生物制藥工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、生物制藥工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（12個(gè)實(shí)驗(yàn)，36學(xué)時(shí)） 焦飛生物技術(shù)教研室實(shí)驗(yàn)一健胃消食片配方及片劑的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握壓片機(jī)壓片的方法及影響片劑成型的主要因素；2. 學(xué)會(huì)片劑處方的調(diào)配。二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器太子參，陳皮，山藥，麥芽（炒），山楂，蔗糖粉，糊精，硬脂酸鎂，粉碎機(jī)，干燥箱，制片機(jī)三、實(shí)驗(yàn)原理健胃消食片為內(nèi)科傷食類非處方藥品，主治健胃消食，用于脾胃虛弱，消化不良，脾胃虛弱所致的食積，癥見(jiàn)不思飲食，暖腐酸臭，脘腹脹痛。健胃消食片的配方如下，太子參228.6g，陳皮22.9g，山藥171.4g，麥芽（炒）171.4g，山楂114.3g，蔗糖糊精適量，值得片劑為淡棕黃色的片或薄薄膜片，氣略香

2、，味微甜，酸。制作方法：太子參半量與山藥粉碎成細(xì)粉，其余陳皮三味藥及剩余的太子參置于燒杯，加3倍量水，煎煮1小時(shí)，濾過(guò)，合并兩次煎液，減壓濃縮至浸膏，干燥。將蔗糖粉糊精和生藥粉以3：1：1的混合粉與浸膏混合制成軟材，軟材的軟硬應(yīng)適當(dāng)，以“手握成團(tuán)，輕壓則散”為宜。采用擠出制粒的方法制成顆粒，顆粒在60-80攝氏度干燥，干燥時(shí)應(yīng)逐漸升溫，以免因顆粒表面干燥過(guò)快結(jié)成硬殼而影響內(nèi)部水分的蒸發(fā)。顆粒整粒后加入1硬脂酸鎂混合后壓片。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 稱取太子參22.8g，陳皮2.3g，山藥17.1g，山藥17.1g，麥芽17.1g，山楂11.4g2. 太子參山藥用粉碎機(jī)粉成細(xì)粉。3. 將上述藥材放入燒杯

3、中，加入3倍量的水，煎煮半小時(shí)，重復(fù)兩次，將上清液合并，減壓濃縮至浸膏，將所得浸膏放入烘箱中80度干燥。4. 將蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3：1：1的比例混合制成顆粒軟材，將軟材放入烘箱中逐漸升溫干燥。5. 干燥后的軟材加入1硬脂酸鎂放入壓片機(jī)中壓片。實(shí)驗(yàn)二溶菌酶結(jié)晶的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握鹽析法提取蛋白質(zhì)的原理和過(guò)程；2. 學(xué)會(huì)溶菌酶的結(jié)晶和精制方法。二、實(shí)驗(yàn)材料與儀器新鮮雞蛋，氯化鈉，1 mol/L 氫氧化鈉溶液，醋酸緩沖液，燒杯，玻璃棒，布氏漏斗，干燥箱。三、實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶又稱細(xì)胞壁質(zhì)酶或N乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種國(guó)內(nèi)外很緊銷的生化物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床。具有多種藥理作用，能抗

4、感染、消炎、消腫、增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)等，有抗菌的作用，常用于五官科多種粘膜炎癥，皮膚帶狀瘡疹等疾病。是優(yōu)良的天然防腐劑，可用于食品的防腐保鮮。尤其重要的是近年來(lái)溶菌酶已成為基因工程及細(xì)胞工程必不可少的工具酶。四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）收集雞蛋清將新鮮雞蛋兩端各敲一個(gè)小洞，使蛋清流出（最好是新生的雞蛋、PH值不得低于8，否則不能使用），按其體積的兩倍量加入水，輕輕攪拌5min，使蛋清溶液的稠度均勻，注意在攪拌過(guò)程中不能起泡，攪拌不宜過(guò)快、攪拌棒應(yīng)光滑等，以防蛋白質(zhì)變性而影響溶菌酶產(chǎn)品的得率及質(zhì)量，最后用雙層細(xì)紗布濾除蛋清溶液中的臍帶塊及碎蛋殼等。（2）加入氯化鈉 按每100ml蛋清溶液加入2g.氯化鈉的比

5、例，白蛋清溶液中慢慢加入氯化鈉細(xì)粉，邊加邊攪拌，促使氯化鈉細(xì)粉及時(shí)溶解，以避免局部濃度過(guò)高或沉淀于容器底部，否則會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性而產(chǎn)生大量的白色沉淀。（3） 粗制溶菌酶 加完氯化鈉細(xì)粉后， 再用1mol/L 的氫氧化鈉溶液小心地將上述蛋清溶液的PH值調(diào)節(jié)到10.8。在用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋清溶液PH值時(shí)，用膠頭滴管將其逐漸滴入并不斷攪拌以免局部過(guò)堿而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，從而影響溶菌酶的得率和質(zhì)量。為加速溶菌酶的結(jié)晶過(guò)程，可再加入適量的溶菌酶結(jié)晶體作為晶種。低溫下靜置數(shù)天，溶菌酶結(jié)晶將慢慢析出，于7296h 達(dá)到最高產(chǎn)率。待結(jié)晶完全后，傾去上清液并用布氏漏斗濾出結(jié)晶，即可得到粗制的溶菌酶晶體。（4

