登革病毒E蛋白抗原基因肌肉注射誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的初步研究

1、登革病毒E蛋白抗原基因肌肉注射誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的初步研究    登革病毒E蛋白抗原基因肌肉注射誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的初步研究    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2000年第12期第16卷 分子與細(xì)胞免疫學(xué)    作者：洪幫興江麗芳張欣郭輝玉    單位：洪幫興（中山醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，廣州510089）；江麗芳 張欣 郭輝玉（廣東省深圳市福田衛(wèi)生防疫站，深圳518033）    關(guān)鍵詞: 登革病毒；基因免疫；

2、免疫應(yīng)答    摘要目的：研究登革病毒E基因免疫的可行性。方法：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的E基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞，SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)檢測(cè)E基因的體外表達(dá)。然后將該重組真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)其誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答水平。結(jié)果：重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E在小鼠體內(nèi)誘發(fā)一定水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。結(jié)論：登革病毒E基因免疫可誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，為登革病毒疫苗的研制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。    中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)R373.33&#

3、160;   Immunogenicity of dengue virus E antigen gene in BALB/c mice    HONG Bang-XingJIANG Li-FangZHANG Xin    （Department of Microbiology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089）    AbstractObjective:To s

4、tudy the possibility of dengue virus E gene vaccine.Methods:The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3-E was first transfected into NIH3T3 cells by lipofectin.SDS-PAGE and Western blotting analyzed the expression of E gene.Then the recombinant plasmid was intramuscularly injected to BALB/c

5、 mice,and the specific humoral and cellular immunity were tested.Results:The recombinant plasmid DNA could induce specific immune reactions and the immune response could last a long time.Conclusion:The dengue virus E gene vaccine could induce specific immune reaction,which might have provided some m

6、aterial and new experimential data for the further study of dengue vaccines.    Key wordsDengue virusGene vaccineImmune response    基因免疫(又稱(chēng)核酸疫苗)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新生物技術(shù)，它克服了傳統(tǒng)疫苗研制的繁瑣過(guò)程等缺點(diǎn)，為傳染病疫苗的研制帶來(lái)了新的希望和應(yīng)用前景1。登革病毒是一種蚊媒急性傳染病病原體，他所引起的登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征目前尚無(wú)特異的預(yù)防措施。Koche

7、l等首先對(duì)登革病毒的核酸免疫作了探索性的研究，取得了可喜的結(jié)果2，3。本研究選取針對(duì)登革病毒感染及保護(hù)性免疫應(yīng)答中起重要作用的E蛋白，將構(gòu)建的含登革病毒E基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E免疫BALB/c小鼠，研究該基因在小鼠中的免疫應(yīng)答情況。    1材料與方法    1.1重組真核表達(dá)質(zhì)粒重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E(6.8kb，含登革病毒全長(zhǎng)E基因)由本室構(gòu)建。    1.2細(xì)胞和動(dòng)物小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞由本室保存，BALB/c小鼠由中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中

8、心提供。    1.3試劑Lipofectin脂質(zhì)體購(gòu)自Promega公司，F(xiàn)ITC-CD3/PE-CD4和FITC-CD3/PE-CD8單抗購(gòu)自基因有限公司，HRP-羊抗兔IgG和HRP-免疫鼠IgG購(gòu)自Sigma公司，兔抗登革2型病毒多克隆抗體和登革2型病毒單抗由本室自行制備，3H-TdR為中科院原子能研究所產(chǎn)品。    1.4E蛋白抗原基因的表達(dá)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E經(jīng)酚、氯仿/異戊醇(241)抽提純化后備用，NIH3T3細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液37培養(yǎng)至50%80%融合，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

9、法將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，空質(zhì)粒作轉(zhuǎn)染對(duì)照，NIH3T3細(xì)胞作空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染16 h后用含600 g/ml G418的DMEM培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)，3 d后更換含250 g/ml G418的DMEM培養(yǎng)液維持篩選直至陽(yáng)性細(xì)胞克隆的形成，SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)蛋白。    1.5小鼠免疫按常規(guī)方法大量抽提重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E和空載體pcDNA3。健康雄性BALB/c小鼠，6周齡，每組5只。DNA溶液注射于小鼠右下肢股四頭肌，注射劑量分別為100 g/只和200 g/只。實(shí)驗(yàn)共分為pcDNA3組、pcD

