大鼠胃竇部胃泌素和生長抑素mRNA及其相關(guān)蛋白表達(dá)的研究

1、大鼠胃竇部胃泌素和生長抑素mRNA及其相關(guān)蛋白表達(dá)的研究    周凡葛振華王若愚 (福建省中醫(yī)藥研究院病理研究所，福州350003) 摘要為探討大鼠胃竇部胃泌素mRNA和生長抑素mRNA在G、D細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及其相關(guān)蛋白的表達(dá)，用免疫細(xì)胞化學(xué)和原位雜交技術(shù)，檢測了大鼠胃竇部G細(xì)胞內(nèi)的胃泌素和D細(xì)胞內(nèi)的生長抑素以及它們相應(yīng)的mRNA。結(jié)果顯示，大鼠胃竇部的G、D細(xì)胞位于幽門腺基部，細(xì)胞分布不均，單個或多個在一起；胃泌素和生長抑素均勻地分布于胞質(zhì)內(nèi)，核內(nèi)陰性；G/D細(xì)胞比值在1.3±0.321.55±0.75之間，即G細(xì)胞多于D細(xì)胞。mRNA

2、信號染色強(qiáng)度細(xì)胞間有差異，呈極性分布，多位于核周或核上胞質(zhì)內(nèi)。mRNA陽性細(xì)胞數(shù)在單位面積內(nèi)少于G、D免疫組織化學(xué)顯示陽性細(xì)胞數(shù)，原因可能是由于多聚甲醛的固定對mRNA的降解，降低了mRNA的活性，從而導(dǎo)致某些G、D細(xì)胞內(nèi)mRNA不能被檢出。該法具有安全、省時、定位準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適合一般實(shí)驗(yàn)室和臨床診斷需要。 關(guān)鍵詞胃竇G細(xì)胞D細(xì)胞胃泌素mRNA生長抑素mRNA 原位雜交大鼠 人與動物的胃竇部粘膜和腺上皮中，散在分布著較多的G、D細(xì)胞。G細(xì)胞分泌胃泌素，可刺激壁細(xì)胞分泌胃酸和胃粘膜的生長1；而D細(xì)胞則分泌生長抑素，以旁分泌方式調(diào)節(jié)G細(xì)胞胃泌素的分泌2；G、D細(xì)胞在調(diào)節(jié)胃酸的分泌方面起著重要作用。

3、本研究用原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，初步探討了在正常情況下，大鼠胃竇部胃泌素mRNA和生長抑素mRNA在G、D細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。 材料和方法 1.標(biāo)本制備 5只成年雄性Wistar大白鼠，體重180200g，CO2窒息后，迅速取胃幽門部，用Lillie固定液固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，(厚5m)，用0.1%polylysine粘片，在60溫箱烘烤2h，室溫保存。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色 切片脫蠟入水后，入0.2mol/L HCl 20min(阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶)，水洗5min,pH7.4的PBS(內(nèi)含0.1% TritonX-100)20 min；加10%正常羊血清

4、室溫培育20min(減少背景非特異性染色)，除去多余液體后加兔抗人胃泌素抗體或兔抗人生長抑素抗體(-邁新公司試劑盒)，置濕盒內(nèi)4冰箱過夜；次日取出濕盒，室溫放置45min，PBS洗3次，每次5min；加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1100)室溫孵育90min；PBS洗3次，每次5min，加堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親合素(美國Zymed盒試劑)，室溫20min；PBS洗1次5min，pH8.4 THB15min，用BCIP-NBT(Zymed盒試劑)暗處顯色10 min，入5mmol/L EDTA終止反應(yīng)，流水洗5min，甘油明膠封片。對照片用PBS代替第一抗體，其他步驟與實(shí)驗(yàn)片相同。 3.原位雜交 3

5、.1切片脫蠟入水后，用0.2mol/L HCl配制的0.03%胃蛋白酶室溫消化20min，DEPC水洗5min，固定于4%多聚甲醛5min，DEPC水洗2次，每次2min。 3.2入預(yù)雜交緩沖液60min，按我室過去的方法配制3；除去多余液體后加入雜交液，置潮濕容器內(nèi)50溫箱過夜。雜交液配制：預(yù)雜交緩沖液加入生物素標(biāo)記的大鼠胃泌素或生長抑素探針,濃度為2g/L(丹麥Larsson教授贈送),探針序列分別為Rat Gas5-CTGGGGGTGGCTGGAGATG -GCTGGGCT-3與大鼠胃泌素mRNA互補(bǔ)，Rat Som 5-TGAGTTAGCAGATCTCTGCAGCT-3與大鼠生長抑素m

