計算機虛擬篩選技術(shù)的應(yīng)用---“高原舒”復(fù)方產(chǎn)品的研制

1、計算機虛擬篩選技術(shù)的應(yīng)用-“高原舒”復(fù)方產(chǎn)品的研制王麗君，金玲玲，姬迎春，李建銀，楊永建( 蘭州大學(xué)藥學(xué)院 生藥學(xué)研究所，甘肅 蘭州73000 )摘要：目的：采用計算機軟件模擬系統(tǒng)，通過計算機模擬進行分子對接，探究“高原舒顆?！保ㄟx用柳茶為君藥，黃芪、當(dāng)歸為臣藥）的效用物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)文獻資料查閱【1】，已知25種柳茶成分，58種黃芪主成分和62種當(dāng)歸主成分三維結(jié)構(gòu)，并根據(jù)其功能相關(guān)性，模擬復(fù)方單味藥主成分與一氧化氮合酶受體的相互作用，篩選出與一氧化氮結(jié)合的可逆能力，運用計算機模擬篩選藥物組方原理，利用天然藥物資源，開發(fā)出能夠緩解高原反應(yīng)癥狀、抗缺氧、抗疲勞的同時又能提高機體免疫力、補氣活血等保

2、健功能的中藏藥現(xiàn)代制劑。方法：根據(jù)計算機模擬復(fù)方單味藥主成分效用為參考，設(shè)計單味藥提取條件和工藝，將柳茶、當(dāng)歸、黃芪分別用不同有機溶劑回流提取，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收濃縮的方法獲取浸膏；之后以已發(fā)表論文配比為基礎(chǔ)，按一定的劑型處方配取藥液，制備缺氧性小鼠模型，通過灌胃給藥方式治療。將小鼠隨機分為模型對照組、柳茶提取物組、黃芪提取物組、當(dāng)歸提取物組，復(fù)方混合提取物組、同時設(shè)空白對照；除空白對照組外，各組灌胃給藥，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，連續(xù)給藥7天，通過一定的方法處理后觀察小鼠的抗缺氧能力。結(jié)果：模型小鼠的抗缺氧能力高。結(jié)論：高原舒具有緩解高原反應(yīng)癥狀和抗缺氧、抗疲勞的作用。關(guān)鍵詞: 柳茶; 高原病; 抗缺氧

3、1材料與儀器1.1藥材 柳茶采自甘肅省甘南藏族自治州的合作市郊，為薔薇科 鮮卑花屬 植物窄葉鮮卑花Sibiraea angustata(Rehd.)Hand.-Mazz.的葉；當(dāng)歸采自甘肅省岷縣，為傘形科植物當(dāng)歸的根；黃芪采自甘肅省岷縣，為豆科植物膜莢黃芪的干燥根，以上藥材均經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院楊永建教授鑒定。1.2儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 RE-52AA, 上海亞榮生化儀器廠；SHB-型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電子天平， 梅特勒-托利及（常州）稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；手提式多功能粉碎機，上海廣沙工貿(mào)有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。1.3試劑分析純無水乙醇，批號2012

4、0301，天津市光復(fù)科發(fā)展有限公司；分析純石油醚，天津市光復(fù)科發(fā)展有限公司；甲醇，色譜純試劑，天津市光復(fù)精細化工研究所；分析純乙酸乙酯，天津市光復(fù)科發(fā)展有限公司；分析純?nèi)燃淄?，天津市白世化工有限公司；分析純正丁醇，萊陽化工實驗廠；蒸餾水，蘭州大學(xué)GLP實驗室。 2方法2.1 藥物的提取與分離 2.1.1柳茶 【2】 . 取粗枝葉粉碎，共1088g。依次用石油醚，EtOAc和EtOH八倍量回流提取，每次3h,分別抽濾回收溶劑，得各部浸膏38.7g,86.2g,73.9g。2.1.2黃芪 【3】 干燥黃芪粉碎，共499g。乙醇回流提取3次，每次6倍乙醇提取2h，抽濾合并提取液，回收溶劑得浸膏12

