新型增殖性腺病毒治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究

1、    新型增殖性腺病毒治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究            作者：楊家和，段紀(jì)成，錢其時(shí)間：2007-11-23 10:09:00                     【摘要】  目的  構(gòu)建攜帶p53基因增殖

2、性腺病毒CNHK600-p53載體，研究其對肝癌細(xì)胞株抑制效應(yīng)是否優(yōu)于Ad-p53。方法  實(shí)驗(yàn)分為兩組，單用CNHK600-p53組和單用Ad-p53組；采用四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium assay， MTT），觀察兩組對肝癌細(xì)胞株的殺傷效應(yīng)。結(jié)果  單用CNHK600-p53組較單用Ad-p53組肝癌細(xì)胞株細(xì)胞抑制率高；但當(dāng)細(xì)胞抑制率達(dá)到80%以上時(shí)，兩組之間差異無顯著性，統(tǒng)計(jì)分析采用率的U檢驗(yàn)。結(jié)論  較Ad-p53相比攜帶p53基因的CNHK600-p53能更有效抑制肝癌細(xì)胞株，CNHK600-p53可望成為肝癌基

3、因治療的新方法。 【關(guān)鍵詞】  基因；p53； 肝腫瘤； 基因療法 The effect of new type replicating adenovirus on the treatment of hepatocarcinoma cell line【Abstract】  Objective  To construct a replicating adenovirus vector CNHK600-p53 which carried the anti-tumor gene p53,then investigate its inhibition effect is

4、better than Ad-p53 on hepatocarcinoma cell line.Methods  The subject is divided into two groups:single CNHK600-p53 group and single Ad-p53 group. The methylthiazolyl tetrazolium assay （MTT）method was used to observe the killing effect of hepatocarcinoma cell line.Results  The single CNHK60

5、0-p53 groups inhibition rate is higher than single Ad-p53 group; But when inhibition rate is about to 80%, there are no difference in two groups. The data are analysed by U test.Conclusion  Contrast to Ad-p53, adenovirus CNHK600-p53 is more effective  in inhibition to hepatocarcinoma cell

6、line. CNHK600-p53 may be an new gene method for hepatocarcinoma.【Key words】  gene;p53;hepatocarcinoma;gene therapy    p53基因是重要的腫瘤抑制基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后關(guān)系密切。已證明超過50%以上的腫瘤存在p53基因的異常，且發(fā)現(xiàn)p53 基因的突變可能與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)1，因而p53基因?qū)氤蔀橹匾哪[瘤基因治療手段，也可能是解決腫瘤耐藥性的方法之 一。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建攜帶p53基因增殖性腺病毒CNHK600-p53載體，研究其對

7、肝癌細(xì)胞株抑制效應(yīng)是否優(yōu)于Ad-p53。1  材料與方法1.1  材料  293細(xì)胞、腺病毒載體pUC19購自加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司；腺病毒載體pClon17、腺病毒載體CNHK600、腺病毒載體ppE3本室構(gòu)建；限制性內(nèi)切酶、胎牛血清、DMEM和Lipofectamine2000試劑盒購自Gibco公司；Taq酶、pfu酶購自MBI公司； T4 DNA連接酶購自PROMEGA公司；瓊脂糖、溴化乙錠購自GENE公司；膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒DNA制備試劑盒和病毒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；人肝癌細(xì)胞株BEL-74

8、02、人肝癌細(xì)胞株QGY-7703購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF5、人肝癌細(xì)胞株HepG2購自美國ATCC公司；增殖缺陷型腺病毒Ad-p53購自深圳賽百諾公司。1.2  增殖性腺病毒載體 CNHK600-p53構(gòu)建  設(shè)計(jì)引物，上游引物：5-CCG GAA TTC GCC ATG GAG GAG CCG CAG T-3；下游引物：5-CGC GGA TCC TTA TCA GTC TGA GTC AGG CCC TTC TG-3，PCR方法擴(kuò)增p53基因，用膠回收試劑盒回收大小為1179 bp的DNA片段，回收片段及pUC19載體分別用Eco