6、RNA互補(bǔ)。次日，取出切片用37預(yù)熱的0.1×SSC洗4次，每次15min。 3.3檢測雜交顯色：pH7.4的TBS洗2次，每次5min，加鼠抗生物素的抗體(1100，DaKo)室溫60 min；TBS洗3次，每次5min，加生物素標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1250,DaKo)室溫45min；TBS洗后加堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親合素(1100，DaKo)室溫30 min；pH8.4的預(yù)檢測緩沖液15min，用BCIP-NBT顯色15min，入5m mol/L EDTA 5min終止反應(yīng)，流水洗5 min，甘油明膠封片。對照片不加探針，其他步驟與實(shí)驗(yàn)片相同。全部過程均須帶手套，以免污染。 4.觀

7、察 在高倍鏡(×40)下，每只動物免疫細(xì)胞化學(xué)染色切片和原位雜交切片，從十二指腸端向胃底腺方向計(jì)數(shù)10個網(wǎng)格內(nèi)的陽性細(xì)胞，每個網(wǎng)格面積為0.1662mm2，然后求出每只動物單位面積內(nèi)陽性細(xì)胞的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。 結(jié)果 G、D細(xì)胞及其相應(yīng)的mRNA染色陽性反應(yīng)均呈藍(lán)黑色，對照片為陰性。G、D細(xì)胞位于幽門腺的下1/3，相當(dāng)于幽門腺的底部(圖1，2)，細(xì)胞分布不均，多單個或3個在一起，胃泌素和生長抑素，分布在胞質(zhì)內(nèi)，胞核陰性。G細(xì)胞多集中在胃竇部，十二指腸腺或上皮內(nèi)也有少數(shù)G細(xì)胞，但胃底腺無G細(xì)胞；G細(xì)胞多呈錐體或卵圓形，基底部膨大而頂部狹窄，開口于腺腔(圖1)，這些細(xì)胞大都屬開放型，很少看

8、到閉合型。D細(xì)胞比G細(xì)胞稍小，細(xì)胞形狀各異，有時可見有細(xì)胞突起，穿過細(xì)胞間隙而達(dá)腺體基膜或基膜外(圖2a)；D細(xì)胞大多屬閉合型，也有的細(xì)胞一端伸向管腔，形成開放型(圖2)。G、D細(xì)胞在單位面積內(nèi)的數(shù)目見表1。從表中可看出G、D細(xì)胞在單位面積內(nèi)的數(shù)目有差異，但G細(xì)胞多于D細(xì)胞。 胃泌素mRNA和生長抑素mRNA在細(xì)胞內(nèi)的分布與胃泌素和生長抑素免疫反應(yīng)性細(xì)胞相同(圖3，4)，但胃泌素和生長抑素mRNA多聚集在核周邊胞質(zhì)內(nèi)(圖3，4)或核上區(qū)胞質(zhì)內(nèi)，染色強(qiáng)度細(xì)胞間有差異。在單位面積內(nèi)胃泌素和生長抑素mRNA信號陽性細(xì)胞與相應(yīng)免疫反應(yīng)性細(xì)胞比較，其數(shù)值低于G、D細(xì)胞，見表2。 表1G、D細(xì)胞數(shù)目及比值

9、 Table 1 The ratio of G and D cells G細(xì)胞 G cells(x±s) D細(xì)胞 D cells(x±s) G/D比值 G/D(x±s) 8.6±3.20 6.6±2.60 1.30±0.32 7.8±1.78 5.6±1.80 1.39±0.52 6.8±1.30 5.2±2.38 1.30±0.36 6.2±0.83 4.0±2.34 1.55±0.75 5.6±2.10 3.8±1.30