5、7.6g，加6倍水稍加熱使之懸浮。分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇2倍量各4次萃取，回收溶劑得各部浸膏10g,2.5g,6.5g,8.1g。2.1.3當(dāng)歸【4】 當(dāng)歸生藥粉碎，共319g。分別用8倍量70%甲醇、30%甲醇和水，回流提取3h，抽濾回收溶劑。得各部浸膏164.7g，44.9g，26.5g。 2.2 動物實驗 2.2.1實驗小鼠的喂養(yǎng) 分組取健康成年昆明鼠48只，雌雄各半。隨機分為6組，每組4只雌鼠4只雄鼠，分裝在各籠中。第一組蒸餾水（0.2ml/10g）,第二組柳茶浸膏混合溶液（0.2ml/10g 相當(dāng)于原藥材0.366g/10g），第三組當(dāng)歸浸膏混合溶液（0.2ml/10g

6、 相當(dāng)于原藥材0.108/10g），第四組黃芪浸膏混合溶液（0.2ml/10g 相當(dāng)于原藥材0.222/10g），第五組柳茶黃芪當(dāng)歸浸膏2 : 0.5 : 1混合溶液（0.2ml/10g相當(dāng)于原藥材柳茶0.076g黃芪0.063g當(dāng)歸0.009g/10g）第六組柳茶黃芪當(dāng)歸浸膏1 : 0.1 : 0.5混合溶液（0.2ml/10g相當(dāng)于原藥材柳茶0.040g黃芪0.013g當(dāng)歸0.005g/10g）。每日上午喂食喂水控制體重，晚上灌胃給藥。2.2.2 小鼠抗缺氧檢測 給藥一周，觀察記錄小鼠行為、體重、飲食等。末次給藥前禁食不禁水12小時，給藥后45分鐘分別封裝在廣口瓶中，記錄各小鼠死亡時間。

7、2.23數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用s 表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。3實驗結(jié)果3.1計算機模擬分子對接結(jié)果與NO合酶對接較好的成分柳茶鮮卑花酯-14.5126正二十四烷酸-12.771十八酸-12.5869二十醇-12.5713咖啡酸-12.5538黃芪毛蕊異黃酮-7-O-D葡萄糖苷-17.34212 '，4' -二甲氧基3 '-羥基異黃烷-6-0-13-葡萄糖苷-16.5519半乳糖醛酸-15.7238山奈酚-7-O-葡萄糖苷-15.42137-羥基-3 '

8、;，4 '二甲氧基-2' ，5' -二葡萄糖異黃烷苷-15.0359當(dāng)歸肉豆寇酸-14.3427胱氨酸-13.5605蔗糖-13.5217谷氨酸-13.327鄰苯二甲酸-13.17933.2動物行為學(xué)觀察試驗期間，大鼠毛色光滑，進食量穩(wěn)定，與正常組相比活動增加。3.3各藥物提取液對小鼠抗缺氧時間的影響表1-1 各藥物提取液對小鼠抗缺氧時間的影響（s）組別 N 小鼠抗缺氧時間 /min1空白組 5 27.4600±1.479192柳茶提取物混合組 6 43.8333±5.98888aaa3當(dāng)歸提取物混合組 8 31.2500±2.81780b

9、bb4黃芪提取物混合組 8 39.9625±5.15085aac5柳茶：黃芪：當(dāng)歸=2:0.5:1 6 39.6167±10.40662aac6柳茶：黃芪：當(dāng)歸= 1:0.1:0.5 7 41.3286±9.13906aaacc與空白組作比較，a :P<0.05,aa:P<0.01,aaa:P<0.001; 與柳茶組做比較，b :P<0.05,bb:P<0.01,bbb:P<0.001; 與當(dāng)歸組做比較，c :P<0.05,cc:P<0.01,ccc:P<0.001;與黃芪組做比較，d :P<0.05,d