9、R和Xba酶切，將酶切后的p53目的基因片段與酶切后的pUC19載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌感受態(tài)，挑取生長的細(xì)菌單克隆， PCR法篩選陽性克隆。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定并測序（TaKaRa）正確后命名為pUC19-p53，將pUC19-p53用EcoR和Xba酶切，pClon17載體用EcoR和Nhe酶切，將酶切后p53目的基因片段與酶切后的pClon17載體連接，轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌感受態(tài)，挑取生長的細(xì)菌單克隆，PCR法篩選陽性克隆。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，PCR及酶切鑒定，鑒定正確后命名為pClon17-p53，將pClon17-p53用Age、Not和Sca酶切，CN

10、HK600用Age、Not酶切，37水浴4h，分別電泳切膠回收2.469 kb和10.35 kb的片段，將酶切后含CMV啟動(dòng)子+p53基因+SV40 poly-A加尾信號的目的片段與酶切后的CNHK600載體連接，轉(zhuǎn)化、挑克隆、抽提質(zhì)粒，PCR及酶切鑒定。1.3  增殖性腺病毒CNHK600-p53的包裝及鑒定  利用Lipofectamine2000試劑盒，將質(zhì)粒CNHK600-p53與和5型腺病毒骨架載體ppE3共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后914天細(xì)胞出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取腺病毒DNA（其具體方

11、法參見QIAGEN公司操作說明）。一組引物(見構(gòu)建部分)檢測p53基因的存在，另一組引物 (上游引物：5-CTG GCC AAT ACC AAC CTT A-3；下游引物：5-ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC-3)用來排除野生型腺病毒的存在。對病毒重組體進(jìn)行PCR鑒定正確者命名為CNHK600-p53，即攜帶p53基因的雙調(diào)控增殖型腺病毒，氯化銫密度梯度離心法純化病毒，TCID50方法測得病毒滴度1.99×1010pfu/ml，-80保存。1.4  兩種病毒對肝癌細(xì)胞株增殖的影響  實(shí)驗(yàn)分兩組:（1）單用CNHK600-p53組；（2）單用Ad

12、-p53組。取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞株(BEL-7402、QGY-7703、PLC/PRF5、HepG2)接種于3板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（約1×104個(gè)細(xì)胞/孔），培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁生長良好后吸去培養(yǎng)基。CNHK600-p53組及Ad-p53組分別加入病毒100l/孔（對于肝癌細(xì)胞株QGY-7703和HepG2，MOI分別為0.01、0.1、1、10、100、1000；對于肝癌細(xì)胞株BEL-7402，MOI為0.001、0.01、0.1、1、10、100；對于肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF5，MOI為0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10；）；加入病毒100l/孔，每個(gè)濃度設(shè)4

13、個(gè)復(fù)孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，棄去培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)液100l/孔，加MTT 10l/孔，輕拍96孔板邊緣5min，置于37 5%CO2孵箱內(nèi)46 h；加10%SDS+0.01 mol/L HCl 100 l/孔，輕拍96孔板邊緣5 min，置于37 5%CO2孵箱內(nèi)，過夜；酶聯(lián)免疫檢測儀， 測定570nm波長光密度值。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  數(shù)據(jù)以x±s表示，細(xì)胞抑制率=（對照孔D值-實(shí)驗(yàn)孔D值）/對照孔D值×100%，統(tǒng)計(jì)分析采用率的U檢驗(yàn)分析。2  結(jié)果單用CNHK600-p53組及單用Ad-p53

14、組的細(xì)胞的D值及細(xì)胞抑制率詳見表14。表1  CNHK600-p53或Ad-p53對PLC/PRF5細(xì)胞的D值和細(xì)胞抑制率（略）表2  CNHK600-p53或Ad-p53對HepaG2細(xì)胞的D值和細(xì)胞抑制率（略）表3  CNHK600-p53或Ad-p53對BEL-7402細(xì)胞的D值和細(xì)胞抑制率（略）表4  CNHK600-p53或Ad-p53對QGY-7703細(xì)胞的D值和細(xì)胞抑制率（略）注：*P<0.05,*P<0.01 vs Ad-p53 group    隨著病毒MOI值的不斷增高其殺傷肝癌細(xì)胞能力也增強(qiáng)

