恒溫擴增技術綜述

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上 摘要：恒溫擴增技術是繼PCR技術后發(fā)展起來的一門新型的體外核酸擴增技術。目前主要的恒溫擴增技術有：滾環(huán)核酸擴增、環(huán)介導等溫擴增、鏈替代擴增、依賴核酸序列擴增和解鏈酶擴增。它們都具有共同的特點：恒溫、高效、特異、不需要特殊的儀器設備。本文就現(xiàn)階段恒溫擴增技術的特點及其在動物疫病檢測中的應用情況和前景做一綜述。關鍵詞：恒溫擴增；PCR引言：近年來，隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，基于核酸檢測的診斷方法已大量建立并廣泛應用于動物疾病的實驗室檢測中，恒溫擴增技術就是在此背景下出現(xiàn)的。與其它的核酸擴增技術相比，恒溫擴增有快速、高效、特異的優(yōu)點且無需專用設備。所以它一經出現(xiàn)就被許

2、多學者認為是一種有可能與PCR 媲美的檢測方法，目前主要的恒溫擴增技術有：滾環(huán)核酸擴增（rolling circle amolification，RCA）、環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、鏈替代擴增（strand displacement amplification，SDA）、依賴核酸序列擴增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA） 和解鏈酶擴增（helix dependent amplification，HAD），這些技術各有特點，這也決定了它們在動物疾病檢測中的

3、應用情況，下面就它們的原理、特點及其在動物疫病檢測中的應用情況進行綜述。1 滾環(huán)核酸擴增1. 1 滾環(huán)核酸擴增的原理滾環(huán)核酸擴增（rolling circleamolification, RCA）是通過借鑒病原生物體滾環(huán)復制DNA 的方式而提出的1，可分為線性擴增與指數(shù)擴增兩種形式。線性RCA 是引物結合到環(huán)狀DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，產物是具有大量重復序列（與環(huán)狀DNA 完全互補）的線狀單鏈。線性RCA 用于靶核酸擴增僅限于一些具有環(huán)狀核酸的病毒、質粒和環(huán)狀染色體，線性擴增倍數(shù)為105。指數(shù)RCA原理與線性RCA 相同，采用與環(huán)狀DNA 序列完全一致的第二種引物，該引物與第

4、一次線性RCA 產物結合并酶促延伸，其產物又作為第一種探針的模板，這樣一來在很短的時間內（1h），產物呈指數(shù)遞增。指數(shù)RCA 可用于非環(huán)狀DNA 的擴增，增倍數(shù)能達107 2。1. 2 滾環(huán)核酸擴增的優(yōu)勢與不足RCA 的優(yōu)勢：(1) 高靈敏度。RCA有很強的擴增能力，線性RCA 的效率可達到l05 倍，而指數(shù)RCA 的效率可達到109 倍，這一高靈敏度特性使其能夠檢測到單拷貝水平3；(2)高序列特異性?？梢詤^(qū)分單一位點的不同模式；(3) 擴增產物經過磷酸化處理后可以直接用來測序。(4)高通量。RCA 可以在靶目標上形成閉合的環(huán)狀序列，確保RCA 產生的信號集中在一點，從而實現(xiàn)原位擴增和載片擴增

5、； RCA 只要保證探針的識別段序列與靶序列互補，不需要考慮靶序列的性質，因此檢測RNA 時不再需要預先進行RNA 的逆轉錄。RCA 的不足：（1）鎖式探針常接近100bp， 合成費用較高。2000 年，Antson DO 等采用PCR 方法在實驗室合成探針，可以在很大程度上降低成本；（2）信號檢測時的背景問題。在RCA 反應過程中未成環(huán)的鎖式探針和未結合探針的模板DNA 或者RNA 可能產生一些背景信號。1. 3 滾環(huán)核酸擴增在畜牧生產中的應用雖然可以通過一些方法部分克服RCA 的不足，但也進一步增加了反應成本，使得RCA 在動物疾病的臨床檢測中不適合被采用。2 環(huán)介導等溫擴增2. 1 環(huán)介

6、導等溫擴增的原理環(huán)介導等溫擴增其擴增原理是基于DNA 在65左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA 的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈，在此前提下利用4 種不同的特異性引物識別靶基因的6 個特定區(qū)域，在鏈置換型DNA 聚合酶的作用下，以外側引物區(qū)段的3末端為起點，與模板DNA 互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成4。2. 2 環(huán)介導等溫擴增的優(yōu)勢與不足LAMP 的優(yōu)勢：（1）擴增效率高，能夠在1h 內有效的擴增1-10 個拷貝的目的基因，擴增效率為普通PCR的10 倍-100 倍；（2）反應時間短，特異性強，不需要特殊的設備。LAMP 的不足：（1） 對引物的要求特