6、）精制溶菌酶 將制得的粗結(jié)晶用PH值4.6的醋酸溶解，然后讓酶液靜置2h，接著過(guò)濾除去不溶物，收集濾液并量出體積，按100ml濾液加5g氯化鈉的比例加入（加入方法與第二步加入氯化鈉的方法相同）。然后用1mol/L的氫氧化鈉溶液緩慢地將其PH值調(diào)節(jié)到10.8 后，低溫下靜置結(jié)晶。為加速結(jié)晶過(guò)程可向酶液中加入溶菌酶晶種，待結(jié)晶完全后再傾去上清液，用布氏漏斗過(guò)濾可得溶菌酶結(jié)晶，如純度不夠，可重復(fù)操作提純，直至達(dá)到所需要的純度為止，結(jié)晶于3040°:烘干后即得溶菌酶產(chǎn)品。（5）包裝存貯 產(chǎn)品應(yīng)裝于玻璃或陶瓷容器中，置于陰冷處保存，以免溶菌酶受熱后失去活性。注意事項(xiàng)（1）整個(gè)過(guò)程只能在玻璃或陶

7、瓷容器中進(jìn)行，不可用金屬容器，以免酶失活而影響產(chǎn)品的得率及質(zhì)量。（2）操作的全過(guò)程要在低溫下進(jìn)行（10°以下），防止原料變質(zhì)和酶失活。（3）第三步中加入溶菌酶晶種的具體操作是將溶菌酶晶體均勻地懸浮于少量的PH值為10.8，濃度為5%氯化鈉溶液中，取幾滴加入到調(diào)好的PH值和氯化鈉濃度的蛋清液內(nèi)，再置低溫處結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)三 纖維素酶活力的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解纖維素酶的種類和測(cè)定原理，以及纖維素酶的作用特性；2. 掌握3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定纖維素酶活力的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理纖維素酶是一種多組分酶，包括4種組分：內(nèi)切-1,4-葡聚糖酶、外切-1,4-葡聚糖酶、纖維二糖水解

8、酶和纖維二糖酶（又稱-葡聚糖苷酶）。在各種酶組分的協(xié)同作用下，能降解纖維素，使之變成纖維寡糖、纖維二糖和葡萄糖等還原糖。這些還原糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（DNS）還原，生成紅棕色的氨基化合物，在540 nm波長(zhǎng)處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系。利用比色法測(cè)定其還原糖的量就可測(cè)定纖維素酶的活力。 由不同底物測(cè)得的酶活力分別稱為FPA（濾紙?zhí)敲富盍Γ┖虲MCA（羧甲基纖維素酶活力）。為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前通常用濾紙作為纖維素酶作用的底物。纖維素酶在一定溫度和pH條件下，將纖維素底物(濾紙)水解，釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下，3,5-二硝基水楊酸(DN

9、S試劑)與還原糖發(fā)生顯色反應(yīng)，其顏色的深淺與還原糖(以葡萄糖計(jì))含量成正比。通過(guò)在540nm測(cè)其吸光度，可得到產(chǎn)生還原糖的量，計(jì)算出纖維素酶的濾紙酶活力。濾紙酶活力Filterp apera ctivity (FPA)指lg 固體酶(或1mL液體酶)，在(50士0.1),指定pH條件下(酸性纖維素酶pH4.8，中性纖維素酶pH 6.0), lh水解濾紙底物，產(chǎn)生出相當(dāng)于l mg葡萄糖的還原糖量，為1個(gè)酶活力單位，以u(píng)/g(或u/mL)表示。三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑水浴鍋、分光光度計(jì)、計(jì)時(shí)器、比色皿、移液管、吸耳球DNS試劑、檸檬酸緩沖液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、快速定性濾紙四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

10、的繪制：取7支具塞刻度試管，編號(hào)，按照表一規(guī)定的量，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、緩沖溶液和DNS試劑于各管中，混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)10 min，取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25 ml，蓋塞，混勻。在540 nm處測(cè)量吸光度，以葡萄糖量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。表一 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液緩沖液吸取量（ml）DNS試劑吸取量（ml）濃度（mg/ml）吸取量(ml)00.00.0023.011.00.501.53.021.50.501.53.032.00.501.53.042.50.501.53.053.00.501.53.063.50.

11、501.53.02. 待測(cè)酶液的制備（1）稱取酶樣1.0 g，用檸檬酸緩沖液溶解至100 ml（100倍），之后分別做200倍、400倍和800倍稀釋,混勻。準(zhǔn)確定容放置10 min，待測(cè)。（2）濾紙條的準(zhǔn)備濾紙條事先干燥，水分平衡后，將濾紙折成寬1 cm，質(zhì)量為5±0.5 mg的濾紙條，折成M型備用。（3）酶活力的測(cè)定取四支具塞試管，將折成M型的濾紙條分別放入每支試管底部，其中一支試管空白，分別向四支試管中加入緩沖液1.5 ml，待測(cè)酶液0.5 ml（空白管不加），使管內(nèi)溶液浸沒(méi)濾紙，蓋塞。將四支試管同時(shí)置于50 水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)60 min，取出，立即向各管中加入DNS試劑3.0

12、 ml。再于空白管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.5 ml，搖勻。將四支管同時(shí)放入沸水浴中，加熱10 min，取出，迅速冷卻至室溫，加水定容至25 ml，搖勻。以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在540 nm下，測(cè)量三支平行管中樣液的吸光度，取平均值。以平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用回歸方程求出還原糖含量。（4）酶活力的計(jì)算纖維酶活力按以下公式計(jì)算：X=A×1/0.5×n式中，X-樣品的濾紙酶活力，u/g；A-根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的還原糖量，mg；n-酶樣的稀釋倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)四金銀花、黃芩、川芎和連翹浸膏的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握提取方法及操作要點(diǎn)。2熟悉提取率的測(cè)定方法。3. 了解總浸膏