10、1.47±0.45 表2G、D細(xì)胞數(shù)目及相關(guān)mRNA的比較 Table 2 Comparision of the number in G,D cells and their mRNA G細(xì)胞 G cells (x±s) 胃泌累mRNA gastrin mRNA (x±s) D細(xì)胞 D cells (x±s) 生長抑素mRNA somatostatin mRNA (x±s) 8.6±3.20 5.5±1.29 6.6±2.60 4.8±1.92 7.8±1.78 5.2±2.16 5.6

11、±1.80 4.0±0.70      6.8±1.30 4.8±2.59 5.2±2.38 3.8±0.67 6.2±0.83 4.0±1.58 4.0±2.34 3.4±0.74 5.6±2.10 4.0±1.60 3.8±1.30 2.8±0.80 討論 免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果顯示，大鼠胃竇部的G細(xì)胞，大多屬開放型，細(xì)胞狹窄一端伸入腺腔，便于接受胃內(nèi)容物的化學(xué)刺激。電鏡證實(shí)開放型細(xì)胞游離端有微絨毛，表明它們可能

12、像味覺細(xì)胞一樣具有化學(xué)感受器功能，調(diào)節(jié)胃酸的分泌4。D細(xì)胞多為閉合型，細(xì)胞具有較長的突起，突起末端不達(dá)腺腔，而是穿越幾個細(xì)胞間隙達(dá)到基膜或基膜外；也有部分細(xì)胞屬開放型，一端伸入腺腔，Lamberts等5認(rèn)為此類細(xì)胞約占30%。關(guān)于G、D細(xì)胞內(nèi)分泌釋放的方式目前還有爭論，我們認(rèn)為G細(xì)胞是以內(nèi)分泌的方式，將胃泌素先釋放入局部的微血管，然后經(jīng)過血液循環(huán)對胃底腺壁細(xì)胞的分泌產(chǎn)生生物效應(yīng)，因胃底腺缺乏G細(xì)胞，所以不可能以旁分泌方式影響壁細(xì)胞鹽酸的分泌，而胃竇部的D細(xì)胞則可以旁分泌方式調(diào)節(jié)G細(xì)胞的分泌。生長抑素在調(diào)節(jié)胃酸分泌方面起著重要的作用。在胃底腺的D細(xì)胞可直接抑制壁細(xì)胞的分泌，在胃竇部的D細(xì)胞是通過

13、抑制胃竇的G細(xì)胞活動間接減少胃酸的分泌5。G、D細(xì)胞的突起由于切片厚度和切面方向等因素，在切片上很難觀察到突起的全貌。Larsson6用免疫熒光雙染法觀察到，大鼠胃竇部的G、D細(xì)胞緊密相鄰，相互接觸或擁抱，可見兩者關(guān)系密切。G/D細(xì)胞的比值，雖然個體間有所差異(表1)，但其比值大于1則是一致的。 用Lillie固定液固定的標(biāo)本，能夠較好地保存胃泌素和生長抑素的免疫反應(yīng)性。生物素標(biāo)記的胃泌素和生長抑素寡核苷酸探針，能較容易透入細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)過抗體-鏈親合素-堿性磷酸酶(ASAP)過程后，用BCIP-NBT顯色，準(zhǔn)確地將mRNA定位在G、D細(xì)胞內(nèi)。它們多分布在核周以及核上的胞質(zhì)內(nèi)，但mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)

14、到細(xì)胞質(zhì)并分布在特定位置的機(jī)理還不清楚。G、D細(xì)胞mRNA信號染色強(qiáng)度不同，反映了細(xì)胞間mRNA含量的差異，這可能與細(xì)胞生理活動有關(guān)。Larsson等2認(rèn)為在幽門腺最底部衰老的G、D細(xì)胞幾乎檢測不到相應(yīng)的mRNA，與D細(xì)胞密切接觸的G細(xì)胞mRNA也顯著減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅提示了G、D細(xì)胞功能上的關(guān)系，也反映了細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄或表達(dá)伴隨著細(xì)胞的生理活動有所變化。G、D細(xì)胞在單位面積內(nèi)數(shù)目高于相關(guān)mRNA信號陽性數(shù)目(表2)的原因可能是由于固定液中的多聚甲醛對mRNA的降解，降低了mRNA的活性，從而導(dǎo)致mRNA陽性細(xì)胞減少。Larsson7用免疫熒光雙染法也證明絕大多數(shù)G、D細(xì)胞可同時表達(dá)mRN

