紅細(xì)胞凝集試驗HA與紅細(xì)胞凝集抑制試驗

1、紅細(xì)胞凝集試驗（HA）與紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）用疫苗按一定免疫程序進行免疫接種是控制雞病流行的主要途徑之一，這種觀點已被廣大養(yǎng)殖戶接受并引起足夠重視。但雞群免疫抗體的產(chǎn)生及維持時間受到雞群免疫應(yīng)答能力、所用疫苗種類、免疫方法、免疫次數(shù)、疫病流行狀況等方面的影響，良好的免疫接種不等于雞群能夠產(chǎn)生良好的保護力。因而通過對雞群進行抗體監(jiān)測，及時檢查雞群的免疫狀態(tài)、疫苗使用效果，為制定合理的免疫程序提供依據(jù)就顯得非常重要。通過對廣大養(yǎng)殖戶的大量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于缺乏有效的監(jiān)測手段，養(yǎng)殖戶普遍存在盲目免疫的現(xiàn)象。因此，建立合理的抗體監(jiān)測制度，開展免疫抗體監(jiān)測工作，已經(jīng)成為我們當(dāng)前養(yǎng)雞生產(chǎn)中急需開展的一項

2、重要工作。下面將抗體監(jiān)測所需設(shè)備及監(jiān)測過程向大家做一說明。 一、實驗用設(shè)備：1、離心機 1臺*（3000轉(zhuǎn) 離心紅細(xì)胞）2、冰箱 1臺*（存放抗原）3、振蕩器 1臺*（振蕩96孔V型板）4、抗原 新城疫（ND）、減蛋（EDS）、流感（AI）抗原，從正規(guī)廠家進。5、96孔V型板 稀釋血清 清洗后可重復(fù)使用6、八道移液器 1把（5-50微升 稀釋血清）7、吸頭 和八道移液器配套使用，清洗后重復(fù)使用）8、積液槽 配制4個單位抗原及盛放生理鹽水加樣用9、一次性采血管 采血用10、2毫升注射器 采血用11、紅細(xì)胞 非免疫雞心臟采血或免疫雞也可，但需離心5次后使用。12、檸檬酸三鈉 配制3.8抗凝劑用13

3、、重鉻酸鉀 配制清潔液用14、硫酸 配制清潔液用 15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球 和吸管配套使用17、針頭 9*13（采雛雞）、9*25（采大雞）18、蒸餾水 當(dāng)?shù)刭I。清洗96孔V型板、吸頭用19、10毫升離心管 離心紅細(xì)胞用 （塑料制） 20、生理鹽水 做血清稀釋液用、配制4單位抗原二、實驗前的準(zhǔn)備：1.抗原：從指定廠家購買穩(wěn)定濃縮抗原。2.抗凝劑的配制：用天平稱量3.8克檸檬酸三鈉，溶入100ml生理鹽水中，待溶解完全后即可使用。3.1紅細(xì)胞懸液：由雞心臟或翅靜脈采血，放入加有抗凝劑的離心管內(nèi)（按抗凝劑：全血1：2的比例），迅速混勻。在離心機中以3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用吸管吸

4、去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將沉淀的紅細(xì)胞加生理鹽水，慢慢混合均勻，再在離心機中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，再加生理鹽水混勻，如此反復(fù)離心45次，最后一次離心后的紅細(xì)胞，棄去上清液，即為紅細(xì)胞泥。放入4冰箱中可保存23天。使用時用1ml吸管吸取0.1ml紅細(xì)胞泥，然后加入9.9ml的生理鹽水，此即1%紅細(xì)胞懸液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。4.被檢血清：每只雞心臟或翼下采血0.5-1ml,靜置或離心，待血清析出后備用。5.吸管清潔液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。水10公斤，硫酸100毫升，將硫酸慢慢倒入水中，不斷攪拌，操作時必須戴手套，口罩。6.96孔V型板和微量滴頭清潔液的配制：重鉻酸鉀79克

5、，水1000ml，硫酸100ml，將重鉻酸鉀磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不斷攪拌，切不可將重鉻酸鉀水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作時必須戴手套，口罩。7.血清稀釋液：為滅菌的生理鹽水。三、實驗過程：原理：某些病毒（如新城疫、減蛋、流感）能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集，此即為紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）。應(yīng)用：1、檢測血清中的抗體水平，確定免疫時機。2、免疫后及時監(jiān)測，確認(rèn)免疫效果。3、輔助診斷病毒性疾病。包括血凝（HA）試驗、抗原校正和血凝抑制（HI）試驗三步：（一）血凝（HA）試驗：采用96孔V型反應(yīng)板，測定抗原效價1、首