13、量中總黃酮量和總有機(jī)酸量的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理浸膏劑指用適宜溶劑與方法提取中藥中有效成分，蒸去全部溶劑，調(diào)整濃度至規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)所制成的膏狀或粉狀的固體制劑。除另有規(guī)定外，浸膏劑毎1g相當(dāng)于原有藥材的25g。浸膏劑一般用煎煮法或滲漉法制備。煎煮法指將藥材加水煎煮取汁的方法，一般過(guò)程為取規(guī)定藥材，切碎或粉碎成粗粉，置適宜煎器中，加水浸沒(méi)藥材，浸泡適宜時(shí)間后，加熱至煮沸，保持微沸一定時(shí)間，分離煎出液，藥渣依法煎出數(shù)次（一般為23次），至煎液味淡為止，合并各次煎出液，濃縮至規(guī)定濃度。煎煮法適用于有效成分能溶于水，且對(duì)濕、熱均穩(wěn)定的藥材。滲漉法是將適度粉碎的藥材置滲漉筒中，由上部不斷添加溶劑，溶劑滲過(guò)藥材

14、層向下流動(dòng)過(guò)程中浸出藥材成分的方法。適用于貴重藥材、毒性藥材及高濃度制劑。三、實(shí)驗(yàn)材料與器材金銀花、黃芩、川芎、連翹、酚酞試劑、NaOH滴定液、0.6%Mg(Ac)2甲醇溶液索氏提取儀、回流冷凝管、加熱套、水浴鍋四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 金銀花提取取最粗粉金銀花、黃芩、川芎、連翹各20 g，加入200 ml蒸餾水，按煎煮法，煎煮3次，每次30 min，取上清液或過(guò)濾取濾液。2. 浸膏制備：將濾液濃縮至稀糖漿狀，靜置2 周，過(guò)濾，即得浸膏。3. 質(zhì)量檢查（1）觀察浸膏的外觀性狀，本品在水浴上蒸干后，在105干燥3小時(shí)，至恒定，測(cè)定測(cè)定總浸膏量。（2）含量測(cè)定 總有機(jī)酸的測(cè)定：在供試品溶液中加入酚酞試劑2

15、滴，用標(biāo)定好的0.0749 mol/L的NaOH滴定液滴定至溶液顯粉色。毎1 ml NaOH滴定液相當(dāng)于9.916 mg的水楊酸，總有機(jī)酸量以水楊酸計(jì)?？傸S酮的測(cè)定：按中藥化學(xué)中蘆丁測(cè)定方法，0.6%Mg(Ac)2甲醇溶液為參比，于510nm處測(cè)定各溶液吸光值。實(shí)驗(yàn)五金銀花、黃芩、川芎和連翹浸膏的純化及丸劑的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握泛制法、塑制法制備丸劑的方法與操作要點(diǎn)。 2.熟悉水丸、蜜丸、滴丸對(duì)藥料和輔料的處理原則及各類丸劑的質(zhì)量要求。二、實(shí)驗(yàn)原理丸劑是根據(jù)中醫(yī)辨證論治的原則組方。碾研成細(xì)末，混合均勻后，根據(jù)處方用蜜、水、黃酒、醋、面糊、米糊、蜂蠟、藥汁、流浸膏、糖漿等為粘合劑，制成圓球形

16、的內(nèi)服固體劑型，如蜜丸、水丸、糊丸、蠟丸、濃縮丸等，以治療疾病的一種療法。丸劑的制法有泛制法、塑制法和滴制法。泛制法適用于水丸、水蜜丸、糊丸、濃縮丸的制備，其工藝流程為：原、輔料的準(zhǔn)備起模成型蓋面干燥選丸質(zhì)量檢查包裝。塑制法適用于蜜丸、濃縮丸、糊丸、蠟丸等的制備，其工藝流程為：原、輔料的準(zhǔn)備 制丸塊制丸條分粒、搓圓干燥質(zhì)量檢查包裝。供制丸用的藥粉應(yīng)為細(xì)粉或極細(xì)粉；起模、蓋面、包衣的藥粉，應(yīng)根據(jù)處方藥物的性質(zhì)選用。丸劑的賦形劑種類較多，選用恰當(dāng)?shù)臐?rùn)濕劑、黏合劑，使之既有利于成型，又有助于控制溶散時(shí)限，提高藥效。水丸制備時(shí)，根據(jù)藥料性質(zhì)、氣味等可將藥粉分層泛入丸內(nèi)，掩蓋不良?xì)馕?，防止芳香成分的揮發(fā)

17、損失，也可將速效部分泛于外層，緩釋部分泛于內(nèi)層，達(dá)到長(zhǎng)效的目的。一般選用黏性適中的藥物細(xì)粉起模，并應(yīng)注意掌握好起模用粉量。如用水為潤(rùn)濕劑，必須用8小時(shí)以內(nèi)的涼開(kāi)水或蒸餾水。水蜜丸成型時(shí)先用低濃度的蜜水，然后逐漸用稍高濃度的蜜水，成型后再用低濃度的蜜水撞光。蓋面時(shí)要特別注意分布均勻。泛制丸因含水分多，濕丸粒應(yīng)及時(shí)干燥，干燥溫度一般為80左右。含揮發(fā)性、熱敏性成分，或淀粉較多的丸劑，應(yīng)在60以下干燥，。丸劑在制備過(guò)程中極易染菌，應(yīng)采取恰當(dāng)?shù)姆椒右钥刂啤?5.滴丸的冷卻劑必須對(duì)基質(zhì)和主藥均不溶解，其比重輕于基質(zhì)，但兩者應(yīng)相差極微，使滴丸滴入后逐漸下沉，給予充分的時(shí)間冷卻。否則，如冷卻劑比重較大，滴