10、NA3-E組和空白對(duì)照組(注射PBS)。每隔2 w加強(qiáng)免疫1次，共3次。    1.6ELISA法檢測(cè)特異性抗體登革病毒抗原制備參見(jiàn)文獻(xiàn)4。小鼠免疫前及末次免疫后第2周始每隔2 w自小鼠尾靜脈采血50 l，分離血清。鼠抗血清自1300始倍比稀釋?zhuān)總€(gè)血清稀釋4孔，HRP-兔抗鼠IgG 11 000稀釋。鼠抗登革2型病毒單抗作陽(yáng)性對(duì)照。    1.7小鼠脾臟T細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的檢測(cè)末次免疫后2 w隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組BALB/c小鼠各4只，制備脾細(xì)胞懸液，用Hanks液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至106 ml-1，分別加入

11、FITC-CD3/PE-CD4和FITC-CD3/PE-CD8單抗，混勻后室溫放置30 min，用流式細(xì)胞儀計(jì)算CD3+CD4+T細(xì)胞亞群和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的百分率。    1.8淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)?zāi)┐蚊庖吆? w，隨機(jī)取試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠各3只，取出脾臟，加入3 ml不含小牛血清的1640液，磨碎后轉(zhuǎn)入已有2 ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心5 min，取中間乳白色液體，用5倍以上體積的1640液洗3次，棄上清，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106 ml-1，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100

12、l，試驗(yàn)孔加100 l PHA(10 g)，對(duì)照組加1640培養(yǎng)液，375%CO2培養(yǎng)70 h。培養(yǎng)終止前24 h加入3H-TdR 1 Ci/孔，用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，以液閃儀測(cè)定cpm值；MTT法測(cè)定時(shí)于培養(yǎng)終止前46 h，棄上清，再加5 mg/ml MTT 10 l，混勻再培養(yǎng)。細(xì)胞終止培養(yǎng)后加酸化異丙醇0.1 ml，混勻靜置數(shù)分鐘，待細(xì)胞代謝MTT形成紫藍(lán)色顆粒后，用酶標(biāo)光度計(jì)于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。    2結(jié)果    2.1E基因的真核表達(dá)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NI

13、H3T3細(xì)胞，用含G418的DMEM培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)20 d后，有陽(yáng)性細(xì)胞克隆的形成，轉(zhuǎn)染對(duì)照及空白對(duì)照的NIH3T3細(xì)胞則全部死亡。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)均證實(shí)在分子量60 kD處有特異蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖1。    2.2pcDNA3-E免疫小鼠抗體滴度的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠于末次免疫后210 w取尾靜脈血作ELISA檢測(cè)其抗體滴度。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠大多數(shù)抗體滴度為在11 600左右，而對(duì)照組小鼠抗體滴度均小于1300，用2組隨機(jī)設(shè)計(jì)資料均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，差異有高度顯著性(P0.01)，而不同劑量組之間差異不顯著(P0.05)，見(jiàn)圖2。&#

14、160;   2.3小鼠脾臟T細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的檢測(cè)末次免疫后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組BALB/c小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)雙色熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+CD4+T細(xì)胞亞群和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的百分率。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組CD3+CD4+T細(xì)胞亞群和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的百分率明顯高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組CD3+CD4+T細(xì)胞亞群和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的比值也高于對(duì)照組。用兩組隨機(jī)設(shè)計(jì)資料均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，差異有顯著性(P0.05)，而不同劑量組之間差異不顯著(P0.05)，見(jiàn)圖3。     

15、;   圖1SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)表達(dá)蛋白    Fig.1Detection of expression protein by SDS-PAGE and Western blotting    Note:M:protein marker;1:NIH3T3 cells;2:NIH3T3 cells transfected by pcDNA3-E plasmid;3:NIH3T3 cells transfected by pcDNA3 plasmid;4:

