喇咕多糖對α-淀粉酶活性的抑制及其對糖尿病大鼠血糖影響的實驗

1、喇咕多糖對-淀粉酶活性的抑制及其對糖尿病大鼠血糖影響的實驗研究         10-09-02 10:22:00     作者：張枬，何學斌 魏守蓉    編輯：studa20【關鍵詞】  喇咕多糖 -淀粉酶活性 血糖    糖尿病是臨床常見病、多發(fā)病，并發(fā)癥、致殘率均較高，而且隨著全球老齡化趨勢的加劇，糖尿病的發(fā)病率還將逐年上升。植物提取物1，2降糖的研究已經(jīng)得到國內(nèi)外研究機構證實，且具有毒副

2、作用小、療效確切的優(yōu)勢。我們觀察了喇咕多糖在體外對-淀粉酶活性的抑制作用及其對糖尿病大鼠血糖的影響。1   材料與儀器1.1   喇咕多糖的制備3取喇咕殼，用水洗凈，于室溫下在56HCl中攪拌浸漬24 h，過濾，收集濾渣，水洗后在34NaOH液(加少量肥皂)中熱回流46 h，重復2次。濾餅經(jīng)水洗，干燥即得粗制甲殼質(zhì)。粗品在0.5高錳酸鉀中攪拌浸漬約1 h，水洗后在1的草酸中于6070攪拌3040min，水洗、干燥即得白色精制甲殼質(zhì)，將其投入50NaOH 140加熱2 h，離心，收集沉淀，水洗干燥即得白色喇咕殼聚糖。1.2   動物Wi

3、star種成年大鼠，體重170190g，雌雄各半,由同濟醫(yī)學院老年醫(yī)學研究所實驗動物中心提供。1.3   儀器、試劑-淀粉酶凍干粉（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，批號：F20021030）；麥芽糖（上海源聚生物科技有限公司，批號：030125）；3,5-二硝基水楊酸（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，批號：20030704）；阿卡波糖（中國北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司出品，批號：00102903）；D-860（甲苯磺丁脲，江蘇丹陽市藥業(yè)有限責任公司出品，批號：0021056）；四氧嘧啶（購自美國Sigma公司，批號：73K1626）；AU-400全自動生化分析儀（本奧林巴林公司出品

4、）；穩(wěn)捷型血糖儀（美國強生公司提供）。稱取3,5-二硝基水楊酸1.0 g，加入1 mmol·L-1氫氧化鈉溶液20 ml超聲處理30 min, 成乳白色混懸液，再加入50 ml蒸餾水,混勻即成黃色澄清液體，準確稱量30.0 g酒石酸鉀鈉加入，振蕩混勻，待酒石酸鉀鈉完全溶解后用蒸餾水定容至100 ml，蓋緊瓶蓋,勿使CO2 進入。2  方法2.1  樣品活性的測定7支試管編號，一支為對照管，另6支為測定管，對照管加入 0.2ml pH6.6 的0.2 mmol·L-1磷酸緩沖液,另6支試管分別加入濃度為0.001 6，0.008，0.04，0.2，1，5

5、mg·ml-1的喇咕多糖溶液（-淀粉酶及喇咕多糖溶液均用0.2 mmol·L-1 PH6.6的磷酸緩沖液配制）；7支試管依次加入0.2ml -淀粉酶溶液并及時混勻，各管同時放入37恒溫水浴箱，分別加入37預熱的淀粉液0.4ml，充分混勻立即放入37恒溫水浴保溫5 min，然后取出迅速加入0.8 ml的0.4mmol·L-1氫氧化鈉溶液終止酶活性。以上實驗分別設4組，將喇咕多糖與-淀粉酶的反應時間設為10，20，30，40 min，同時本底基數(shù)的測定為喇咕多糖與-淀粉酶反應時間定在10 min，反應后加入37預熱的磷酸緩沖液0.4 ml代替淀粉液，其他步驟同樣品的測

6、定。2.2  OD值的測定樣品及本底基數(shù)測定各管中溶液各1 ml，放入10ml刻度試管，再分別加入1 ml DNS試劑混勻，置沸水浴8 min后，室溫下冷卻15 min，用蒸餾水稀釋至10ml并混勻，用721分光光度計于520 nm 處測吸光度即OD值。抑制率（%）= 1-（樣品OD值-本底OD值）/ 對照管OD值。2.3  設陽性對照即測定阿卡波糖對-淀粉酶的抑制率阿卡波糖溶液的濃度及抑制率的測定過程，與喇咕多糖抑制率的測定過程相同并同時進行，阿卡波糖溶液與-淀粉酶反應時間定為25min，重復3次。2.4  喇咕多糖對四氧嘧啶糖尿病大鼠模型的降糖作用 

7、  按文獻4方法造模，正常Wistar大鼠禁食12 h，按50mg·kg-1體重劑量尾靜脈快速注射2.5 %四氧嘧啶生理鹽水溶液。造模注射后96h尾靜脈采血用強生穩(wěn)捷血糖儀測定空腹血糖（取血前禁食12h），血糖高于11.1mmol·L-1視為造模成功。將其隨機分為3組，每組11只，即造模組（Model）、喇咕多糖組（PP）、陽性對照組。另設正常對照組（Normal）不予造模注射。即日開始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)5 d。正常對照組和造模組給予生理鹽水，陽性對照組給予D-860 100mg·kg-1，喇咕多糖組給予喇咕多糖200mg·kg