18、丸浮于液面；反之則急劇下沉，來(lái)不及全部冷卻，滴丸會(huì)變形或合并。三、實(shí)驗(yàn)材料與儀器金銀花、黃芩、川芎、連翹、蜂蜜、純化水培養(yǎng)皿、小型制丸機(jī)四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.水丸的制備：金銀花、黃芩、川芎、連翹以上4味，各取5g，混合粉碎成細(xì)粉，混勻。起模：即起母子?？刹捎盟庁沂止しɑ虬洛仚C(jī)械法。手工法是以小掃帚蘸少許開(kāi)水，或其他粘合劑均勻地刷在藥匾上，然后撒上少量藥粉，轉(zhuǎn)動(dòng)藥匾，使藥粉全部濕潤(rùn)，再用干燥棕刷輕輕將藥粉刷離，經(jīng)過(guò)再刷水，加藥粉，旋轉(zhuǎn)藥匾，如此反復(fù)多次，使顆粒逐漸呈圓形而增大，過(guò)藥篩選取均勻的顆粒作為母子。機(jī)械法則以包衣鍋代替藥匾起模，其操作方法與手工法基本相同。逐漸加大制成符合要求的丸劑。手工法泛

19、丸是母子的基礎(chǔ)上泛丸：將篩選的母子。繼續(xù)用藥匾，經(jīng)過(guò)噴水，撒藥粉，利用旋轉(zhuǎn)、推拉、揉滾、翻擺等操作，反復(fù)進(jìn)行，使藥丸加大到一定水平，過(guò)篩，即可制成均勻光滑一致的水泛丸。機(jī)器泛丸基本操作與手工法相同。干燥：水丸制成后應(yīng)將其攤布容器中，于陰涼通風(fēng)處及時(shí)干燥，并應(yīng)隨時(shí)加以翻動(dòng)。或用低溫烘干。2.蜜丸:將藥材細(xì)粉用蜂蜜為粘合劑制成的丸劑。分為大蜜丸及小蜜丸兩種。蜜丸操作主要為煉蜜、丸塊及丸條制備、丸劑分割與搓圓、干燥、包衣等幾個(gè)步驟。煉蜜：將蜂蜜置于鍋中加熱熬煉。撈出漂浮物及浮沫以去除其中的雜質(zhì)，并可殺死微生物，破壞酵素，適當(dāng)減少水分含量，增加粘合力，以適合制丸要求。煉蜜依據(jù)熬煉時(shí)間長(zhǎng)短；分為嫩蜜、中

20、蜜(亦稱煉蜜)老蜜3種二煉蜜水平按藥物性質(zhì)和季節(jié)而定，嫩蜜、煉蜜適用于粘性較強(qiáng)的藥材，老蜜則適用于粘性差的礦物或纖維性較多的藥材；冬季多用嫩蜜，夏季多用老蜜。加入煉好的蜂蜜丸塊及丸條制備：少量制備時(shí)將藥物細(xì)粉置于清潔的容器內(nèi)?；旌暇鶆?，制成軟硬適宜的可塑性丸塊，然后搓制成粗細(xì)一致的丸條。大量生產(chǎn)時(shí)，則用機(jī)械完成丸塊及丸條制備。可以手工制丸或機(jī)械制丸。手工制丸按預(yù)定規(guī)格將丸條掐成均勻顆粒 丸劑分割與搓圓：丸條制成后。搓圓即成。機(jī)械制丸是丸條制成后自動(dòng)切割，搓揉，滾圓。干燥方法多用烘干法干燥：大蜜丸機(jī)蜜丸一般應(yīng)干燥后貯存。以丸?；ゲ徽尺B，不粘手，手捏之不易變形為度。如不需干燥則以蠟皮包裹貯存。實(shí)驗(yàn)

21、六植物油/-環(huán)糊精包合物的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握飽和水溶液法制備包合物的工藝；用單凝聚法制備微囊的方法。2熟悉環(huán)糊精的性質(zhì)及包合物的其他制備方法；熟悉影響成囊的因素及控制方法。3了解環(huán)糊精包合物的應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理環(huán)糊精（cyclodextrin，CYD）是一種新型的水溶性包合材料，是淀粉經(jīng)酶解得到的一種產(chǎn)物。這些分子中有613個(gè)葡萄糖分子以1，4糖苷鍵連接而成的環(huán)筒狀結(jié)構(gòu)的低聚糖化合物，其分子結(jié)構(gòu)中具有一定大小的空穴，有環(huán)筒內(nèi)疏水、環(huán)筒外親水的特性。環(huán)糊精包合物是指借助分子間的作用力（包括靜電引力、氫鍵、偶極子間引力等），藥物分子包含或嵌入環(huán)糊精的筒狀結(jié)構(gòu)內(nèi)形成的超微粒分散物。形成的包合物服

22、用后在體內(nèi)經(jīng)滲透、擴(kuò)散、競(jìng)爭(zhēng)性置換等作用釋放出藥物分子而發(fā)揮藥效。環(huán)糊精包合能將一種液體物質(zhì)轉(zhuǎn)變成一種固體復(fù)合物并且固定芳香物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)。環(huán)糊精包合物制備方法很多，有飽和水溶液法、研磨法、噴霧干燥法、冷凍干燥法等，可根據(jù)環(huán)糊精和藥物的性質(zhì)，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件加以選用。藥物制成包合物后可增加藥物的穩(wěn)定性，增加難溶性藥物的溶解度與溶出速度，提高藥物的生物利用度，掩蓋藥物的不良嗅味，降低藥物的刺激性，還可使液體藥物粉末化以便制劑，有些包合物還可作為緩釋和靶向制劑的藥物載體。微型膠囊（簡(jiǎn)稱微囊）是利用天然、半合成或合成的高分子材料（通稱囊材），將固體或液體藥物（通稱囊心物）包裹而成直徑5µ

