. Kajander 認(rèn)為 , 納米細(xì)菌可能是地球形成早期、 在原始大氣條件下的一種最原始的生命形式,因此不能用衡量已經(jīng)經(jīng)過(guò)幾十億年進(jìn)化的生命形式的觀點(diǎn)去衡量這種古老的生命形式, 并且推測(cè) , 納米細(xì)菌遭受不良因素的侵害后可以形成許多的體形微小的碎片,并將其釋放到環(huán)境中 ,每一個(gè)碎片都可能攜帶部分遺傳信息 , 在特定條件下 , 這些 "基本 "

28、顆粒聚集在一起形成群落, 當(dāng)足夠數(shù)量的 "基本 "顆粒提供完整的遺傳信息時(shí), 則可以形成新的納米細(xì)菌 .2.2 納米細(xì)菌緩慢的增殖周期微生物學(xué)家通常是通過(guò)對(duì)某種微生物進(jìn)行培養(yǎng), 進(jìn)而了解該種微生物的特性 .然而 ,并非每種微生物都是可以在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)的,主要原因在于這些微生物的培養(yǎng)條件我們并不清楚 , 其生存環(huán)境以及是否與其他微生物存在共生關(guān)系我們并不十分了解. 納米細(xì)菌就是一種對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求非?？量痰奈⑸?其新陳代謝率極為緩慢,僅為普通細(xì)菌的 1/10 000.研究發(fā)現(xiàn) , 納米細(xì)菌主要利用環(huán)境中的氨基酸而不是葡萄糖來(lái)提供能量, 谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其

29、利用. 在37有 50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L 的空氣存在的潮濕環(huán)境下 , 并且在含有 100 mL/L胎牛血清和適量谷氨酰胺的pH 值 7.4的細(xì)胞培養(yǎng)基中 , 納米細(xì)菌能夠緩慢生長(zhǎng) , 平均倍增時(shí)間為3 d, 而在無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 其增殖速度變慢 , 細(xì)菌倍增時(shí)間可延長(zhǎng)至5-6 d, 在添加適量促納米細(xì)菌生長(zhǎng)因子BGF( 一種桿菌培養(yǎng)上清的超濾液 )或 N3( 納米細(xì)菌培養(yǎng)上清的超濾液)的條件下 , 其增殖速度加快 ,倍增時(shí)間可縮短至 0.6-1 d. 在有促納米細(xì)菌生長(zhǎng)因子BGF存在的條件下 , 納米細(xì)菌甚至可以在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng) , 并形成直徑 l m

30、m 大小的細(xì)菌集落 .2.3 納米細(xì)菌獨(dú)特的生物礦化現(xiàn)象當(dāng)在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細(xì)菌被轉(zhuǎn)移至不含血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)(DMEM 或 RPMI-1640),在 1 a 之內(nèi)就可以觀察到納米細(xì)菌出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象, 在 1 wk 之內(nèi) , 就可以在納米細(xì)菌的周?chē)纬蓭孜⒚缀竦纳锉荒?biofilm), 并且緊緊貼附于培養(yǎng)瓶底部,而納米細(xì)菌棲息其中(這與在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細(xì)菌的形態(tài)明顯不同),此時(shí)其大小接近于一個(gè)酵母細(xì)胞, 2-3 wk 以后 ,由于生物被膜的增厚 , 其直徑已近似于一個(gè)紅細(xì)胞的大小. 用 EDX 法對(duì)這種生物被膜的化學(xué)組成進(jìn)行分析,顯示其鈣磷的峰值與羥基磷灰石極其相似

31、 , 電子顯微鏡觀察以及傅立葉轉(zhuǎn)換紅外頻譜(fourier transform IR spectroscopy, FTIR)分析顯示其主要成分為碳酸羥基磷灰石(carbonate hydroxyapatite),而且 ,不論在有無(wú)血清作為添加劑的情況下, 都可以見(jiàn)到這種被羥基磷灰石包繞的納米細(xì)菌, 這種情況甚至可以在處于分裂期的納米細(xì)菌中見(jiàn)到. 納米細(xì)菌并不產(chǎn)生尿激酶和堿性磷酸酶, 并且即便經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的培養(yǎng) , 其培養(yǎng)基的 pH 值也不會(huì)出現(xiàn)明顯的變化 , 一直穩(wěn)定在7.4 左右 , 這表明在納米細(xì)菌細(xì)胞膜表面所生成的羥基磷灰石結(jié)晶是源自于生物大分子的,即生物礦化現(xiàn)象 ,而并非是由于 pH