7、別高；（2） 擴增產物不能用于克隆測序，只能用于判斷；（3）由于其敏感性強，特別容易形成氣溶膠，造成假陽性影響檢測結果。2. 3 環(huán)介導等溫擴增技術在動物疾病檢測中的應用LAMP 技術從誕生之日起就被認為是最有可能代替PCR 進行實驗室檢測的方法。2008 年Anne-Lie B 等應用RT-LAMP建立了豬水皰病病毒(SVDV)的診斷方法5，該方法對血清樣本的敏感性相當于實時PCR，對糞便樣品的敏感性優(yōu)于實時PCR。3 鏈置換擴增3. 1 鏈置換擴增的原理鏈置換擴增其原理是基于在靶DNA 兩端帶有被化學修飾的限制性核酸內切酶識別序列，核酸內切酶在其識別位點將鏈DNA 打開缺口，DNA 聚合酶

8、延伸缺口3端并替換下一條DNA 鏈6。被替換下來的DNA 單鏈可與引物結合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復進行，使靶序列被高效擴增。SDA 的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內切酶、一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶、兩對引物、dNTP 以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。3. 2 鏈置換擴增技術的優(yōu)勢與不足SDA 的優(yōu)點：（1） 擴增效率高，據(jù)Walker 等人的報道，采用SDA 擴增結核分枝桿菌總DNA 中的一段序列時，37反應2 小時后，可將靶序列擴增106 倍7；（2）反應時間短，特異性強，不需要特殊的設備。SDA 的不足：（1）SDA 產物不均一。在SDA 循環(huán)中總要產生一些單、雙鏈產物，

9、用電泳法檢測時必然要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。（2）SDA 產物不可能直接用于克隆，測序和表達。使得SDA 在基因工程方面沒有優(yōu)勢；（3）SDA 產物的檢測手段有待提高。目前SDA 產物檢測的主導方法是熒光偏振檢測，但該檢測方法需要特殊的檢測儀器- 熒光分光光度計，這限制了SDA 在臨床的廣泛應用。3. 2 鏈置換擴增在動物疫病檢測中的應用當前SDA 方法主要應用于分枝桿菌核酸定性檢測、病毒體外進化研究23和芯片雜交等方面，還沒有運用于動物疫病的檢測。4 依賴核酸序列擴增4. 1 依賴核酸序列擴增的原理依賴核酸序列擴增(NASBA)是在PCR 基礎上發(fā)展起來的一種新技術。是由1 對帶有T7 啟動子序列的引

10、物引導的連續(xù)、等溫、基于酶反應的核酸擴增技術，反應在41進行，可在2 h 內將模板RNA 擴增109 倍8，比常規(guī)PCR 法高1000 倍。4. 2 依賴核酸序列擴增的優(yōu)勢與不足NASBA 技術的優(yōu)勢在于對RNA 病毒的檢測，因為：（1）它的引物上帶有T7 啟動子序列，而外來雙鏈DNA 無T7 啟動子序列，不可能被擴增，因此在有DNA 污染的條件下，NASBA 技術同樣具有較高的特異性和靈敏度9；（2）NASBA 將反轉錄過程直接合并到擴增反應中，縮短了反應時間。NASBA 也存在許多缺陷：（1）反應成分比較復雜；（2） 需要3 種酶使得反應成本較高；（3）對DNA 病毒的檢測上NASBA 就

11、顯得不是那么適合。4. 3 依賴核酸序列擴增在動物疫病檢測中的應用NASBA 與LAMP 一樣在恒溫擴增技術中是相對成熟技術，現(xiàn)在已應用于動物疫病檢測中。我國2004 年發(fā)布的8 項禽流感系列標準中，有兩項應用了NASBA檢測方法， 即GBT19439-2004H5 亞型禽流感病毒NASBA 檢測方法和GBTl9440-2004禽流感病毒NASBA 檢測方法10。6 小結動物疫病的檢測是一項特殊的檢測工作，它一方面需要快速、準確的檢測結果，另一方面對檢測的成本也有著苛刻的要求。而恒溫擴增技術在很大程度上符合了它的需要，雖然說當前把恒溫擴增技術運用于動物疫病的檢測還有著不少的缺陷，但它的優(yōu)越性也

12、是有目共睹的，特別是其中的LAMP 和NASBA 已經逐漸開始運用到動物疫病的檢測中。我們相信通過對恒溫擴增技術的不斷完善，它必然會和PCR 技術一樣成為動物疫病檢測中不可缺少的檢測手段?！緟⒖嘉墨I】 1 Hobbie J E，Daley R J, and JasperS. Use of nuclepore filters for countingbacteria by fluorescence microscopyJ.Appl Envir Microbiol，1977，33 (5)：1225-12282 李影，王偉利，錢愛東. 畜產中相關食源性致病菌“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”的檢測策略J.中國動物

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