腫瘤科研項目方案設(shè)計

1、XX腫瘤相關(guān)功能基因XXX研究課題設(shè)計一、XX腫瘤相關(guān)基因功能研究整體技術(shù)路線二、合作項目簡介整個文章的研究思路是，在臨床病理當中發(fā)現(xiàn)在XX腫瘤標本中XXX基因特異性高表達，在相應(yīng)的腫瘤細胞系也得到一致的結(jié)果，隨后選取2株典型的細胞系用XXX基因的RNAi的lentivirus獲得細胞、整體水平研究數(shù)據(jù)，了解該基因沉默后對腫瘤增殖，凋亡，侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。最后檢測XXX基因的下游作用分子，尋找其可能的作用途徑。預期文章數(shù)據(jù)框架:Fig.1 腫瘤病理標本中研究的靶基因呈現(xiàn)表達上調(diào)（免疫組化或qPCR）Fig.2 不同的XX腫瘤細胞株中該基因的表達也顯著增高Fig.3慢病毒（lentivirus

2、）結(jié)構(gòu)圖，腫瘤細胞感染圖片F(xiàn)ig.4 靶基因RNAi慢病毒感染腫瘤細胞后，mRNA和蛋白表達顯著下調(diào)（qPCR和western）Fig.5 在兩株細胞上沉默靶基因之后平行的MTT結(jié)果及統(tǒng)計Fig.6 在兩株細胞上沉默靶基因之后流式分析細胞周期，計算凋亡率Fig.7 在兩株細胞上沉默靶基因之后克隆形成能力變化，圖片和統(tǒng)計結(jié)果Fig.8 用腫瘤細胞感染RNAi慢病毒制備成穩(wěn)定細胞株，然后做裸鼠成瘤實驗，裸鼠圖片，每天量瘤子大小，做腫瘤生長曲線，4周處死稱瘤重，計算抑瘤率。Fig.9下游基因的qPCR檢測結(jié)果（如果有陽性結(jié)果就放上去）Fig.10 western blot驗證上述實驗結(jié)果三、實驗方案

3、1、XXX在XX細胞表達檢測實驗實驗內(nèi)容：選取多株XX細胞株，檢測XXX基因的表達，高表達XXX基因的兩株細胞用于后續(xù)RNAi的研究。1. qPCR檢測不同細胞株中XXX的mRNA水平；2. 對XXX表達陽性的細胞株進行感染預實驗，確定各個細胞株病毒感染的難易程度3. 將有XXX表達并且容易感染的腫瘤細胞感染RNAi病毒并進行MTT實驗實驗?zāi)康模捍_定各細胞XXX的表達以及在MTT實驗中哪株細胞的功能最明顯，作為選擇相應(yīng)細胞株進行后續(xù)功能實驗研究的依據(jù)。實驗在多株腫瘤細胞上平行進行（如qPCR檢測發(fā)現(xiàn)有細胞低表達XXX，則該細胞不進入MTT實驗）項目分組NCConRNAiqPCR-XXX（驗證）

4、細胞增殖檢測（MTT法）2、XXX在腫瘤細胞系中的功能研究實驗內(nèi)容：根據(jù)預實驗的結(jié)果選擇12株細胞系進行XXX的相應(yīng)功能的實驗研究，獲得一套in vitro實驗數(shù)據(jù)。同時在XXX RNAi獲得功能表型的變化后，重新導入一個突變的XXX表達病毒載體，使得功能變化得到回復，從而驗證RNAi反應(yīng)和基因功能的特異性。實驗?zāi)康模捍_定XXX基因在腫瘤細胞中的功能Knock Down XXX功能驗證XXX siRNA病毒ControlNCXXX RNAi組別說明空白對照RNAi陰性對照RNAi病毒qPCR-XXXWestern-XXX細胞增殖檢測（MTT法）凋亡檢測（annexin-v/pi雙染法）克隆形成

5、（克隆形成實驗）3、XXX作用機理研究（下游相關(guān)基因檢測）實驗內(nèi)容：根據(jù)上述的實驗結(jié)果確定XXX的功能后，對其相關(guān)基因進行檢測（qPCR或WB法），確定XXX作用的信號傳導通路。相關(guān)基因可以是以前研究報道的，也可以是經(jīng)典的途徑如與凋亡相關(guān)的、增殖相關(guān)的或侵襲相關(guān)的途徑實驗?zāi)康模捍_定XXX的作用機制4、XXX在動物水平功能研究實驗內(nèi)容：運用慢病毒感染后的腫瘤細胞直接與對照細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤，4周后比較瘤體大小，計算抑瘤率，也可以采用細胞成瘤后定點注射瘤體的方式進行實驗，兩種方式互為驗證，獲得一套高質(zhì)量的in vivo實驗數(shù)據(jù)實驗?zāi)康模涸谡w水平驗證XXX基因在腫瘤成瘤過程中的功能分組Contro