8、-1，每組灌胃按體積均為每只2 ml/次。給藥5 d并禁食10 h后眼眶采血葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖。然后，造模組及正常對照組灌胃7.5%（2ml）的淀粉糊精；多糖組灌胃7.5%淀粉糊精-200 mg·kg-1喇咕多糖混合物（2 ml）；陽性對照組灌2 ml 7.5% 淀粉糊精及100 mg·kg-1劑量的D-860混合物。測定給淀粉后0.5，1，2 h的血糖值，采血及測定方法同空腹血糖。2.5   統(tǒng)計方法計量資料用±s表示，t檢驗。      10-09-02 10:22:00  

9、;   作者：張枬，何學斌 魏守蓉    編輯：studa203  結果3.1  喇咕多糖體外對-淀粉酶活性的抑制作用喇咕多糖10，20，30，40 min 4個時間段的量效曲線接近直線，呈劑量依賴性； 6個濃度組均于20 min時間段達最大抑制率，在30 min段抑制率下降，40 min稍回升，提示各濃度組存在相近的時效關系,且存在最佳作用時間。阿卡波糖的量效曲線也接近直線，并隨藥物濃度增加而遞增，最大抑制率70.9%。見圖12。3.2   喇咕多糖對四氧嘧啶糖尿病大鼠血糖水平的影響

10、四氧嘧啶糖尿病大鼠，多糖組治療后的空腹血糖值明顯低于造模組，差異有極顯著性意義（P0.01），多糖組的餐后2h血糖明顯低于造模組，差異有顯著性意義（P0.05）。多糖組的血糖水平與造模組相比均顯著降低（P0.01）。結果見表1和圖3。表1  喇咕多糖對糖尿病大鼠空腹及餐后血糖的影響（略）與模型組比較，*P0.01， *P0.05；n=114  討論    糖尿病的藥物治療分為兩類：胰島素治療及口服降糖藥物治療。但大多數(shù)藥物治療均有一定的副作用，患者難以堅持治療,因此探索新的降糖藥物勢在必行。淀粉酶抑制劑降血糖是20世紀70年代后興起的新的降血糖

11、思路。-葡萄糖苷酶抑制劑副作用較小，此類物質(zhì)可抑制消化道，尤其是十二指腸的淀粉酶活性，因而減少或延緩消化道淀粉水解為單糖，使單糖的吸收減少而降低血糖，所以對糖尿病病人餐后高血糖以及過食碳水化合物引起的脂肪增加有對抗作用。據(jù)國內(nèi)有關報道，一些多糖類化合物有體外抑制淀粉酶活性作用5，6。kobayashi k7篩選了40種生藥提取物對小鼠血漿中淀粉酶活性和餐后血糖的影響。這些天然物質(zhì)可抑制胃腸道中-淀粉酶的活性，有望改善糖尿病患者餐后的血糖升高。    甲殼素是一種天然直鏈狀酰胺類多糖，化學名為l,4-二乙酰胺基-2-脫氧-p-D-葡聚糖。殼聚糖是甲殼素的主要衍生物，

12、是由甲殼素經(jīng)脫乙?；蟮玫降囊环N高分子氨基多糖?；瘜W名稱為(1-4)2-氨基-2-脫氧-B-D-葡萄糖，或簡稱聚氨基葡萄糖。由于這種殼聚糖的大分子結構中存在大量氨基，從而大大改善了甲殼素的溶解性和化學活性，因此使它在醫(yī)療、營養(yǎng)和保健等方面具有廣泛的應用價值。近十年來國內(nèi)外的科學家都將它作為人體第六生命要素進行深入研究和開發(fā)。    本研究顯示，喇咕多糖在體外對-淀粉酶活性具有較強的抑制作用，且呈劑量依賴性，0.001 6（5 mg·ml-1）喇咕多糖溶液抑制率的量效曲線近似直線，其抑制率相當于同等濃度阿卡波糖抑制作用的50%左右。喇咕多糖抑制率的時效曲線

13、提示喇咕多糖對-淀粉酶的抑制作用可能是可逆的，并可能存在時間依賴性，即存在最佳作用時間。    動物實驗顯示，喇咕多糖可顯著降低四氧嘧啶高血糖大鼠的空腹血糖及餐后血糖，其降低空腹血糖水平與D-860（甲苯磺丁脲）相當，其降低餐后2h血糖效果明顯優(yōu)于D-860；且對正常大鼠血糖水平無顯著影響，表明喇咕多糖可降低四氧嘧啶大鼠的空腹血糖及改善餐后血糖過度升高，而不會導致低血糖，其降血糖機制可能與其抑制-淀粉酶活性、延緩碳水化合物在腸道的吸收有關，其機理有待進一步研究。【參考文獻】  1徐仲溪,王坤波.茶多糖化學及生物活性的研究J.茶葉科學,2004,24（2）：75.2付海平,黃懷生,胡孟陽，等. 茶多糖生物活性及提取純化的研究進展J.茶葉通訊,2006,33（2）：24.3侯惠民甲殼質(zhì) 一種具有廣泛應用價值的新材料J.醫(yī)藥工業(yè)，1988，19(7)：328.4張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法M.北京：北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社, 1998：982.5劉華珍,江紅磊,楊勁松.微生物產(chǎn)生的淀粉酶抑制劑研究·發(fā)酵、