23、m250µm的微小膠囊。藥物微囊化后，穩(wěn)定性增加，并呈固體粉末狀，可供制備散劑、膠囊劑、片劑、注射劑及軟膏劑等使用。微囊的制備方法很多，可歸納為物理化學(xué)法、化學(xué)法及物理機(jī)械法等。本次實(shí)驗(yàn)采用物理化學(xué)法中的單凝聚法和復(fù)凝聚法。本實(shí)驗(yàn)利用兩種具有相反電荷的高分子材料作囊材，將囊心物分散在囊材的水溶液中，在一定條件下，相反電荷的高分子材料互相交聯(lián)形成復(fù)合物后，溶解度降低，自溶液中凝聚析出成囊。本實(shí)驗(yàn)所用阿拉伯膠帶負(fù)電，而A型明膠在等電點(diǎn)以上帶負(fù)電，等電點(diǎn)以下帶正電。如果將待包的藥物先與阿拉伯膠制成乳濁液或混懸液，然后在一定溫度下與等量明膠溶液混合，用醋酸調(diào)pH在左右，則明膠帶正電，與帶負(fù)電

24、的阿拉伯膠相互凝聚而包在藥物周圍，成為微囊。三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品顯微鏡（10×40倍）、500ml燒杯、乳缽、溫度計(jì)、水浴、布氏漏斗、100ml量筒、10ml量筒、蒸發(fā)皿、阿拉伯膠、明膠、37%甲醛、10%醋酸、10%氫氧化鈉四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與操作1.薄荷油-環(huán)糊精包合物【處方】 -環(huán)糊精 4g植物油 1mL（28d）蒸餾水 50mL【制法】稱取CYD 4g，置100mL錐形瓶中，加入蒸餾水50mL，加熱溶解，降溫至50，精密滴加植物油1mL，恒溫?cái)嚢?.5小時(shí)。冷藏24小時(shí)，待沉淀完全后過(guò)濾。用無(wú)水乙醇5mL分三次洗滌沉淀3次，至沉淀表面近無(wú)油漬，將包合物置干燥器中干燥，即得。2.植物油

25、微囊【處方】植物油 1.0g 10%醋酸 適量 明膠 2.5g 20%氫氧化納液 適量阿拉伯膠 2.5g 硬脂酸鎂 適量37%甲醛 1.25ml 蒸餾水 適量【制法】取阿拉伯膠2.5g，使溶于50ml蒸餾水中（60），加入植物油1.0g于組織搗碎機(jī)中乳化1分鐘。將之轉(zhuǎn)入500ml燒杯并放入50恒溫水浴鍋中。另取明膠2.5g，使溶于6050ml蒸餾水中。將明膠液在攪拌下加入上述乳濁液中，用10%的醋酸調(diào)pH4.1左右，顯微鏡下觀察見(jiàn)到油珠外層有一層薄薄的膜，即已成囊（此時(shí)囊形并不圓整，大小不一）。加入蒸餾水200ml（溫度應(yīng)不低于30），不斷攪拌直到10以下。加入37%甲醛1.25ml（以蒸餾水

26、1.25ml稀釋），攪拌15分鐘，用20氫氧化鈉液調(diào)pH89，繼續(xù)攪拌冷卻半小時(shí)，除去懸浮的泡沫，濾過(guò)，用水洗滌至無(wú)甲醛臭，pH中性即可。抽濾，加硬脂酸鎂制粒，過(guò)一號(hào)篩，于50烘干，即得。五、注意事項(xiàng)1成囊時(shí)pH調(diào)節(jié)不要過(guò)高或過(guò)低，一般調(diào)pH至4.0左右，此時(shí)明膠全部帶正電荷。2.攪拌速度要適宜。速度過(guò)快，囊膜易破壞，過(guò)慢則微囊易粘連。速度不一，則成囊大小不均勻。3.加入甲醛使囊膜變性，用量多少直接影響變性程度。用10%氫氧化鈉調(diào)pH=8。攪拌30min，以增加甲醛與明膠的交聯(lián)作用，使凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔隙縮小。六、思考題1.制備包合物的關(guān)鍵是什么？2.本實(shí)驗(yàn)為什么選用環(huán)糊精為主分子？它有什么特點(diǎn)

27、？3除飽和水溶液法外，制備包合物的方法還有哪些？4試舉例說(shuō)明包合物在藥物制劑中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)七植物油/-環(huán)糊精包合物的質(zhì)量檢查一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握環(huán)糊精包合物和微囊的質(zhì)量檢測(cè)方法。2熟悉藥物溶出度的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理影響包合物的因素包括內(nèi)因和外因。內(nèi)因：主、客分子的大小；客分子的極性。外因：溫度、附加劑、PH等。為獲得最佳制備工藝，以包合物的收得率、包合物中藥物的含量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，幾種質(zhì)量評(píng)價(jià)方法：顯微鏡法和電鏡掃描法溶解度和溶出度法、紫外分光光度法、熒光光度法、紅外分光光譜法、差示熱分析法、X射線衍射法、核磁共振法。通過(guò)比較包合前后紫外吸收光譜圖，根據(jù)吸收峰的位置和高度來(lái)判斷包合是否成功或包合

28、前后主要成分是否發(fā)生變化。目前微囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)，除制成的制劑本身要求應(yīng)符合藥典規(guī)定外，還包括下述內(nèi)容：（一）形態(tài)、粒徑及其分布，可采用光學(xué)顯微鏡、掃描或電子顯微鏡觀察形態(tài)并提供照片。微囊形態(tài)應(yīng)為圓整球形或橢圓形的封閉囊狀物，微球應(yīng)為圓整球形或橢圓形的實(shí)體；（二）藥物的含量微囊、微球中藥物含量的測(cè)定一般采用溶劑提取法。溶劑的選擇原則是：應(yīng)使藥物最大限度地溶出而最小限度地溶解載體材料，溶劑本身也不應(yīng)干擾測(cè)定。（三）藥物的載藥量與包封率，對(duì)于粉末狀微囊，先測(cè)定其含藥量后計(jì)算載藥量；對(duì)于混懸于液態(tài)介質(zhì)中的微囊，先將其分離，分別測(cè)定液體介質(zhì)和微囊的含藥量后計(jì)算其載藥量和包封率。三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品電子天平、