6、lNC-1RNAi-1NC-2RNAi-2組別說明空白對照用陰性對照病毒感染細胞成瘤用RNAi病毒感染細胞成瘤定點注射陰性對照病毒定點注射RNAi病毒5、XXX表達與臨床樣本的關(guān)系（可用組織芯片技術(shù)）實驗內(nèi)容：收集腫瘤組織樣本，獲得相應(yīng)的蛋白和RNA，進行XXX表達Pattern和表達量分析，臨床標本進行免疫組化檢測。實驗?zāi)康模河^察XXX表達情況和腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、藥物敏感性、預后的關(guān)系四、候選基因信息：AXXX；CXXX；EXXX；iXXX；NXXX（僅以以上幾個基因為例，我們基因庫中已有有效RNAi慢病毒顆粒）（考慮到科研工作的需要，把具體的基因信息隱去了，還請諒解！）AXXX 2002年

7、才被克隆，屬于比較新的基因，它是大腸桿菌AXXb的同源物，涉及其研究的文章可以檢索到的總共大約有10篇左右，目前主要是停留在研究其作為雙脫氧酶可以通過氧化去甲基化催化去除DNA的1-methyladenine和3-methylcytosine，從而起到DNA修復的作用。該蛋白主要是與雙鏈DNA結(jié)合，2008年的nature剛剛報道了這種結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)。腫瘤方面只見到其在腦腫瘤中有高表達的報道。該基因的研究前景廣闊，可以從以下幾個方面：1該基因產(chǎn)物在腫瘤中的作用，包括腫瘤的生存、凋亡、對細胞周期的影響、對腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移方面的作用。還可研究其是否可以作為腫瘤標記物來輔助臨床診斷和治療?？蛇x擇得腫瘤

8、類型可以涵蓋各種各樣的腫瘤，因為沒有同類報道，所有在腫瘤領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)都將是"在世界上第一次"。非常適合開展實驗。如果有結(jié)果出來基本上可以確定該課題組在國際上的領(lǐng)先地位，應(yīng)該特別容易發(fā)文章，申請經(jīng)費。2由于報道了其與DNA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，因此，可以針對這種結(jié)構(gòu)，設(shè)計其特異的抑制劑，所合成的抑制劑無論在基礎(chǔ)科研還是臨床治療（見2）領(lǐng)域，均有廣闊的應(yīng)用前景。有巨大的商業(yè)前景。 CXXX 2003年12月才被識別，屬于比較新的基因，涉及其研究的文章可以檢索到的總共大約有10篇左右，目前主要是停留在組學分析上，對基因的功能知之甚少，只見到2篇其在Crohn's disease和

9、ulcerative colitis中有相關(guān)性的報道。腫瘤方面未見任何報道。該基因的研究前景廣闊，可以從以下幾個方面研究：1該基因在正常和腫瘤組織的表達譜如何。適合開展實驗。2該基因產(chǎn)物在腫瘤中的作用，包括腫瘤的生存、凋亡、對細胞周期的影響、對腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移方面的作用。還可研究其是否可以作為腫瘤標記物來輔助臨床診斷和治療。可選擇的腫瘤類型可以涵蓋各種各樣的腫瘤，如果有結(jié)果出來基本上可以確定該課題組在國際上的領(lǐng)先地位，應(yīng)該特別容易發(fā)文章，申請經(jīng)費。3根據(jù)生物信息學分析其屬于cyclin超家族的成員，有Cyclin box fold，有 Protein binding domain ，該結(jié)構(gòu)參與c

10、ell-cycle 和 transcription 調(diào)控。該結(jié)構(gòu)存在于cyclins, TFIIB和 Retinoblastoma (RB). cyclins 由8類cell cycle調(diào)節(jié)因子組成，可以起調(diào)節(jié)cyclin dependent kinases (CDKs)的 作用. TFIIB 是一個可以結(jié)合TATA box的轉(zhuǎn)錄因子. Cyclins, TFIIB 和RB 各帶有兩個拷貝的該結(jié)構(gòu)域。基于這些可以參考上述幾個分子的功能設(shè)計實驗，看是否CXXX也有這些相似的功能。iXXX是抑癌基因家族中的一個較新的癌基因，直接抑制p53活性，由于p53的廣泛作用，ixxxx必然在多種腫瘤中發(fā)揮其促癌作用，可以想見其作用的腫瘤類型應(yīng)當較多，但是目前研究報道尚少。機制方面，與p53的相互作用，應(yīng)是重要的研究方向。可以從以下幾個方面開展工作：1、該基因在正常和腫瘤的表達譜預實驗2、該基因功能作用實驗3、與P53蛋白作用關(guān)系及調(diào)控機制研究NXXX 1998年被基因定位，屬于研究結(jié)果比較少的基因，涉及其研究的文章可以檢索到的總共幾十篇，該