15、A及其相關(guān)蛋白，也有少數(shù)細(xì)胞僅含mRNA或相關(guān)蛋白成分。 我們在實(shí)踐中體會到用非放射性標(biāo)記、人工合成的胃泌素和生長抑素寡核苷酸探針，進(jìn)行原位雜交檢測靶細(xì)胞內(nèi)特異性mRNA，有很大的實(shí)用價值，不僅檢測系統(tǒng)安全，而且定位準(zhǔn)確，節(jié)省時間，適合一般實(shí)驗(yàn)室和臨床診斷的需要。 本文照片由龔遠(yuǎn)芳同志幫助洗印，特此致謝。 收稿 1997-05修回 1997-09 圖版說明 圖1大鼠胃竇部粘膜G細(xì)胞()一端伸入腺腔(L)×600(下同) 圖2大鼠胃竇部粘膜，少數(shù)D細(xì)胞()一端伸入腺腔(L)，多數(shù)細(xì)胞位于腺細(xì)胞底部()，有的D細(xì)胞突起穿過細(xì)胞間隙到達(dá)基膜處(2a內(nèi)) 圖3示胃泌素mRNA信號,有的mRN

16、A位于核周圍()，有的位于核上區(qū)的胞質(zhì)內(nèi)() 圖4示生長抑素mRNA信號，有的mRNA位于核周圍的胞質(zhì)內(nèi)()，有的位于核上區(qū)的胞質(zhì)內(nèi)() Explanation of figures Fig.1 Showing the G cells()in the rat antrum,the narrow end of cells extended to the lumen of glands(L).×600 (The same as follows) Fig.2 A few D cells() were seen in the antral mucosa,one end of cells ex

17、tended to the lumen of glands(L),but most of D cells located in the basal part of glandular cells().One process of D cell passed through intercelluar space and end at the basement membrane(Fig.2a). Fig.3 Showing gastrin mRNA signal apppeared in the cytoplasm()or the supernuclear cytoplasma(). Fig.4

18、Showing somatostatin mRNA signal distributed in the cytoplasm()or the supernuclear cytoplasma(). 參考文獻(xiàn) 1Larsson L-I,Hougaard DM.Combined non-radioactive detection of peptide hormone and their mRNAs in endocrine cells.Histochemistry,1991,96(5):375 2Larsson L-I,Hougard DM.Evidence for paracrine somatos

19、tatinergic regulation of gastrin gene expression by double staining cytochemistry and quantitation.J Histochem Cytochem,1994,42(1):37 3葛振華，王長青，王若愚.用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測人淋巴細(xì)胞組織和淋巴瘤內(nèi)免疫球蛋白輕鏈mRNA.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，1993，2(4)：276 4成令忠主編.組織學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：11261127 5Lamberts R,Stumnps D,Plumpe L,et al.Somatostatin

20、cells in rat antral mucosa:quantitative ultrastructural analysis in different states of gastric acid secretion.Histochemistry,1991,95(4):373 6Larsson L-I,Goltermann N,Schwartz TW,et al.Somatostatin cell processes as pathway for paracrine secretion.Science,1979,205(9):1393 7Larsson L-I,Hougaard DM.No

21、n-radioactive in situ mRNA hybridization using synthetic oligonucleotides:Principles,combination with immmunocytochemistry and quantitation.Neuroscie Protoc,1993,20(1):1 EXPRESSION OF GASTRIN,SOMATOSTATIN AND THEIR CORRESPONDING mRNA IN RAT ANTRUM Zhou Fan,Ge Zhenhua,Wang Ruoyu (Department of Pathol

22、ogy, Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,Fuzhou) In situ hybridization and immunocytochemical technique have been used to detect the gastrin,somatostatin and their corresponding mRNA in G,D cells of rat gastric antrum.The results showed that G,D cells one or three cells together located in basal part of pyloric glands,Gastrin and somatostatin distributed homogenously in cytoplasma,but the nuclei were negative.The number of G cells was more than that of D cells,and their ratio was ranged from 1.3±0.32 to 1.55±0.75.The staining intensity of mRNA signa