29、顯微鏡（10×40倍）、溶出儀四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 包合物質(zhì)量檢查（1）性狀 包合物為白色干燥粉末，無(wú)明顯的植物油氣味。（2）重量：稱量包合物的總質(zhì)量，計(jì)算得率。2. 微囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要檢查膠囊內(nèi)容物微膠囊的粒度分布、顯微觀察、總油及表面油。（1）微膠囊的顯微鏡觀察取一滴固化后的微膠囊溶液，將其放于載玻片上，用顯微鏡觀察并測(cè)量其粒徑大小。（）溶出度：量取200 ml蒸餾水，注入每一個(gè)測(cè)定容器內(nèi)，加熱使溶劑溫度保持在37±0.5，調(diào)整轉(zhuǎn)速使其穩(wěn)定，取微囊試樣置于管內(nèi)，然后進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)八 金霉素鏈霉菌培養(yǎng)基的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)會(huì)鏈霉菌種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制；2. 掌握

30、實(shí)驗(yàn)室高壓濕熱滅菌的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦稱“金色鏈霉菌”， 放線菌門(Actinobacteria)， 放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)，鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，鏈霉菌屬(Streptomyces)。在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生金色色素，故名。其菌落為草帽型, 菌落直徑一般為35毫米, 表面較平坦, 中間有隆起。菌落開(kāi)始為白色，長(zhǎng)孢子后變青色。抗菌素工業(yè)上用以生產(chǎn)金霉素。放線菌是一類介于細(xì)菌與真菌之間的單細(xì)胞微生物。放線菌在土壤中分布最多，大多數(shù)生活在含水量較低、

31、有機(jī)質(zhì)豐富和微堿性的土壤中。多數(shù)情況下，泥土中散發(fā)出的“泥腥味”就是由放線菌中鏈霉菌產(chǎn)生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養(yǎng)，菌絲纖細(xì)，分枝，常從一個(gè)中心向周圍輻射生長(zhǎng)。因其生長(zhǎng)具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，并在菌絲末端產(chǎn)生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，因而曾被誤認(rèn)是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌種在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上廣泛應(yīng)用，可產(chǎn)生抗菌素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和分離出的由放線菌產(chǎn)生的抗生素多達(dá)4 000多種，其中，有50多種抗生素已經(jīng)廣泛地得到應(yīng)用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾??；有些可生產(chǎn)蛋白酶

32、、葡萄糖異構(gòu)酶；有的用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌生產(chǎn)或經(jīng)半合成制取的一類廣譜抗生素。抗菌譜極廣，包括革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環(huán)素和土霉素。三、實(shí)驗(yàn)材料與器材1ml移液槍、鋁鍋、電爐NaBr母液（0.1gml）、KCl母液（0.1gml）、M-促進(jìn)劑母液（2.5mgml）四、實(shí)驗(yàn)步驟1種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基(gL)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4， (NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。先稱取黃豆餅粉20g，單獨(dú)煮沸1

33、0分鐘，加入少量涼水降溫，4層紗布?jí)赫ト≈c其它稱好的各成分混合，定容至1L。每50ml分裝到250ml三角瓶中，每組2瓶。2定向發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基(gL)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，酵母粉2.5， (NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，淀粉酶0.1。配制方法同種子培養(yǎng)基，配好后分裝到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分別加入如下成分，比較它們對(duì)四環(huán)素產(chǎn)量的影響：對(duì)照(不加其他成分)；加入NaBr母液至終濃度為2gL；加入KCl母液至終濃度為2gL；加入NaBr母液至終濃度為2gL及M-促進(jìn)劑母液至終濃度為0.025gL。每組

34、各配一瓶。3滅菌將封好口的培養(yǎng)基121滅菌30min。同時(shí)滅1ml 剪口移液槍頭。（總過(guò)程：稱量溶化定容分裝封口滅菌）五、注意事項(xiàng)1黃豆餅粉煮沸取汁。2培養(yǎng)基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以增加透氣性。3滅菌時(shí)鍋內(nèi)要補(bǔ)足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要充分（10min）。六、補(bǔ)充閱讀工業(yè)發(fā)酵中利用生產(chǎn)菌發(fā)酵得出最終產(chǎn)物是一個(gè)逐級(jí)放大的過(guò)程，各個(gè)不同的階段對(duì)于營(yíng)養(yǎng)成分的要求也各有特點(diǎn)，根據(jù)發(fā)酵不同階段的要求，培養(yǎng)基可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。 孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對(duì)這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并

35、要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。所以對(duì)孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是：第一，營(yíng)養(yǎng)不要太豐富（特別是有機(jī)氮源），否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖硝酸鹽其它鹽類的培養(yǎng)基上都能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長(zhǎng)菌絲而不長(zhǎng)孢子。第二，所用無(wú)機(jī)鹽的濃度要適量，不然也會(huì)影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養(yǎng)基的pH和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈兒可伲杷?、表面積大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、

36、生長(zhǎng)和大量繁殖菌絲體，并使菌體長(zhǎng)得粗壯，成為活力強(qiáng)的“種子”。所以種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長(zhǎng)繁殖。種子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過(guò)程中能維持穩(wěn)定的pH，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營(yíng)養(yǎng)豐富而完全的天然有機(jī)氮源，因?yàn)橛行┌被崮艽碳ゆ咦影l(fā)芽。但無(wú)機(jī)氮源容易利用，有利于菌體迅速生長(zhǎng)，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機(jī)及無(wú)機(jī)氮源。最后一級(jí)的種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長(zhǎng)。 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長(zhǎng)、繁殖和合成