16、Western blotting of NIH3T3 cells transfected by pcDNA3-E plasmid    圖2重組質(zhì)粒pcDNA3-E免疫后不同時(shí)間小鼠體內(nèi)抗體水平    Fig.2Antibody level of mice after immunization with recombinant plasmid pcDNA3-E    圖3重組質(zhì)粒pcDNA3-E免疫后(8 w)對(duì)T淋巴細(xì)胞的影響    

17、Fig.3The results of T lymphocyte counts after immunization with recombinant plasmid pcDNA3-E    表1重組質(zhì)粒pcDNA3-E免疫后(8 w)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響    Tab.1The activation of lymphocyte after immunization with recombinant plasmid pcDNA3-E      

18、0;     Group    cpmOD570            (±s,n=3)            PBS    992.35±105.76    0.17&

19、#177;0.02            pcDNA3(100 g)    913.41±113.87    0.18±0.01            pcDNA3(200 g)    1 012.03±156

20、.55    0.19±0.02            pcDNA3-E(100 g)    2 568.79±185.63    0.52±0.031)            pcDNA3-E(200 g)&

21、#160;   2 293.13±212.98    0.47±0.021)            note:1)P0.05,compared with PBS group2.4淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)?zāi)┐蚊庖吆笕≡囼?yàn)組和對(duì)照組小鼠的脾臟，分離淋巴細(xì)胞作淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組cpm值和OD570值明顯高于對(duì)照組，見(jiàn)表1，用兩組隨機(jī)設(shè)計(jì)資料均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，差異有顯著性(P0.05)，

22、而不同劑量組之間差異不顯著(P0.05)。    3討論    核酸疫苗有病毒亞單位疫苗的安全性及減毒活疫苗誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的高效性，成為疫苗研究的新方向5。它的作用機(jī)理是將帶有目的蛋白編碼基因和表達(dá)調(diào)控序列的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入機(jī)體組織后，在機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病原體的蛋白抗原，加工后形成的多肽抗原與宿主細(xì)胞MHC類(lèi)和MHC類(lèi)分子結(jié)合，并被遞呈給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng)，從而誘發(fā)特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答6。它的優(yōu)點(diǎn)是抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與自然感染相似，這一特點(diǎn)對(duì)構(gòu)成依賴(lài)性抗原表位誘發(fā)保護(hù)免疫尤為重要7。Megret等通過(guò)合成肽結(jié)

23、合McAb分析E蛋白上的抗原表位，發(fā)現(xiàn)非中和性抗體對(duì)應(yīng)的表位呈線(xiàn)性，而中和抗體其對(duì)應(yīng)的表位呈構(gòu)象依賴(lài)性8。因此選取E基因作為研制登革核酸疫苗的靶基因，是值得探索的途徑之一。本研究首先將含登革病毒E基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠NIH3T3細(xì)胞，SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)均檢測(cè)到E蛋白的體外真核表達(dá)，這為該質(zhì)粒的核酸免疫提供了體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。而后將該質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠，無(wú)論是體液免疫還是細(xì)胞免疫，都有較高的免疫應(yīng)答，高滴度抗體水平持續(xù)至免疫后10 w仍保持不變。在細(xì)胞免疫方面，基因免疫組小鼠的T淋巴細(xì)胞百分率和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均高于對(duì)照組，這表明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-E

24、在小鼠體內(nèi)誘發(fā)了有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間、免疫效應(yīng)及外源基因是否與宿主基因組整合等有待進(jìn)一步研究。    廣東省自然科學(xué)基金資助課題(5221100203017)    作者簡(jiǎn)介：洪幫興，男，25歲，碩士，主要研究分子病毒學(xué)；指導(dǎo)教師：江麗芳，女，46歲，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事登革病毒致病與免疫研究    參考文獻(xiàn)    1，Wang B,Ugen K E，Srikantan V. Gene inoc

25、ulation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl Sci USA,1993;90(9):4156    2，Kochel T,Wu S J,Raviprakash K.Inoculation of plasmids expressing the dengue 2 envelope gene elicit neutralizing antibodies in mice.Vaccine,1997；15(5):547    3，Kochel T,Porter K R，Raviprakash K.Protective efficacy of a dengue 2 DNA vaccine in mice and the effect of CpG immune stimulatory motifs on antibody responses.Arch Virol,1998；143(5):997