6、先用微量移液器向反應(yīng)板的每孔加生理鹽水25微升。2、用微量移液器吸取待測抗原25微升于第一孔中并擠壓6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去25微升。3、微量移液器再吸取1%紅細(xì)胞懸液依次加入各孔，每孔25微升。4、置于微量振蕩器上振蕩1分鐘。5、室溫靜置30分鐘后觀察結(jié)果。6、結(jié)果觀察：將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于孔底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動，說明紅細(xì)胞被病毒所凝集。能使雞紅細(xì)胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數(shù)，稱為該抗原滴度紅細(xì)胞凝集效價。即沉淀的前一孔即為該抗原

7、的效價。如彩圖1所示第8孔紅細(xì)胞為完全凝集，說明該抗原效價為1：256。彩圖1：圖1 抗原效價為1：256（二）4單位抗原校正：1、根據(jù)抗原效價結(jié)果配制相應(yīng)比例的抗原稀釋液：即4單位抗原。例：上圖1：抗原效價為1：256，HI試驗時，25微升抗原稀釋液內(nèi)須含4個凝集單位，則應(yīng)將抗原作256/4=64倍稀釋。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理鹽水。2、首先用微量移液器向反應(yīng)板的第二孔至第六孔加生理鹽水25微升。第一孔不加。3、用微量移液器吸取4單位抗原25微升分別加入第一孔、第二孔中，從第二孔開始擠壓6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀釋到第5孔，棄去25微升。4、用微量移液器再吸取

8、1%紅細(xì)胞懸液依次加入1-6孔，每孔25微升。5、于微量振蕩器上振蕩1分鐘。6、室溫靜置30分鐘后觀察結(jié)果。7、結(jié)果觀察：第一、二、三孔為完全凝集，第四孔紅細(xì)胞為50%沉淀，第五孔為對照完全沉淀，如果出現(xiàn)以上結(jié)果，表明所配4單位抗原準(zhǔn)確，校正成立。如彩圖2所示。彩圖2：圖2 前三孔為紅細(xì)胞完全凝集，第四孔為紅細(xì)胞50凝集，第五孔為紅細(xì)胞完全沉淀，說明該次抗原校正成立（三）血凝抑制（HI）試驗：每排孔檢查1份血清。步驟如下：1.用微量移液器先加25微升生理鹽水于各孔中。2.用微量移液器吸取待檢血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀釋至第11孔，棄去25微升。最后一孔不稀釋，為紅細(xì)胞對照。3.用微量

9、移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。4.置于微量振蕩器上振蕩1分鐘，混合均勻。5.室溫靜置20分鐘。6.用微量移液器吸取1%紅細(xì)胞懸液于每孔各加25微升。7.置于微量振蕩器上振蕩1分鐘，混合均勻。8.室溫靜置40分鐘后觀察結(jié)果。四、結(jié)果判定：1）判定結(jié)果：以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，以2的指數(shù)表示。見彩圖3：圖3 上圖抗體結(jié)果從上至下依次為：8/7/8/9/8/7/7/62）判定標(biāo)準(zhǔn)：1.新城疫抗體：育雛育成雞在7以上，產(chǎn)蛋雞在9以上。2.H5抗體：抗體值在6以上。3.H9抗體：抗體值在7以上。注：低于以上標(biāo)準(zhǔn)，則需要進行免疫。3)免疫后抗體規(guī)律一般活疫苗免后7-10天產(chǎn)生抗體，2-3周抗體到達(dá)峰值，可以維持2個月。滅活疫苗免后10-15天產(chǎn)生抗體，3-4周抗體到達(dá)峰值，可以維持3-4個月。五、實驗后的用具處理：1、96孔V型反應(yīng)板的清洗：新反應(yīng)板可直接放入清潔液中浸泡24小時，用過的反應(yīng)板先用流水沖凈孔中的反應(yīng)物，然后泡在清潔液中，24小時后撈出，甩掉清潔液，放入流水中沖洗干凈后，在蒸餾水中沖洗一遍，甩干，擺放在恒溫箱中，烤干備用。屬塑料制品，70以下烤干。2、微量滴頭的清洗：新滴頭直接放入清洗液中浸泡，用過的用清水沖洗掉滴頭中的血清后浸泡在清潔液中，最少浸泡24小時，撈出后用流動水沖