37、產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長(zhǎng)所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。但若因生長(zhǎng)和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長(zhǎng)和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時(shí)，則可考慮培養(yǎng)基用分批補(bǔ)料來(lái)加以滿足。實(shí)驗(yàn)九 金霉素鏈霉菌的定向發(fā)酵一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)和掌握無(wú)菌操作技術(shù)。2. 掌握定向發(fā)酵四環(huán)素的原理。二、實(shí)驗(yàn)原理定向發(fā)酵是指通過(guò)改變培養(yǎng)基組分(加入某些物質(zhì))改變微生物代謝途徑，使發(fā)酵按主觀要求產(chǎn)生較多的產(chǎn)物。金霉素、四環(huán)素和土霉素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似：

38、R1R2金霉素ClH土霉素HOH四環(huán)素HH金霉菌原是產(chǎn)生金霉素（Chlortetracycline）的菌種，但因金霉素比四環(huán)素只多一個(gè)氯離子，所以只要在發(fā)酵液中加入某些物質(zhì)，阻止氯離子進(jìn)入四環(huán)素分子，從而使菌種產(chǎn)生較多的四環(huán)素。另外，金色鏈霉菌在30以下時(shí)，合成金霉素的能力較強(qiáng)；當(dāng)溫度超過(guò)35時(shí)則只合成四環(huán)素。本實(shí)驗(yàn)中，利用溴離子在生物合成過(guò)程中對(duì)氯離子有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M-促進(jìn)劑，分子式：C7H5NS2，通常作為橡膠硫化促進(jìn)劑)抑制氯化酶的作用，從而增加四環(huán)素的產(chǎn)量。三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑金霉素鏈霉菌（購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心）、M-促

39、進(jìn)劑、麩皮、K2HPO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2HPO4、瓊脂四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 配制斜面培養(yǎng)基（1）麩皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，瓊脂 1520 g，定容至1L，pH 7。（2）可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.27.5。2. 制備斜面孢子：將保藏的菌種接種于液體培養(yǎng)基中（不加瓊脂的斜面培養(yǎng)基），28下200 r/min振蕩培養(yǎng)，將活化

40、1d后的金霉素鏈霉菌種接入斜面培養(yǎng)基，28培養(yǎng)57天，待孢子長(zhǎng)成灰色，于4冰箱中保藏。3. 種子培養(yǎng)：將在斜面上生長(zhǎng)良好的菌體用接種鏟挑取1cm2左右接入裝有50ml四環(huán)素種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中， 230 r/min、28下振蕩培養(yǎng)2024h。4. 發(fā)酵培養(yǎng)：以剪口移液槍頭取10 ml種子液接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)液的500ml錐形瓶中，230 r/min、28下振蕩培養(yǎng)5 d。用于后面的測(cè)定效價(jià)和薄層層析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)十 四環(huán)素、金霉素的薄層層析鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆毡訉游龅脑?，四環(huán)素族抗生素的定性鑒定方法二、實(shí)驗(yàn)原理層析（色譜，chromatograpby）是相當(dāng)重要、且相當(dāng)常見(jiàn)的

41、一種技術(shù)，在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動(dòng)相的系統(tǒng)中（根據(jù)移動(dòng)相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動(dòng)，利用各成分對(duì)固定相親和力不同所引起的移動(dòng)速度差，將它們彼此分離開(kāi)的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有硅膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無(wú)活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長(zhǎng)形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析（column chromatography），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持

42、物（硅膠、纖維素和淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（thin layer chromatography），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據(jù)固定相與溶質(zhì)（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等三種類型。但這并不是很嚴(yán)格的，有時(shí)常見(jiàn)到其中間類型。此外，近來(lái)也應(yīng)用親和層析，即將與基質(zhì)類似的化合物（通常為共價(jià)鍵）結(jié)合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對(duì)應(yīng)的特定的酶或蛋白質(zhì)。分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機(jī)溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質(zhì)，這些物質(zhì)能儲(chǔ)留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配系數(shù)不同，展層時(shí)就會(huì)形成以不同速

43、度向前移動(dòng)的區(qū)帶。一種溶質(zhì)在兩種互不混溶的溶劑系統(tǒng)中分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相溶劑中的濃度之比為一常數(shù)，稱為分配系數(shù)。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同時(shí)，它們就能被分離開(kāi)。分配系數(shù)大的移動(dòng)快（阻力?。?。薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其上展開(kāi)。當(dāng)斑點(diǎn)不易為肉眼觀察時(shí)，可利用適當(dāng)?shù)娘@色劑，或通過(guò)紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀察。通過(guò)這種展開(kāi)操作，各成分呈斑點(diǎn)狀移動(dòng)到各自的位置上，再根據(jù)Rf值的測(cè)定進(jìn)行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過(guò)薄層圖譜與對(duì)照品的圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個(gè)整體

44、對(duì)制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡(jiǎn)便、快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實(shí)性、穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為藥物制劑的鑒別和質(zhì)量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進(jìn)行顯色，并繪制層析圖譜，根據(jù)層析圖譜對(duì)抗生素進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)以四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對(duì)照對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鑒定。三、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 玻璃層析缸、層析板 、毛細(xì)玻璃管或微量注射器、紫外投射儀、四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品、正丁醇、醋酸、凡士林四、實(shí)驗(yàn)步驟1層析板處理 層析板105烘烤過(guò)夜，均勻噴上0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PH4.5)，于空氣中晾干、備用。2點(diǎn)樣選取兩種定向發(fā)酵液約1ml于1.5ml離心管中，10000