10、d:P<0.01,ddd:P<0.001; 與混合組2:0.5:1作比較，e :P<0.05,ee:P<0.0,eee:P<0.0011; 與混合組1:0.1:0.5作比較，f :P<0.05,ff:P<0.01,fff:P<0.001。 結(jié)果表明，柳茶組，黃芪組，柳茶：黃芪：當(dāng)歸=2:0.5:1組，柳茶：黃芪：當(dāng)歸= 1:0.1:0.5組相對于空白組都可明顯提高小鼠抗缺氧的時間，增強小鼠耐氧能力。柳茶組，黃芪組，柳茶：黃芪：當(dāng)歸=2:0.5:1組，柳茶：黃芪：當(dāng)歸= 1:0.1:0.5組相對于當(dāng)歸組都有不同程度的提高。 圖1-1各組抗缺氧時間4

11、討論體內(nèi)一氧化氮（NO ）主要通過激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（GC ），使靶細胞內(nèi)cGMP水平升高而發(fā)揮生理作用。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS ）產(chǎn)生的NO 可擴張血管、調(diào)節(jié)血壓、改變局部血流、抑制血小板聚集、抗平滑肌細胞增殖。神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS ）產(chǎn)生的NO 以遞質(zhì)形式參與神經(jīng)信息傳導(dǎo)和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（i NOS）產(chǎn)生的NO 在炎癥、免疫反應(yīng)中起細胞毒與細胞抑制作用【5】。本實驗通過計算機模擬個藥物成分與NOS的結(jié)合能力，研究結(jié)合能力較強的藥物成分對小鼠抗缺氧、抗疲勞能力的影響。 25 種柳茶成分，58種黃芪主成分和62種當(dāng)歸主成分三維結(jié)構(gòu)模擬復(fù)方單味藥主成分與一氧化氮

12、合酶受體的相互作用結(jié)果表明，各藥物中與NO合酶結(jié)合能力較強的成分與各所含主要成分相一致，說明是各藥物的主要成分在起作用。上述藥物的提取方法即提取各藥物的重要成分。柳茶組，黃芪組，柳茶：黃芪：當(dāng)歸=2:0.5:1組，柳茶：黃芪：當(dāng)歸= 1:0.1:0.5組相對于空白組都可明顯（P<0.01）提高小鼠抗缺氧的時間，增強小鼠耐氧能力，說明這幾組藥物的配比都有緩解高原反應(yīng)的能力。柳茶組，黃芪組，柳茶：黃芪：當(dāng)歸=2:0.5:1組，柳茶：黃芪：當(dāng)歸= 1:0.1:0.5組相對于當(dāng)歸組都有不同程度的提高，說明當(dāng)歸中含有抗缺氧的成分物質(zhì)含量較低。柳茶：黃芪：當(dāng)歸=2:0.5:1組可顯著（P<0.

13、01）提高小鼠抗缺氧能力，柳茶：黃芪：當(dāng)歸= 1:0.1:0.5可極顯著（P<0.001）提高小鼠抗缺氧能力，說明后者“君臣佐使”原則的藥物配比效果較好。但相對于柳茶組沒有明顯的提高，有待進一步研究探索出更好的藥物配比，使其更加完善?？傊?，黃芪具有較好的緩解缺氧的能力，柳茶、黃芪、當(dāng)歸不同的配比對抗缺氧，緩解高原反應(yīng)都具有一定的意義。但本實驗僅是對上述藥物抗缺氧、緩解高原反應(yīng)的初步研究，還需要對其進行細胞及分子水平的證實，探討其作用機制，從而為更好的開發(fā)高原草藥資源，找到更好的緩解高原反應(yīng)的藥物打下基礎(chǔ)。參考文獻：【1】中華本草 苗藥卷，貴州科技出版社，2005年ISBN:7806623O5，編委【2】張承忠，李沖，封士蘭等