15、；單用CNHK600-p53組較單用Ad-p53組細(xì)胞抑制率高；但當(dāng)細(xì)胞抑制率達(dá)到80%以上時(shí)，兩組之間差異無顯著性。3  討論1996年美國ONYX藥物公司研究的E1B55KD缺陷的增殖型腺病毒（ONYX-015），它利用腫瘤細(xì)胞中p53基因突變而正常細(xì)胞中p53正常的差異使病毒在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖。目前該病毒已進(jìn)入期臨床試驗(yàn)。但是，單用該病毒療效甚微，有效率低于20%，所以必須與放化療聯(lián)合應(yīng)用才能有效的殺傷腫瘤2。但ONYX-015存在著諸多不足，如在體內(nèi)半衰期短，需要反復(fù)注射等。為此我們設(shè)想應(yīng)用上面介紹的腫瘤特異性增殖型腺病毒攜帶某種對腫瘤治療有明確療效的抗癌基因，利用這類病

16、毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖及復(fù)制，而在正常細(xì)胞內(nèi)不增殖的特點(diǎn)，從而使包括p53在內(nèi)的抗癌基因在    腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性高效表達(dá)，這種結(jié)合病毒治療與基因治療優(yōu)點(diǎn)的新型治療方案稱為基因病毒治療法。在前期的研究中，我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了腫瘤特異性增殖腺病毒CNHK500，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明CNHK500在選擇性增殖和抗腫瘤療效上明顯優(yōu)于ONYX-015，且在靜脈大劑量用藥的情況下未觀測到明顯的肝細(xì)胞毒性3，4。為了進(jìn)一步降低病毒對正常細(xì)胞的毒性作用，提高安全性，我們利用正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的另一大差異Rb基因，在CNHK500的基礎(chǔ)上構(gòu)建了CNHK600。最近國外

17、研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入野生型p53基因聯(lián)合化療或放療，可取得較好的治療效果5；p53基因的缺失或突變在腫瘤是非常常見的基因異常，p53基因突變影響腫瘤細(xì)胞對化療和放療的敏感性6。Ad-p53（商品名今又生）2004年在中國上市，是一種重組人p53基因的非增殖型腺病毒，該病毒對肺癌、皮膚癌、宮頸癌、胃癌、腸癌、食管癌、頭頸部癌等腫瘤患者的治療顯示，32%的患者腫瘤完全消失，27%的患者腫瘤部分消失，41%的患者腫瘤停止生長，顯示出良好的治療效果。但與其他的腫瘤基因治療一樣，Ad-p53也存在轉(zhuǎn)染率不高、表達(dá)不穩(wěn)定、靶向性不強(qiáng)等問題。本實(shí)驗(yàn)將p53基因插入增殖型腺病毒CNHK600，構(gòu)建攜帶p53基因的增殖

18、性腺病毒CNHK600-p53，該病毒缺失E1A中與Rb蛋白結(jié)合的基因序列，保留使腺病毒有效逃避宿主免疫監(jiān)視及有效裂解宿主細(xì)胞而釋放子代病毒的E3區(qū)，用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動(dòng)子及缺氧反應(yīng)(HRE)啟動(dòng)子來分別調(diào)控腺病毒的E1A及E1B基因，從而使病毒的復(fù)制更準(zhǔn)確地靶向腫瘤細(xì)胞，力圖達(dá)到廣譜、特異、安全、高效的抗癌效果。通過體外實(shí)驗(yàn)觀察CNHK600-p53是否優(yōu)于Ad-p53，我們發(fā)現(xiàn)CNHK600-p53對肝癌細(xì)胞的抑制效果優(yōu)于Ad-p53，但當(dāng)細(xì)胞抑制率達(dá)到80%以上時(shí)，兩組之間差異無顯著性。原因可能為CNHK600-p53為增殖型腺病毒，其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可以特異性的增殖，p53基因的表達(dá)量成倍數(shù)級增長，同時(shí)釋放出的病毒顆粒亦可殺傷腫瘤細(xì)胞；但當(dāng)細(xì)胞抑制率達(dá)到80%以上時(shí)，肝癌細(xì)胞大部分死亡，影響了CNHK600-p53在肝癌細(xì)胞中的增殖有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1  Chan KT, Luang ML. Mutant p53 expression enhances drug resistance in a hepatocellular carcinoma cell line. Cancer Chemother Pharmacol, 2004, 53: 519-526.2  Chiocca EA, Abbed KM