45、rpm，5min，備用。在距層析板底邊2.53 cm起始線上(用鉛筆劃線，做出點(diǎn)樣點(diǎn)記號(hào))，用毛細(xì)玻璃管在薄層層析板上點(diǎn)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液3次，發(fā)酵液上清點(diǎn)810次，點(diǎn)樣點(diǎn)不大于0.4cm，每次都要吹干后再點(diǎn)。（一般效價(jià)在1000uml以上點(diǎn)3次，5001000uml點(diǎn)4次，200500uml點(diǎn)5次）。3. 層析（展開(kāi)）用正丁醇：醋酸：水(415)的上相作展開(kāi)劑。層析前需預(yù)先用展開(kāi)劑預(yù)平衡層析缸，可在缸中倒入2cm高的展開(kāi)劑，密閉，一般保持1530分鐘。然后將層析板置于盛有展開(kāi)劑的層析缸中，在室溫下展層68h（與溫度有關(guān)）。封口不嚴(yán)可涂抹凡士林。4熒光顯影待溶劑前沿展至板的一半以上

46、時(shí)將層析板取出，標(biāo)出溶劑前沿，于通風(fēng)櫥中晾干，用氨水熏數(shù)秒鐘后即可在紫外燈下顯影，畫(huà)出黃色斑點(diǎn)，分別算出Rf值。（四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品慢和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品快）無(wú)水四環(huán)素在波長(zhǎng)365nm下顯黃色熒光，根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照可定性測(cè)定。五、注意事項(xiàng)1. 要控制好點(diǎn)樣量，樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察，但樣品量太多時(shí)往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象。2. 若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過(guò)大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。3. 點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。4. 作展開(kāi)劑中極少量強(qiáng)極性溶劑(0.5)或pH值的改變可顯著改善拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)十一 四環(huán)素效價(jià)測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?

47、. 了解抗生素效價(jià)的表示方法2. 學(xué)習(xí)抗生素的測(cè)定方法二、實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)利用比色法測(cè)定四環(huán)素和金霉素的效價(jià)。效價(jià)(titer或titre)是評(píng)價(jià)抗生素效能的標(biāo)準(zhǔn)，它代表抗生素對(duì)微生物的抗菌效力，也是衡量發(fā)酵液中抗生素含量的尺度，人們以1µg金霉素或四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品為1個(gè)單位，0.6µg青霉素G鈉鹽為1個(gè)單位。四環(huán)素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產(chǎn)生黃色的脫水金霉素和脫水四環(huán)素，其色度與含量成正比。在堿性條件下，四環(huán)素較穩(wěn)定，而金霉素則生成無(wú)色的異金霉素： 根據(jù)上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測(cè)定四環(huán)素、金霉素混合液的總效價(jià)；而四環(huán)素效價(jià)的測(cè)定可在堿性條件下，使金霉素生成無(wú)

48、色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環(huán)素生成黃色的脫水四環(huán)素，經(jīng)比色測(cè)得四環(huán)素效價(jià)。總效價(jià)與四環(huán)素效價(jià)二者之差即為金霉素的效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)只測(cè)定四環(huán)素的效價(jià)。 發(fā)酵液中，由于雜質(zhì)的干擾，將影響比色的正確性，因此加入乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改變四環(huán)素脫水條件(降低酸度或延長(zhǎng)加熱時(shí)間)，可以減少雜質(zhì)對(duì)比色反應(yīng)的干擾。三、實(shí)驗(yàn)步驟取各定向發(fā)酵液10ml于50ml容量瓶中，加入l ml濃度為lgl00ml EDTA溶液，加蒸餾水5ml，再加入5ml濃度為3molL的NaOH，在2025下保溫15min后，加入5ml濃度為6molL的HCl，水浴煮沸15min后，冷卻

49、，稀釋至刻度，在分光光度計(jì)上于380nm處測(cè)定其吸光度值。對(duì)照樣品（不加誘導(dǎo)劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入HCl后，不加熱，稀釋至刻度，作為測(cè)定樣品的空白對(duì)照, 調(diào)零。四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（1000U/ml）取1ml于50ml容量瓶中，加1ml濃度為6molL的HCl，水浴煮沸15min后，冷卻，稀釋至50ml，380nm測(cè)吸光度。（以蒸餾水作為空白測(cè)定）以定向發(fā)酵培養(yǎng)基中的對(duì)照組作為空白對(duì)照，測(cè)定其它三個(gè)處理組的吸光度。（有時(shí)可能因?qū)φ战M處理不當(dāng)而使其它組的讀數(shù)為負(fù)值，這時(shí)可以以蒸餾水作為空白。）計(jì)算公式：發(fā)酵液中四環(huán)素的效價(jià)=A發(fā)酵×四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)×1/10A四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)十二人參細(xì)胞培養(yǎng)與人參皂苷提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握人參皂甙的提取、精制方法，進(jìn)一步鞏固和熟悉人參皂甙的性質(zhì)。2. 熟悉和掌握人參皂甙的水解條件和方法。3. 熟悉和掌握柱層析分離人參皂甙元的原理方法及基本操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理 人參的主要成分為人參皂苷，總皂苷含量約4，人參皂苷大多數(shù)是白色無(wú)定形粉末或無(wú)色結(jié)晶，味微甘苦，具有吸濕性。人參皂苷易溶于水，甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、乙酸、乙酸乙酯，不溶于乙醚、苯等親脂性有機(jī)溶劑。水溶液經(jīng)振搖后可產(chǎn)生大量的泡沫。人參總皂苷無(wú)溶血作用，分離后，B型和c型人參皂苷有顯著的溶血作用，而A型人參皂苷有抗溶血作用。 人參中除含有皂苷外，還含有脂