32、值改變所導(dǎo)致的簡(jiǎn)單的物理結(jié)晶現(xiàn)象.納米細(xì)菌利用培養(yǎng)體系中的鈣、磷合成羥基磷灰石作為其生物被膜的主要成分, 這種生物礦化過(guò)程受到生長(zhǎng)環(huán)境中某些因素的調(diào)控 , 從而使其呈現(xiàn)不同的外觀,如羥基磷灰石形、細(xì)菌被膜形、沙粒形、結(jié)石形和類(lèi)似腫瘤的外形 . （這也許就是國(guó)內(nèi)的一些研究者們認(rèn)為其是一些磷酸鹽類(lèi)的無(wú)機(jī)物的部分原因吧?。Ｔ诤行迈r血清的培養(yǎng)基中納米細(xì)菌的生物礦化現(xiàn)象程度較輕微, 這是由于血清中含有強(qiáng)效羥基磷灰石合成抑制因子, 骨鈣素 (osteocalcin) 和胎球蛋白 (fetuin),由于這些抑制蛋白的存在 , 所以在有血清存在的情況下, 納米細(xì)菌的生物礦化作用受到明顯抑制.當(dāng)血清濃度降低

33、時(shí) , 納米細(xì)菌的生物礦化現(xiàn)象增強(qiáng), 在不含血清的培養(yǎng)體系中, 生物礦化現(xiàn)象劇烈而迅速 . 盡管改良的 Loeffler固體培養(yǎng)基中含有750 mL/L 血清成分 ,但血清蛋白成分在滅菌過(guò)程中受到破壞, 所以在此培養(yǎng)基中的納米細(xì)菌的礦化作用并不受抑制,在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的納米細(xì)菌其菌落直徑可達(dá)1-5 mm.另外 , 當(dāng)有乙二胺四乙酸 (EDTA)存在時(shí) ,納米細(xì)菌的生物現(xiàn)象會(huì)受到明顯的抑制.由于礦化生物被膜的保護(hù)作用以及極其緩慢的新陳代謝率, 使納米細(xì)菌能夠耐受各種不利的物理?xiàng)l件和化學(xué)損傷因素以及多種抗生素的打擊.2.4 納米細(xì)菌的檢測(cè)方法由于納米細(xì)菌在標(biāo)準(zhǔn)微生物培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng), 并且即便是在

34、最適宜其生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中,納米細(xì)菌的生長(zhǎng)也極為緩慢, 其新陳代謝率僅為普通細(xì)菌的萬(wàn)分之一 , 這使得許多基于檢測(cè)細(xì)菌新陳代謝的微生物學(xué)方法無(wú)法檢測(cè)納米細(xì)菌的存在. 由于納米細(xì)菌難以用傳統(tǒng)的火焰法和乙醇法固定, 并且大多數(shù)染料無(wú)法穿透其細(xì)胞壁,而且不能用普通顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察, 因此常規(guī)的細(xì)菌學(xué)染色法并不能檢測(cè)到納米細(xì)菌的存在 . 通過(guò) Kajander et al的研究 , 發(fā)現(xiàn) 70干烤 10 min,可以將其有效固定; 另外,用茜素紅 S、剛果紅以及硝酸銀染料可以使納米細(xì)菌著色; 而培養(yǎng)狀態(tài)下的納米細(xì)菌可以在放大400 倍的相差顯微鏡下清晰地觀察其生長(zhǎng)情況; 用 DNA 熒光染料 (Dapi 或 Hoechst)按普通細(xì)菌 DNA 染色的條件對(duì)納米細(xì)菌DNA 進(jìn)行染色均不成功, 而當(dāng)按照線(xiàn)粒體DNA 以及病毒 DNA 染色條件 , 對(duì)納米細(xì)菌 DNA 進(jìn)行染色時(shí) , 熒光顯微鏡下可以觀察到特征性的熒光;用納米細(xì)菌特異性抗體進(jìn)行熒光染色也可以清晰地顯示納米細(xì)菌的存在; 利用電子顯微鏡對(duì)經(jīng)過(guò)負(fù)染的納米細(xì)菌進(jìn)行觀察,可以清晰的顯示80-350 nm 大小、單獨(dú)或聚集成簇的納米細(xì)菌以及其表面的生物被膜(biofilm) 結(jié)構(gòu) ; 而用透射電鏡對(duì)納米