血清蛋白質(zhì)譜模型對胃腺癌診斷的應(yīng)用性研究

1、血清蛋白質(zhì)譜模型對胃腺癌診斷的應(yīng)用性研究         08-04-25 09:42:00     作者：梁勇劉池波李繼承    編輯：studa20【摘要】  目的探討用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選胃腺癌患者血清蛋白質(zhì)表達譜,尋找血清中的標(biāo)志性蛋白。方法采用蛋白質(zhì)生物芯片表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI）技術(shù),運用SAX2 (Strong Anionic Exchanger)蛋白質(zhì)芯片檢測胃腺癌患者、胃炎患者和健康者血清

2、,建立診斷模型,然后進行單盲模型驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5910Da、5084Da和8691Da的三個蛋白質(zhì)荷比峰(M/Z)在胃腺癌和健康組比較中具有顯著性差異。5910Da、6440Da的兩個蛋白質(zhì)荷比峰(M/Z)在胃腺癌和胃炎組中比較具有顯著性差異。結(jié)論建立了胃腺癌的血清蛋白指紋質(zhì)譜，為以后的胃癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了一定的基礎(chǔ)，建立了以5910Da、5084Da、8691Da和6440Da四個蛋白質(zhì)峰為模型區(qū)分胃腺癌與非胃腺癌的血清蛋白表達質(zhì)譜診斷模型，為胃腺癌的臨床診斷提供了一條嶄新的途徑和方法。 【關(guān)鍵詞】  表面增強激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜蛋白質(zhì)芯片生物標(biāo)記胃腺癌Applicati

3、on of Serum Proteomic Patterns for Detection of Gastric Adenocarcinoma    serum protein profiling ofastricadenocarcinoma by surface-enhancedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) to discovering the discriminalory proteins.MethodsThe diagnosis model

4、was established by SELDI technique with SAX2 chip to detect the serum of patients with gastric adenocarcinoma, gastricism and healthy persons, and tested by single-blind model.ResultsThree specific protein fingerprint biomarkers massed at 5910, 5084, 8691 between gastric adenocarcinoma group and con

5、trol group with statistical significance. Two specific protein fingerprint biomarkers massed at 5910, 6440 between gastric adenocarcinoma group and gastricism group with statistical significance.Conclusions A gastric adenocarcinoma protein fingerprint and a foundation for later study of gastric canc

6、er proteomics is developed. The diagnostic model of the protein profiling(5910Da, 5084Da, 8691Da, 6440Da) for distinguishing gastric adenocarcinoma from non-gastric adenocarcinoma is established to aid a new approach in clinical diagnosis for gastric adenocarcinoma.     

7、0; 2.Institute of Cell Biology, Zhejiang University, Hangzhou 310031,China)Abstract: Purpose Toscreen out    胃腺癌是常見的癌腫之一，占全部惡性腫瘤的第三位，占消化道惡性腫瘤之首,而且近年來發(fā)病有明顯年輕化趨勢。相當(dāng)多的胃腺癌患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期，我國每年死于胃腺癌約16萬人。目前已有的腫瘤標(biāo)志物單項指標(biāo)檢測胃腺癌的靈敏度僅為18%40%，聯(lián)合應(yīng)用的結(jié)果雖然可達60%80%，但假陽性率較高，難以用于早期診斷。因此，尋求早期診斷胃腺癌的特異方法是目前臨床亟待解

8、決的難題。我們利用表面加強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜（surface?鄄enhanced laser desorption and ionisation，SELDI）技術(shù)，對胃腺癌患者與正常人和胃炎患者血清中的蛋白質(zhì)進行對比分析，篩選可用于臨床胃腺癌早期診斷的特異性生物標(biāo)記物。    1 材料與方法    1.1 血清樣品    所有病人血清樣品均為2003年8月2004年6月臺州市立醫(yī)院手術(shù)后病理檢查確診為胃腺癌患者的術(shù)前抽檢標(biāo)本，對照樣品來自經(jīng)健康查體正常的健康志愿者及經(jīng)病理檢查為活動性胃炎患者的血清

9、。全血采集在10ml血清分離管中，4 000r/min離心10min。取30l血清分裝在0.5ml離心管中，于-80冰箱保存。33例胃腺癌,其中男性22例，女性11例，平均年齡56.5歲(4571歲)；31例健康志愿者其中男性20例，女性11例，平均年齡63歲(4370歲)，30例胃炎患者其中男性20例，女性10例，平均年齡58.9歲(4670歲)。另盲法試驗組36例（15例胃腺癌、10例健康志愿者、11例胃炎患者）。    1.2 儀器和試劑    美國賽弗吉公司(Ciphergen Biosystems, Inc.)生產(chǎn)的表面增強

10、激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜儀(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization?鄄time OF Flight?鄄Mass Spectrometry, SELDI?鄄TOF?鄄MS)及該公司配套的蛋白質(zhì)芯片SAX2 (Strong Anionic Exchanger,強陰離子交換) 芯片。    主要試劑：尿素、乙腈、三氟乙酸等均購自Sigma公司，SPA(Sinapinic Acid)購自CiphergenBiosystems公司。U9緩沖液(9M Urea, 2% CHAPS,1%DTT)，U1緩沖液(用50mM Tri

11、s?鄄HCl緩沖液，9倍稀釋U9緩沖液)，SAX2緩沖液(100mM Tris?鄄HCl pH9.0)。    1.3 方 法    血清樣品準(zhǔn)備：融解冰凍血清并于4離心20 000轉(zhuǎn)，10min。每個樣品取20l血清，分別置于1.5ml離心管中。加30lU9緩沖液于每一試管，于4振搖20min，每管加入100lU1緩沖液，蓋嚴(yán)并于4震蕩30min。    芯片平衡：在芯片每個芯池中加入150l相應(yīng)的結(jié)合/洗脫緩沖液，置于振蕩器上，室溫孵育5min后除去緩沖液，重復(fù)上述操作1次。  &

12、#160; 芯片與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)：從上述蛋白變性后的血清樣品中取50l樣品，加入200l相應(yīng)的結(jié)合/洗脫緩沖液，使最后上樣的樣品總共稀釋約40倍，置于振蕩器上，室溫孵育60min后除去樣品。    芯片沖洗：每孔中加入150l相應(yīng)的結(jié)合/洗脫緩沖液，置于振蕩器上室溫孵育5min，除去緩沖液，重復(fù)上述操作2次，最后芯片用相應(yīng)pH的1mM HEPES淋洗。去除水后，晾干芯片。    加能量吸收分子（energy absorbing Molecule，EAM）：取出芯片，在Sinapinic Acid中加入200l乙氰，200l 1TFA，充分振蕩5min使溶解，離心1min；每孔分2次加Sinapinic Acid（0.5l/次），兩次之間允許各孔風(fēng)干。    讀